胡 文，霍孔林，宋星星，張 鑫，張多妮，羅榮榮，徐文鎬，李 珣

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004)

促性腺激素抑制激素(GnIH)是動(dòng)物體內(nèi)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，由Tsutsui等[1]于2000年首次在鵪鶉的下丘腦中分離得到，其可通過抑制促性腺激素(GnRH)的合成和釋放而影響性腺的發(fā)育，同時(shí)調(diào)控動(dòng)物的生殖。后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)了一種與GnIH互為同源的具有酰胺結(jié)構(gòu)的神經(jīng)肽，研究人員將其命名為RF酰胺相關(guān)肽3(RFRP-3)[2]。GnIH在動(dòng)物體內(nèi)生殖系統(tǒng)廣泛分布和表達(dá)。Zhang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，睪丸和卵巢中均有GnIH的表達(dá)，說明GnIH作為一種神經(jīng)肽參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)生殖系統(tǒng)的生理活動(dòng)。Muoz-Cueto等[4]研究發(fā)現(xiàn)，GnIH會(huì)影響動(dòng)物的攝食；Ubuka等[5-6]研究表明，GnIH對(duì)動(dòng)物的性行為和能量代謝等方面都有影響。Ubuka等[7]進(jìn)一步證實(shí)了GnIH還影響動(dòng)物性腺的生長(zhǎng)、發(fā)育。Huo等[8]首次證實(shí)了GnIH參與大鼠的糖代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控并導(dǎo)致葡萄糖耐量受損。目前，研究已初步驗(yàn)證了GnIH參與了大鼠的糖代謝并影響了其生殖功能，但是對(duì)于GnIH在其中的作用機(jī)制尚未進(jìn)一步闡述。因此，本研究通過對(duì)SD大鼠腹腔注射不同劑量的GnIH，使用HE染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)更深入地探索GnIH對(duì)SD大鼠性腺生殖功能和糖代謝的影響，并分析生殖功能和糖代謝之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步探索GnIH在動(dòng)物生殖和能量代謝中的作用機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

大鼠GnIH(048-46)購(gòu)自Phoenix Pharmaceuticals公司；Trizol、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、PCR Master Mix及2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。電子分析天平(BSM-520.3)購(gòu)自上海卓精電子科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Light Cycler 96)購(gòu)自Roche公司；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2235)購(gòu)自Leica公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理、分組及處理

5周齡SD大鼠36只(雌雄各半)，體重為(190±10)g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SD大鼠采用單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境控制在統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)下(溫度：24 ℃±2 ℃，濕度：50%±10%，光照控制：12L+12D，每天早上07:00開燈)。適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后，參考Huo等[8]的方法將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(0.9%生理鹽水)、1 μg/100 μL GnIH(Ⅰ組)、10 μg/100 μL GnIH(Ⅱ組)，每組12只，雌雄各半。每天07：00和19：00注射生理鹽水或GnIH，200 μL/次，連續(xù)注射14 d。14 d后，先稱量體重，再麻醉[9]處死，分別取出卵巢和睪丸并稱重，將一部分樣品置于4%多聚甲醛溶液中固定，一部分放入液氮速凍處理后移入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 肥胖程度 稱量SD大鼠初始體重和處死前體重，肥胖程度=終體重-初始重。

1.3.2 卵體比和睪體比 按如下公式計(jì)算大鼠的卵體比和睪體比[10]。

卵體比=卵巢重量/體重

睪體比=睪丸重量/體重

1.3.3 卵巢和睪丸組織切片 取4%多聚甲醛溶液中固定的卵巢和睪丸樣品，制作石蠟切片，HE染色，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。

1.3.4 發(fā)情周期 采用陰道涂片法[11]，連續(xù)14 d在注射時(shí)用棉簽沾取大鼠的陰道分泌物(每天07：00和19：00各1次)，將其均勻地涂抹在含有0.9%生理鹽水的載玻片上，自然晾干后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察。根據(jù)陰道涂片的細(xì)胞變化特點(diǎn)來區(qū)分不同的發(fā)情周期階段，分別為發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和發(fā)情間期4個(gè)階段組成。具體判斷方法如下：發(fā)情前期主要為上皮細(xì)胞；發(fā)情期主要為無核多邊形細(xì)胞，還有少量上皮細(xì)胞；發(fā)情后期主要特征是白細(xì)胞大量出現(xiàn)；發(fā)情間期上皮細(xì)胞、無核多邊形細(xì)胞、白細(xì)胞均可見。

1.3.5 精子活力 處死大鼠后，立即取出附睪，將附睪內(nèi)的精子用移液槍吸出，將精子放入滴有0.9%生理鹽水的載玻片上，小心吹打混勻，蓋上蓋玻片后，顯微鏡下觀察。根據(jù)顯微鏡下活躍精子與全部精子的百分比判斷各組精子的活力[12]。

精子活力(%)=活躍精子數(shù)/總精子數(shù)×100%

1.3.6 糖代謝及炎癥相關(guān)基因的檢測(cè) 按照Trizol法提取各組卵巢和睪丸組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中胰島素受體(IR)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-1β)和β-actin基因的序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物均由深圳華大基因科技有限公司合成。引物具體信息見表1。以β-actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。 PCR反應(yīng)體系20 μL：TaqDNA聚合酶10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s,共38個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算所檢測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

1.4 SD大鼠性腺生殖功能與糖代謝之間的相關(guān)性分析

通過SPSS 22.0軟件分析腹腔注射不同濃度GnIH組的SD大鼠性腺生殖功能(發(fā)情周期和精子活力)與糖代謝(GLUT4與IR基因的表達(dá))之間的皮爾遜指數(shù)和P值[13-14]。將雌性SD大鼠性腺中的卵體比、發(fā)情周期的指標(biāo)與糖代謝相關(guān)因子IR、GLUT4基因的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析；將雄性SD大鼠性腺中的睪體比、精子活力的指標(biāo)與糖代謝相關(guān)因子IR、GLUT4基因的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。皮爾遜指數(shù)的范圍在-1到1之間，通過數(shù)值的正負(fù)判斷兩者為正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)，P值的大小判斷相關(guān)性是否顯著。P<0.05為顯著相關(guān)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 GnIH對(duì)大鼠肥胖程度的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，Ⅰ組雌性大鼠的肥胖程度顯著升高(P<0.05)(圖1A)，Ⅱ組雄性大鼠肥胖程度顯著升高(P<0.05)(圖1B)。

肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖6～9同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as fig.6-fig.9圖1 各組雌(A)、雄(B)大鼠肥胖程度Fig.1 Obesity degree of female (A) and male (B) rats in each group

2.2 GnIH對(duì)大鼠性腺表觀指標(biāo)的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，Ⅰ、Ⅱ組大鼠卵巢的大小均顯著增加(P<0.05)，Ⅱ組大鼠卵巢重量和卵體比均顯著增加(P<0.05),睪丸重量和睪體比均顯著降低(P<0.05)，睪丸的大小沒有顯著變化(P>0.05)。

表2 各組大鼠性腺大小及性腺/體重

2.3 GnIH對(duì)大鼠性腺形態(tài)學(xué)的影響

2.3.1 GnIH對(duì)雌性大鼠卵巢組織形態(tài)的影響 由圖2可知，與對(duì)照組相比，Ⅱ組大鼠卵巢中的卵泡呈囊性擴(kuò)張，顆粒細(xì)胞層減少，卵泡腔增大。Ⅰ組無明顯變化。

2.3.2 GnIH對(duì)雄性大鼠睪丸的影響 由圖3可知，與對(duì)照組比較，Ⅰ組大鼠生精小管中出現(xiàn)“空泡樣”改變，Ⅱ組睪丸切片“空泡樣”改變比Ⅰ組更明顯，并且Ⅰ與Ⅱ組都出現(xiàn)生精細(xì)胞排列紊亂、層次減少的變化。

□，局部放大。圖3同□，Local amplification.The same as fig.3圖2 各組雌性大鼠卵巢組織形態(tài)Fig.2 Ovarian tissue morphology of female rats in each group

圖3 各組雄性SD大鼠睪丸組織形態(tài)Fig.3 Testicular tissue morphology of male rats in each group

2.4 GnIH對(duì)大鼠生殖功能的影響

2.4.1 GnIH對(duì)雌性大鼠發(fā)情周期的影響 發(fā)情周期的不同階段可通過顯微鏡下陰道涂片(圖4)細(xì)胞的種類進(jìn)行推斷。由表3可知，與對(duì)照組相比，Ⅱ組大鼠發(fā)情前期的持續(xù)時(shí)間顯著增加(P<0.05)，而發(fā)情期、發(fā)情后期以及間情期無明顯變化(P>0.05)。

A，發(fā)情前期；B，發(fā)情期；C，發(fā)情后期；D，發(fā)情間期A,Proestrus;B,Estrus;C,Metestrus;D,Diestrus圖4 發(fā)情周期不同階段的判斷(100×)Fig.4 Judgement of each phase of estrous cycle (100×)

表3 各組雌性大鼠發(fā)情周期各階段的持續(xù)時(shí)間

2.4.2 GnIH對(duì)雄性大鼠精子活力的影響 由表4可知，與對(duì)照組相比，Ⅱ組總精子數(shù)量顯著下降(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ組活躍精子數(shù)均顯著下降(P<0.05)，Ⅱ組活躍精子百分比顯著降低(P<0.05)。由圖5可知，與對(duì)照組相比，Ⅰ、Ⅱ組大鼠精子均未發(fā)現(xiàn)畸形、卷曲等形態(tài)變化。

表4 各組雄性SD大鼠的精子活力

A～C，分別為對(duì)照組、Ⅰ和Ⅱ組A-C,Control,Ⅰ and Ⅱ groups,respectively圖5 各組SD大鼠精子形態(tài)(100×)Fig.5 Sperm morphology of rats in each group (100×)

2.5 GnIH對(duì)大鼠性腺糖代謝的影響

由圖6可知，與對(duì)照組相比，Ⅱ組雌性大鼠IR基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)、Ⅰ、Ⅱ組GLUT4基因表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)；Ⅰ、Ⅱ組雄性大鼠GLUT4基因的表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01,圖7)，而Ⅰ、Ⅱ組IR基因表達(dá)量雖有下降，但均無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 GnIH對(duì)大鼠性腺炎癥反應(yīng)的影響

由圖8可知，與對(duì)照組相比，Ⅰ組雌性大鼠卵巢中TNF-α和IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，Ⅱ組TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；由圖9可知，與對(duì)照組相比，Ⅱ組雄性大鼠TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，Ⅰ組IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

圖6 各組雌性大鼠卵巢中IR(A)和GLUT4(B)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative expression of IR (A) and GLUT4 (B) genes in ovaries of female rats in each group

圖7 各組雄性SD大鼠睪丸中IR(A)和GLUT4(B)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 The relative expression of IR (A) and GLUT4 (B) genes in testis of male rats in each group

圖8 各組雌性大鼠卵巢中TNF-α(A)和IL-1β(B)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 The relative expression of TNF-α (A) and IL-1β (B) genes in ovaries of female rats in each group

圖9 各組雄性大鼠睪丸中TNF-α(A)和IL-1β(B)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 The relative expression of TNF-α (A) and IL-1β (B) genes in testis of male rats in each group

2.7 SD大鼠性腺生殖功能相關(guān)指標(biāo)與糖代謝相關(guān)基因的相關(guān)性分析

由表5可知，GnIH處理后，大鼠的卵體比與GLUT4基因的表達(dá)水平呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與IR基因的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；卵巢的發(fā)情周期與GLUT4基因的表達(dá)水平呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與IR基因的表達(dá)水平無顯著相關(guān)性(P>0.05)；大鼠睪體比與GLUT4基因的表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；大鼠精子活力與GLUT4基因的表達(dá)水平均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);大鼠睪體比、精子活力與IR基因無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表5 大鼠性腺生殖功能相關(guān)指標(biāo)與糖代謝的相關(guān)性分析

3 討 論

GnIH作為廣泛分布在動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，能夠刺激SD大鼠的食欲而增加其體重，如Tachibana等[15]研究發(fā)現(xiàn)，GnIH可有效地刺激SD大鼠的進(jìn)食量；Huo等[8]研究發(fā)現(xiàn)，GnIH通過增加大鼠的食欲而增加體重。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射10 μg/100 μL GnIH后雌雄SD大鼠的體重均增加，且雌性SD大鼠的卵體比增加，雄性SD大鼠的睪體比下降，說明GnIH可能使SD大鼠的性腺發(fā)生生理性變化。HE染色結(jié)果顯示，10 μg/100 μL GnIH組卵巢的卵泡發(fā)生囊性擴(kuò)張，顆粒細(xì)胞層減少，卵泡腔增大；10 μg/100 μL GnIH組睪丸的生精小管有“空泡樣”改變，并且生精細(xì)胞排列紊亂、層次減少，說明腹腔注射GnIH抑制SD大鼠性腺的發(fā)育。Johnson等[16]研究發(fā)現(xiàn)，GnIH能夠抑制大鼠促黃體素(LH)的分泌從而影響性腺的功能；Singh等[17]研究發(fā)現(xiàn)，RFRP-3能抑制卵巢孕酮的合成從而抑制卵巢的功能。RFRP3/GPR147信號(hào)通路參與雌性大鼠青春期的發(fā)育和性成熟的過程[18]。GnIH神經(jīng)元投射到下丘腦區(qū)域和細(xì)胞參與生殖功能[19]。本研究結(jié)果顯示，雌性SD大鼠的發(fā)情周期紊亂，雄性SD大鼠的精子活力下降，說明GnIH對(duì)大鼠的生殖功能有抑制作用，具體表現(xiàn)為抑制雌性的排卵和雄性的精子活力，說明GnIH能直接作用于SD大鼠的性腺?gòu)亩种撇G丸或卵巢的活力。

隨著研究的深入，Arble等[20]研究發(fā)現(xiàn)，GnIH參與了能量代謝的過程。有研究表明，肥胖大鼠下丘腦-垂體-性腺軸神經(jīng)調(diào)控中樞的代謝水平整體處于抑制狀態(tài)，從而影響糖代謝在體內(nèi)的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。在外源GnIH[21]作用下，GLUT4基因在卵巢和睪丸中的表達(dá)下降。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μg/100 μL GnIH組雌性SD大鼠卵巢中IR基因表達(dá)水平顯著降低，1、10 μg/100 μL GnIH組雌雄性SD大鼠睪丸中GLUT4基因的表達(dá)量均極顯著降低，說明腹腔注射GnIH使SD大鼠性腺的糖代謝功能紊亂，與上述試驗(yàn)結(jié)果一致。此外，張多妮等[22]研究顯示，腹腔注射RFRP-3后大鼠脾臟內(nèi)的TNF-α和IL-1β基因的表達(dá)量增高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射GnIH后，雌雄大鼠性腺中TNF-α和IL-1β基因的表達(dá)水平均升高，說明大鼠性腺發(fā)生了炎性反應(yīng)。Chabrolle等[23]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢內(nèi)葡萄糖濃度的變化會(huì)影響卵巢功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雌性大鼠的卵體比、與糖代謝相關(guān)因子IR、GLUT4基因的表達(dá)水平呈極顯著強(qiáng)相關(guān)，發(fā)情周期與GLUT4基因的表達(dá)水平呈極顯著負(fù)相關(guān)，雄性大鼠睪體比、精子活力指標(biāo)與糖代謝相關(guān)因子GLUT4基因的表達(dá)水平呈顯著或極顯著正相關(guān)，說明GnIH參與調(diào)控雌雄SD大鼠性腺的生殖功能與糖代謝過程，推測(cè)GnIH在這兩者中間擔(dān)任“信使”的功能，可作為它們之間的聯(lián)絡(luò)因子。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，腹腔注射10 μg/100 μL GnIH后，大鼠體重增加，卵泡發(fā)生囊性擴(kuò)張，生精小管有空泡樣改變，發(fā)情周期紊亂，精子活力降低，性腺中糖代謝基因IR、GLUT4表達(dá)量除睪丸中IR基因表達(dá)無變化，其他均下降，炎癥相關(guān)基因TNF-α和IL-1β的表達(dá)量均增加；除卵體比與IR基因有強(qiáng)正相關(guān)性之外，雌雄大鼠性腺的生殖功能(卵體比、發(fā)情周期、睪體比、精子活力)與糖代謝基因GLUT4之間均有強(qiáng)相關(guān)性。說明腹腔注射GnIH不僅能夠抑制SD大鼠的生殖功能，導(dǎo)致糖代謝功能紊亂，而且GnIH可能參與性腺生殖功能和糖代謝之間的交叉對(duì)話，作為它們之間的一種新的聯(lián)絡(luò)因子而參與整個(gè)過程。