張 強(qiáng)，洛桑頓珠，巴桑旺堆，彭陽洋，俄廣鑫，尼瑪次仁，索朗多吉，巴 多，旦 巴，鮮莉莉，旦巴加參，支 張，平措占堆

(1.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850009；3.西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 400417；4.西藏阿里地區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，阿里 859000；5.西藏阿里改則縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，阿里 859200)

牦牛主要分布在以青藏高原為中心的海拔3 000 m以上的高山、亞高山地區(qū)，是具有優(yōu)秀高原適應(yīng)能力的珍貴地方家畜品種。中國是世界范圍內(nèi)擁有牦牛種群數(shù)量最多的國家，據(jù)2011年研究報道，中國牦牛種群量占世界牦?？?cè)后w量的93.7%以上[1-2]。青藏高原在經(jīng)過漫長的自然選擇基礎(chǔ)上所形成的大量各具特色的地方牦牛類群[3-7]，奠定了中國高原地區(qū)牦牛特色畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。遺傳多樣性也稱基因多樣性，是某一生物品種或群體內(nèi)各個體之間遺傳變異的總和。對于生物遺傳多樣性的研究有助于了解群體內(nèi)遺傳變異的水平，同時也可作為劃分群體之間遺傳關(guān)系的重要依據(jù)。微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記(SSR)也稱簡單重復(fù)序列、短串聯(lián)重復(fù)序列或簡單序列長度多態(tài)性，是由幾個核苷酸為重復(fù)單位，組成長度為幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列[8]。大量研究顯示，SSR在真核基因組中廣泛存在且隨機(jī)分布，具有高度多態(tài)、分辨率高、相對高度保守、共顯性遺傳、易于重復(fù)檢測等優(yōu)點[9-11]。 目前，SSR廣泛應(yīng)用于豬、牛、羊、雞等多種家畜家禽的群體遺傳多樣性評估及群體系統(tǒng)進(jìn)化研究[12-16]。在牦牛方面，近年有較多報道利用SSR標(biāo)記對中國藏區(qū)不同地理分布的牦牛群體進(jìn)行遺傳多樣性解析，特別是在中國主要牦牛類群的資源保護(hù)狀態(tài)監(jiān)控及群體間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系梳理等方面均被廣泛應(yīng)用[17-20]。本研究利用13個SSR標(biāo)記對中國西藏不同地理分布的5個牦牛地方種群進(jìn)行遺傳多樣性檢測與評估，進(jìn)一步明確這5個牦牛群體的保種情況和種群間系統(tǒng)發(fā)育情況，以期為中國現(xiàn)有的西藏牦牛保護(hù)模式提供參考數(shù)據(jù)，同時為牦牛新地方類群挖掘提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及基因組DNA提取

選擇西藏自治區(qū)的5個不同牦牛種群3～5歲無親緣關(guān)系的健康牦牛作為試驗樣本，共計195頭(表1)。利用2% EDTA抗凝管收集每頭個體靜脈血2 mL，利用酚-氯仿法提取基因組DNA[21]。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA質(zhì)量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 西藏5個地區(qū)牦牛群體信息

1.2 主要試劑及儀器

ExTaqDNA聚合酶及蛋白酶K均購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；無水乙醇、飽和酚、氯仿均購自重慶川東化工有限公司(中國)；瓊脂糖購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

純水蒸餾系統(tǒng)及水浴恒溫振蕩器均購自常州金壇精達(dá)儀器有限公司；超凈工作臺購自安泰空氣技術(shù)有限公司；臺式低溫離心機(jī)及移液槍均購自Eppendorf公司；ABI3730測序儀購自ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.3 微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增及基因分型

根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)及國際遺傳學(xué)會(ISAG)聯(lián)合推薦的草食動物遺傳多樣性微衛(wèi)星標(biāo)記體系，選取13個被廣泛應(yīng)用于各類?？苿游镞z傳多樣性評估的微衛(wèi)星位點，對5個西藏牦牛群體的分子遺傳多樣性進(jìn)行評估，各位點上游引物5′-端分別進(jìn)行FAM(藍(lán)色)、HEX(綠色)和ROX(紅色)的激光標(biāo)記修飾，微衛(wèi)星位點引物信息見表2。PCR反應(yīng)體系15 μL：DNA 1 μL，2×PCR Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51～64 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增效果，利用ABI 3730XL基因分析儀對含熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行上樣，上樣總體積為10 μL，其中混有標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參的去離子甲酞胺上樣液(Hi-Di Formamide)9 μL，PCR產(chǎn)物1 μL。使用GeneMapper 3.7確定基因片段長度分型。

表2 13個微衛(wèi)星位點標(biāo)記的引物信息

續(xù)表

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Microsatellite Toolkit軟件包計算各遺傳位點及群體的等位基因數(shù)(Na)、多態(tài)信息含量(PIC)、觀察雜合度(Ho)和期望雜合度(He)等遺傳參數(shù)。 利用GENEPOP 3.4軟件[22]進(jìn)行群體內(nèi)各位點Hardy-Weinberg平衡檢驗，利用Fstat 2.9軟件[23]計算群體近交系數(shù)(Fis)；利用Arlequin 3.5軟件[24]計算群體間遺傳分化指數(shù)(Fst)?；贜ei遺傳距離利用PHYLIP[25]軟件構(gòu)建群體系統(tǒng)發(fā)生樹，并用iTOL在線工具(https:∥itol.embl.de/)對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行可視化處理；利用STRUCTURE 2.3.3軟件及CLUMMP軟件[26]進(jìn)行群體貝葉斯聚類分析，并用DISSTRUCT 1.1[27]和GHOSTSCRIPT 9.21對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。利用STRUCTURE HARVESTER[28]在線工具(http:∥taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/)計算STRUCTURE結(jié)果中的最佳K值；利用GenAlex軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)，其結(jié)果用R環(huán)境(https:∥www.r-project.org/)繪制。

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA提取及基因分型檢測

利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的全部DNA樣本，結(jié)果顯示，所有個體基因組DNA條帶清晰、分布一致、亮度明顯，說明其質(zhì)量與純度較佳，滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增要求。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，全部產(chǎn)物擴(kuò)增條帶單一、特異性強(qiáng)，且無非特異性擴(kuò)增及引物二聚體出現(xiàn)，可用于后續(xù)基因分型試驗。基因分型結(jié)果顯示，各微衛(wèi)星位點的分型結(jié)果清晰可信，如AGLA293位點在某個體中具有2個可清晰判別的峰值，表明該個體在AGLA293位點上攜帶211/216 bp基因型(圖1)。

圖1 AGLA293位點微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記檢測結(jié)果Fig.1 Genotype detection result of AGLA293 microsatellite markers

2.2 微衛(wèi)星位點遺傳多樣性分析

本研究中，13個微衛(wèi)星位點在195個樣本中共檢測出97個等位基因(表3)，各位點的等位基因為4(BM2113)～12(TGLA122)個；多態(tài)信息含量為0.4123(BM2113)～0.7724(TGLA122)，其中，除AGLA293、BM2113、ILSTS008位點為中度多態(tài)外(0.250.5)；期望雜合度為0.4846(BM2113)～0.8086(TGLA122)，平均期望雜合度為0.6799；觀測雜合度為0.1866(AGLA293)～0.7996(TGLA122)，平均觀測雜合度為0.5964。除ILSTS050位點外，其余12個位點的期望雜合度均高于觀測雜合度，其中TGLA122位點相差最小(0.0090)，而AGLA293位點相差最大(0.3416)。ETH152和ILSTS050位點在所有群體內(nèi)均偏離Hardy-Weinberg平衡，其余位點偏離Hardy-Weinberg平衡的群體數(shù)分布為1(TGLA122)～5(AGLA293、BM1824、BM2113)，各位點偏離Hardy-Weinberg平衡的群體見表4。

表3 13個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)評估

表4 群體內(nèi)各位點Hardy-Weinberg平衡檢測結(jié)果(P值)

2.3 群體遺傳多樣性分析

西藏5個地區(qū)牦牛群體的遺傳多樣性分析結(jié)果見表5。由表5可知，各群體的平均等位基因數(shù)為5.00(類烏齊牦牛)～6.43(阿里牦牛)個；多態(tài)信息含量為0.5993(帕里牦牛)～0.6367(阿里牦牛)。期望雜合度為0.6189(帕里牦牛)～0.6434(斯布牦牛)；觀測雜合度為0.5311(娘亞牦牛)～0.5995(類烏齊牦牛)，5個群體的期望雜合度均高于觀測雜合度，說明5個牦牛群體都存在不同程度的雜合度下降。各牦牛群體內(nèi)偏離Hardy-Weinberg平衡的位點數(shù)為5(類烏齊牦牛)～9(阿里牦牛)個；近交系數(shù)為0.044(類烏齊牦牛)～0.172(阿里牦牛)，其中阿里牦牛、斯布牦牛、娘亞牦牛、帕里牦牛4個群體近交顯著(P<0.05)。

2.4 群體間差異分析

西藏5個牦牛群體間遺傳分歧結(jié)果顯示，群體間遺傳分化指數(shù)在0.01660(阿里牦牛與斯布牦牛)～0.26310(斯布牦牛與帕里牦牛)之間，且兩兩群體間均顯示顯著遺傳分歧(P<0.05)(表6)。

表5 西藏5個地區(qū)牦牛群體的遺傳多樣性參數(shù)評估

表6 西藏5個地區(qū)牦牛群體間差異檢測結(jié)果(Fst)

2.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

本研究中利用Nei遺傳距離構(gòu)建的西藏5個地牦牛群體系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知，5個群體均有獨立分支，其中類烏齊牦牛和帕里牦牛群體種群關(guān)系較近，阿里牦牛和斯布牦牛群體種群關(guān)系較近。對比群體棲息地分布發(fā)現(xiàn)，5個牦牛群體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與地理分布不完全一致。

STRUCTURE分析結(jié)果顯示，K=2時，阿里牦牛、斯布牦牛、娘亞牦牛群體與類烏齊牦牛、帕里牦牛群體分別聚為兩個分支；K=3時，阿里牦牛群體從斯布牦牛、娘亞牦牛群體中分離出來，獨立為一支；K=4時，阿里牦牛、斯布牦牛和娘亞牦牛群體的遺傳成分變得更為復(fù)雜，且阿里牦牛和斯布牦牛群體的分化加大；K=5時，阿里牦牛、斯布牦牛和娘亞牦牛群體各自為一支，類烏齊牦牛、帕里牦群體聚為一支(圖3)。通過STRUCTURE HARVESTER的DeltaK值評估發(fā)現(xiàn)，STRUCTURE分析的最佳K值為3(表7)。

對全部樣本進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，5個牦牛群體聚類雖較為明顯，但如阿里牦牛、斯布牦牛、娘亞牦牛群體都有明顯的獨立聚類現(xiàn)象，而類烏齊牦牛和帕里牦牛等群體之間仍有部分個體表現(xiàn)為較近的親緣關(guān)系，暗示了部分群體間可能存在基因交流現(xiàn)象。

圖2 基于Nei遺傳距離評估西藏5個地區(qū)牦牛群體的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationship of 5 Tibet yak populations using Nei genetics distance

圖3 西藏5個地區(qū)牦牛群體STRUCTRE分析結(jié)果Fig.3 STRUCTURE analysis results of 5 Tibet yak populations

表7 西藏5個地區(qū)牦牛群體STRUCTURE分析的最佳K值評估

圖4 西藏5個地區(qū)牦牛群體的主坐標(biāo)分析二維散點圖Fig.4 PCoA 2-D scatter diagram of 5 Tibet yak populations

3 討 論

研究表明，研究群體遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳位點應(yīng)選擇均勻分布在不同染色體上并彼此間不存在連鎖關(guān)系；位點數(shù)一般為5～19個為宜，且各位點具有4個或4個以上等位基因數(shù)量[29]。依據(jù)FAO推薦標(biāo)準(zhǔn)可知，本研究中所選標(biāo)記基本來自于不同染色體或連鎖群，且除BM2113外其他各位點等位基因數(shù)均≥4，符合微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記位點選擇原則，滿足本試驗對西藏牦牛遺傳多樣性研究要求。另外，本研究中各群體樣本量較豐富，可降低各評估遺傳參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤，數(shù)據(jù)相對接近真實值[30]。

等位基因數(shù)是重要的遺傳多樣性指標(biāo)，本研究中13個微衛(wèi)星位點在5個牦牛群體的平均等位基因數(shù)(7.46)高于趙素君[31]在麥洼牦牛、九龍牦牛、天祝白牦牛、大通牦牛4個牦牛群體的平均等位基因數(shù)(6.8)；與巴多等[32]報道的2個阿里牦牛類群的平均等位基因數(shù)(7.4)相接近，但低于桑桑牦牛、康布牦牛、巴青牦牛的平均等位基因數(shù)[20]。這一方面可能是由于不同群體的遺傳多樣性水平差異或同一群體不同時期遺傳多樣性存在動態(tài)變化所致；另一方面，可能由于不同研究所選用的遺傳標(biāo)記位點數(shù)量和種類不同所致。多態(tài)信息含量主要用于反映遺傳標(biāo)記的變異程度，估計群體遺傳變異程度[33]，本研究中5個牦牛群體的多態(tài)信息含量均>0.5，說明西藏5個牦牛群體具有豐富的遺傳多樣性，特別是阿里牦牛群體遺傳多樣性水平最高。

群體雜合度反映了各群體在多個基因位點上的遺傳變異程度，也是衡量群體變異的重要指標(biāo)之一。本研究的13個微衛(wèi)星位點中，僅BM2113位點的期望雜合度略低于0.5，其余12個位點的期望雜合度均高于0.5，說明本研究選取的微衛(wèi)星標(biāo)記具有豐富的多態(tài)性。本研究中5個牦牛群體的雜合度均符合已有報道的規(guī)律，且5個牦牛群體的觀測雜合度均>0.5，也同樣反映出各群體遺傳多樣性豐富[33]。本研究中5個牦牛群體的期望雜合度高于廖信軍等[34]對高山牦牛、九龍牦牛、麥洼牦牛等群體的研究結(jié)果，表明西藏地區(qū)牦牛資源遺傳多樣性更為豐富；帕里牦牛和斯布牦牛的觀測雜合度與廖信軍等[34]報道相比均有所提升，但低于李鐸等[20]研究報道，推測該系列牦牛群體的遺傳多樣性存在波動的可能，甚至可能由于保種措施不當(dāng)而使得近年該2個群體的遺傳多樣性下降。當(dāng)然，受不同研究中樣本量、所選位點標(biāo)記數(shù)量及種類等諸多因素影響，這一結(jié)論仍需進(jìn)一步明確。

本研究中，除ILSTS050位點外，其余12個位點的期望雜合度均高于觀測雜合度，表明等位基因數(shù)量在各位點內(nèi)分布不均衡，特別是不同群體內(nèi)均存在一定比例的標(biāo)記，不同程度地偏離Hardy-Weinberg平衡，表明各群體內(nèi)存在群體事件風(fēng)險。另外，本研究中除類烏齊牦牛外其余4個牦牛群體的近交系數(shù)分析表明，該系列群體可能存在顯著近交風(fēng)險，這與Hardy-Weinberg平衡檢測結(jié)果相印證。目前，中國西藏牦牛飼養(yǎng)方式仍以天然放牧為主，雖然理論上較為原始的生產(chǎn)模式有助于遺傳多樣性的保持，但在實際上動物群體內(nèi)存在一定的社會屬性和不均衡的交配所有權(quán)，如種群內(nèi)極少數(shù)強(qiáng)壯的雄性個體占據(jù)了群內(nèi)大多數(shù)母畜的交配權(quán)，特別是在人為干預(yù)的飼養(yǎng)條件模式下，人們也更傾向于增加少數(shù)優(yōu)秀種公牛的利用率，這些因素不僅不利于種群遺傳多樣性保持，更可能加快種群在短世代周期內(nèi)受到瓶頸效應(yīng)和近交衰退的威脅。

總體而言，類烏齊群體保種狀態(tài)最佳，這可能與其群體所處的地理位置相關(guān)，如類烏齊牦牛所在的昌都市位于西藏的東北部，且海拔較高，人煙稀少，因此該群體可能受外界人類活動影響較小，加之較為豐富的種群量保障了群體內(nèi)固有遺傳多樣性的維持和傳遞；而其他4個群體的遺傳多樣性不同程度的下降提醒應(yīng)對現(xiàn)有的保種策略進(jìn)行優(yōu)化和整改，以便盡快恢復(fù)這些地方固有牦牛群體的遺傳多樣性水平，為今后更好的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

從系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳分歧結(jié)果來看，5個群體間均存在顯著遺傳分歧，各群體可視為獨立地方品種生態(tài)類群。本研究結(jié)果中關(guān)于娘亞牦牛、斯布牦牛和帕里牦牛的群體系統(tǒng)關(guān)系與Chai等[35]利用全基因測序技術(shù)對青藏高原31個資源群體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究結(jié)果相一致。眾所周知，娘亞牦牛、帕里牦牛、斯布牦牛和類烏齊牦牛群體均為中國牦牛遺傳資源品種，而阿里牦牛作為藏西北羌塘高原的重要地方牦牛群體卻鮮為外界所知，但其對當(dāng)?shù)氐哪翗I(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。本研究結(jié)果闡明了阿里牦牛群體在西藏牦牛資源中的系統(tǒng)發(fā)育定位，并明確了與其他現(xiàn)有西藏牦牛遺傳資源間存在的顯著遺傳分歧，為其今后躋身國家畜禽遺傳資源提供了可貴的理論支撐，今后應(yīng)著力加快對該牦牛群體的資源特性挖掘和開發(fā)利用，補(bǔ)充豐富西藏牦牛良種資源。

值得注意的是，本研究中的群體間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與種群棲息地分布特征不一致，且STRUCTURE結(jié)果反映出部分群體間遺傳分層存在相似性，特別是主坐標(biāo)分析結(jié)果進(jìn)一步印證了不同群體間有部分個體存在較近的親緣關(guān)系，表明群體間存在一定程度的遺傳物質(zhì)交流。目前，已有大量研究利用線粒體高變區(qū)及微衛(wèi)星標(biāo)記等方法明確了青藏高原不同牦牛類群間存在廣泛的遺傳物質(zhì)交流現(xiàn)象[36-38]，這不僅與當(dāng)?shù)氐挠文?、季?jié)性牧場輪牧等養(yǎng)殖習(xí)慣有關(guān)，同時由于青藏鐵路開通及高原內(nèi)陸交通網(wǎng)的日益完善，加速了各類貿(mào)易活動，包括農(nóng)牧業(yè)，尤其是外地優(yōu)秀種源的引進(jìn)和交流等都大大加快了畜禽遺傳物質(zhì)交流的頻率與可能性?？傊?，本研究為中國西藏地區(qū)主要牦牛群體資源保護(hù)和評價提供了有力的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究中5個牦牛群體遺傳多樣性均表現(xiàn)為高度豐富水平，其中阿里牦牛遺傳多樣性水平最高。但阿里牦牛、帕里牦牛、斯布牦牛及娘亞牦牛群體均存在近交風(fēng)險，類烏齊牦牛保種狀態(tài)最佳；5個牦牛群體間存在顯著遺傳分歧，不同群體間存在一定程度的遺傳物質(zhì)交流而導(dǎo)致系統(tǒng)聚類未顯示明確的地理特異性。

致 謝：感謝西南大學(xué)俄廣鑫副教授團(tuán)隊對本研究數(shù)據(jù)分析提供支持及論文修改中給予的建議；感謝西藏自治區(qū)阿里地區(qū)改則縣、拉薩市墨竹工卡縣、那曲市嘉黎縣、昌都市類烏齊縣及日喀則市亞東縣帕里鎮(zhèn)相關(guān)畜牧科技管理部門同仁在樣品采集中給予的配合和支持。