柴志欣，武志娟，王吉坤，張成福，鐘金城，信金偉

(1.西南民族大學，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041；2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850000)

結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)屬基質(zhì)蛋白，為即刻早期基因家族成員，在許多生理生化過程中發(fā)揮重要作用。Almendral等[1]于1988年首次發(fā)現(xiàn)CTGF，Bradham 等[2]于1991年首次分離獲得CTGF，且CTGF在進化上較為保守，不同種屬間CTGF基因及其編碼蛋白均表現(xiàn)出高度同源性。CTGF由349個氨基酸組成，氨基端含促分泌信號肽，且包括IB結(jié)構(gòu)域-胰島素樣生長因子特異結(jié)合區(qū)、VWC結(jié)構(gòu)域-C型血管假性血友病因子區(qū)、TSP-1結(jié)構(gòu)域、Cysteine-Knot結(jié)構(gòu)域等[3-4]。CTGF可促進新血管生成、骨骼發(fā)育、軟骨發(fā)生和損傷修復等[5-7]，其絲裂原活性較強，也可促進有絲分裂，參與許多細胞活動，刺激細胞增殖、分化和凋亡，維持細胞基質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等[8]。在正常生理狀態(tài)下，動物體內(nèi)CTGF表達量很低或不表達，但在胚胎階段、骨發(fā)生發(fā)育過程中出現(xiàn)CTGF高表達，表明CTGF存在表達的自身調(diào)節(jié)[9-10]。CTGF的表達調(diào)控涉及到骨骼發(fā)育，骨形態(tài)發(fā)生蛋白誘導的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)由Wnt信號通路上調(diào)CTGF表達量，CTGF通過整合素(αvβ1)整合增強成骨細胞的黏附，并促進細胞通過細胞骨架重組和小G蛋白Rho GTP ase家族成員(Rac1)的激活進行遷移[11-12]。

G蛋白調(diào)節(jié)誘導神經(jīng)突增生家族(G protein-regulated inducer of neurite outgrowth family,Gprin)是具有組成型活性形式的共表達信號傳導分子，主要包括Gprin1、Gprin2和Gprin3，成員間具有高度同源性。Gprin抗體已廣泛應用于神經(jīng)生物學和信號轉(zhuǎn)導領(lǐng)域的研究，G蛋白偶聯(lián)受體(Gαo)可刺激神經(jīng)分支細胞，但其在體內(nèi)的作用機制尚不清楚。Gprin可能是Gαo調(diào)節(jié)神經(jīng)生長的下游作用因子[13]，Gαo-GRIN相互作用可調(diào)節(jié)神經(jīng)突增生，使細胞通過G蛋白偶聯(lián)受體i/o亞型(GPCR-Gαi/o)介導的信號分化為神經(jīng)突起。研究發(fā)現(xiàn)，Gαi/o-Gprin信號能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的定向遷移，可顯著調(diào)控神經(jīng)元在胚胎階段的遷移和分化，從出生后到成熟階段發(fā)揮定位功能并維護特定的神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)元中特異表達并定位于樹突和軸突，且與Gαo互作的Gprin蛋白很可能參與信號轉(zhuǎn)導途徑和神經(jīng)元分化過程[14-16]。

牦牛的體尺性狀是評估其生長發(fā)育的重要指標，同時也間接反映了牦牛的生長速度和產(chǎn)肉性能，是重要的經(jīng)濟性狀之一[17]。目前，對人、小鼠及大鼠等模式動物的CTGF基因研究較多，在其他物種上研究相對較少；Gprin3基因的相關(guān)研究主要集中于人類疾病方面，但以上基因突變對家畜生長發(fā)育性狀的影響鮮見報道。CTGF基因缺失會引起軟骨發(fā)育不全，而牦牛軟骨發(fā)育不全會導致頭部畸形、短脊椎、主軸骨和附屬骨發(fā)育不良及腿短等疾病[18]；Gprin3基因缺失可引起細胞通訊異常導致生長激素分泌減少進而影響其個體生長發(fā)育。鑒于此，本試驗擬研究CTGF和Gprin3基因多態(tài)性，并分析其與牦牛生長性狀的關(guān)聯(lián)性，以期為牦牛定向選育提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取健康成年的斯布牦牛、帕里牦牛、類烏齊牦牛、申扎牦牛、麥洼牦牛共260頭(表1)，采集耳組織，75%乙醇保存帶回實驗室，-80 ℃保存?zhèn)溆?，并在采集過程測定其體重、體高、體斜長、胸圍、管圍、前肢長和脛長等指標。

表1 牦牛樣本信息

1.2 主要試劑及儀器

DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；TaqGreen PCR Master Mix和瓊脂糖均購自Thermo公司；DL2000 DNA Marker購自Biomiga公司。PCR儀購自Thermo公司；紫外分光光度計和凝膠成像系統(tǒng)均購自Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 制備DNA池 每個試驗牦牛群各取30個樣品，提取DNA，重復測定DNA濃度，取其3次測定結(jié)果的平均值，將其稀釋到50 ng/μL，150個DNA樣本各取5 μL混合均勻，4 ℃靜止48 h。

1.3.2 PCR擴增 根據(jù)GenBank中普通牛CTGF基因序列(登錄號：AC000166)、野牦牛Gprin3基因序列(登錄號：NW_005393912)，采用Primer Premier 6.0軟件分別設計引物，引物信息見表2。 引物均由上海伯津生物技術(shù)有限公司合成。

PCR擴增體系25 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板(200～600 μg/L) 1 μL，2×LongTaq預混酶(0.625 U) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表2)30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%凝膠電泳檢測，對鑒定正確的產(chǎn)物純化回收后送上海伯津生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.3 SNP篩查及數(shù)據(jù)分析 利用BioEdit 7.0、Chromas軟件將擴增序列與參考序列進行比對，篩查雙峰位點(SNP)，使用直接測序法驗證其突變位點；根據(jù)突變位點及雙峰圖堿基型，結(jié)合軟件DNA SEQMAN判定其基因型，計算基因頻率及基因型頻率；采用PIC_CALC軟件分析多態(tài)信息含量(PIC)，利用Popgen32軟件計算其純合度(Ho)、雜合度(He)及有效等位基因數(shù)(Ne)，并進行Hardy-Weinberg平衡性檢測；使用Excel對體重、體高、體斜長、胸圍及管圍等體尺數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)與相關(guān)性分析，結(jié)果以平均值±標準誤表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

表2 引物信息

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物檢測

以DNA池為模板進行PCR擴增，所得產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰單一(圖1)，片段大小與預期相符。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，牦牛CTGF基因的引物P3和P4以及Gprin3基因引物P1、P2和P3的擴增序列均含SNPs位點。

2.2 SNPs位點篩查及檢測

以5個牦牛類群DNA池為模板擴增CTGF、Gprin3基因，在CTGF基因中共檢測到3個SNPs，分別為T1537A、C2195T和C2421T(圖2)，均包含3個基因型，位于內(nèi)含子區(qū)；在Gprin3基因中共檢測到4個SNPs，分別為G310C、C414T、C1100T和G1213A(圖3)，均包含3個基因型，位于編碼區(qū)。

2.3 基因頻率和基因型頻率

分別對CTGF、Gprin3基因SNPs進行統(tǒng)計分析，獲得了等位基因及基因型在5個牦牛類群中的分布頻率，結(jié)果見表3、4。由表3可知，CTGF基因T1537A位點TT基因型在斯布牦牛、帕里牦牛、類烏齊牦牛、申扎牦牛和麥洼牦牛中的分布頻率分別為0.6000、0.4516、0.4286、0.4857和0.7714，為優(yōu)勢基因型，等位基因T為優(yōu)勢等位基因；C2195T位點中C等位基因在5個牦牛類群中的頻率均高于T等位基因；C2421T位點純合基因型CC在斯布牦牛、帕里牦牛、類烏齊牦牛、申扎牦牛和麥洼牦牛中的分布頻率分別為0.5750、0.7097、0.6531、0.7000、0.7857，為優(yōu)勢基因型。

由表4可知，在Gprin3基因G310C位點中未發(fā)現(xiàn)CC基因型個體；C414T位點在申扎牦牛中未發(fā)現(xiàn)TT基因型個體，該位點的CC基因型在5個牦牛類群中均屬于優(yōu)勢基因型；C1100T位點在帕里和申扎牦牛中均未檢測到TT基因型個體；G1213A位點在5個牦牛類群中均缺失AA基因型，且等位基因G頻率最高，為優(yōu)勢等位基因。

1～4，CTGF基因P3引物PCR擴增產(chǎn)物；M,DL2000 DNA Marker;5～7，CTGF基因P4引物PCR擴增產(chǎn)物；8、9，Gprin3基因P3引物PCR擴增產(chǎn)物；10～12，Gprin3基因P2引物PCR擴增產(chǎn)物；13～15，Gprin3基因P1引物PCR擴增產(chǎn)物1-4，PCR amplification products of CTGF gene P3 primer；M,DL2000 DNA Marker;5-7，PCR amplification products of CTGF gene P4 primer；8 and 9，PCR amplification products of Gprin3 gene P3 primer；10-12，PCR amplification products of Gprin3 gene P2 primer；13-15，PCR amplification products of Gprin3 gene P1 primer圖1 牦牛CTGF和Gprin3基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of CTGF and Gprin3 genes in yaks

圖2 牦牛CTGF基因測序峰圖Fig.2 Sequencing of CTGF gene in yaks

圖3 牦牛Gprin3基因測序峰圖Fig.3 Sequencing of Gprin3 gene in yaks

表3 CTGF基因SNPs位點基因型頻率及基因頻率

表4 Gprin3基因SNPs位點基因型頻率及基因頻率

2.4 Hardy-Weinberg平衡檢測

對牦牛CTGF、Gprin3基因SNPs位點不同基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡的χ2檢驗，結(jié)果見表5。由表5可知，CTGF基因T1537A位點在斯布牦牛和麥洼牦牛類群中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，而在帕里牦牛、類烏齊牦牛和申扎牦牛類群中均偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)；C2195T和C2421T位點在5個牦牛群體中χ2值均未達到顯著水平，均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。Gprin3基因G310C、C414T及C1100T位點在5個牦牛類群中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；G1213A位點在類烏齊牦牛類群中偏離平衡狀態(tài)，在其余4個類群中均達到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.5 遺傳多樣性指標

由表5可知，CTGF基因T1537A位點在斯布牦牛、帕里牦牛、類烏齊牦牛和申扎牦牛類群中均處于中度多態(tài)(0.25

由表5可知，CTGF基因T1537A、T2421T位點及Gprin3基因G310C、C1100T位點在5個牦牛類群中純合度較高，說明西藏牦牛的遺傳一致性較高，遺傳變異較低；Gprin3基因C414T、G1213A位點在類烏齊牦牛類群中雜合度均高于純合度，而在其他類群中純合度均高于雜合度，說明類烏齊牦牛的遺傳多樣性較高。

表5 CTGF、Gprin3基因SNP位點的遺傳多樣性

2.6 CTGF、Gprin3基因SNPs位點與牦牛體尺性狀的相關(guān)性分析

由表6、7可知，CTGF基因T1537A和C2421T位點與牦牛體尺性狀具有相關(guān)性，其中T1537A位點TT和TA基因型個體體重均顯著高于AA基因型(P<0.05)；在斯布牦牛和申扎牦牛兩個類群中，C2421T位點CC和CT基因型個體體重、體斜長、胸圍和前肢長均顯著高于TT基因型，CT基因型個體管圍顯著低于CC、TT基因型(P<0.05)。

由表8、9可知，Gprin3基因C414T和C1100T位點與牦牛體尺性狀具有相關(guān)性，其中C414T位點CC和CT基因型個體牦牛體重、體斜長和胸圍均顯著高于TT基因型，CC基因型個體牦牛體高顯著高于CT和TT基因型(P<0.05)；在斯布牦牛和申扎牦牛中，C1100T位點CC基因型個體胸圍和前肢長均顯著低于CT和TT基因型(P<0.05)。

表6 CTGF基因T1537A位點對牦牛體尺性狀的影響

表7 CTGF基因C2421T位點對牦牛體尺性狀的影響

表8 Gprin3基因C414T位點對牦牛體尺性狀的影響

表9 Gprin3基因C1100T位點對牦牛體尺性狀的影響

3 討 論

3.1 牦牛CTGF、Gprin3基因多態(tài)性

CTGF基因在骨骼發(fā)育、塑形及軟骨發(fā)生等過程中均發(fā)揮一定調(diào)控作用[19]，而骨骼的發(fā)育及重塑可間接反映家畜的體型及生長發(fā)育狀況，影響著家畜的經(jīng)濟性狀及經(jīng)濟價值。 目前，CTGF基因多態(tài)性研究大多集中在人類疾病方面，如CTGF基因rs2648875位點多態(tài)性與2型糖尿病性腎病遺傳易感性(DKD)相關(guān)[20]，rs9399005位點多態(tài)性與冠心病有關(guān)[21]等。在動物方面的研究則主要集中于動物疾病及其模型構(gòu)建，黃葉等[22]構(gòu)建了廣西巴馬小型豬CTGF基因真核表達載體；丁旭娜等[23]研究顯示，外源轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)對奶牛乳腺上皮細胞中CTGF基因表達的促進作用可進一步作用于奶牛乳腺纖維化過程。 牦牛CTGF、Gprin3基因的相關(guān)研究較少，向婭等[24]對牦牛Gprin3基因進行了克隆及組織表達分析，李月嬌等[25]開展了CTGF、FGF-2基因在不同年齡牦牛肺臟內(nèi)的分布和表達研究，而關(guān)于家畜CTGF、Gprin3基因SNP位點檢測及與相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析鮮有報道。

本研究在CTGF、Gprin3基因中共發(fā)現(xiàn)7個SNPs，其中CTGF基因中3個SNPs均位于內(nèi)含子區(qū)域；Gprin3基因中4個SNPs均位于外顯子區(qū)域，均包括3種基因型。在所檢測的等位基因中，T、C、G較為普遍，而等位基因A頻率較低，這可能與不同牦牛類群人工選育程度及不同地區(qū)對牦牛優(yōu)勢生產(chǎn)性能篩選差異有關(guān)。Hardy-Weinberg平衡檢測結(jié)果表明，CTGF基因中除T1537A位點在帕里牦牛、類烏齊牦牛、申扎牦牛中偏離平衡狀態(tài)外，其余位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；Gprin3基因中僅G1213A位點在類烏齊牦牛中不符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，其余位點在5個牦牛類群中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明以上位點受自然選擇和基因突變的影響較大，同時類烏齊牦牛于2017通過國家畜禽遺傳資源委員會審定為優(yōu)良牦牛遺傳資源，2019年被認定為國家特色農(nóng)產(chǎn)品，對類烏齊牦牛核心育種群的選育及短期育肥基地的建立加大了人工選擇的干預，而帕里牦牛于2006年進入國家禽遺傳資源保護名錄，并對其進行了核心群選育，人工選擇使其群體結(jié)構(gòu)有所改變，表現(xiàn)出部分群體多個位點不同程度地偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，但對不同畜種而言適度的人工干預有利于其生產(chǎn)性能的提高。CTGF、Gprin3基因多態(tài)位點在類烏齊牦牛類群中均處于中度多態(tài)，說明類烏齊牦牛遺傳變異程度較大，多態(tài)性較豐富，與武志娟等[26]對西藏牦牛mtDNA 16S rRNA的遺傳多樣性研究結(jié)果一致，顯示在西藏11個牦牛類群中類烏齊牦牛遺傳多樣性最豐富。CTGF基因T1537、T2421T位點及Gprin3基因G310C、C1100T位點在5個牦牛類群中的純合度較高，說明以上位點的純合基因型積累較多，且遺傳變異較小，用于優(yōu)良性狀選育的潛力較小，可能與以上牦牛類群長期本品種選育及缺少與其他牦牛群體的基因交流有關(guān)[27]。

3.2 CTGF、Gprin3基因多態(tài)性與牦牛體尺性狀的關(guān)聯(lián)性

本研究結(jié)果顯示，CTGF基因T1537A位點與體高呈顯著相關(guān)，其中TT和TA基因型個體體重均顯著高于AA基因型，是影響牦牛體重的參考分子標記位點；在斯布牦牛和申扎牦牛中，CTGF基因C2421T位點與牦牛體重、體斜長、胸圍、管圍和前肢長均呈顯著關(guān)聯(lián)，其中CC和CT基因型個體體重、體斜長、胸圍和前肢長均顯著高于TT基因型，推測CTGF基因在牦牛生長發(fā)育相關(guān)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。申扎牦牛因其體格較小在西藏當?shù)胤Q為矮小牦牛，群體個體體型均較小，其體重、體高、體斜長、胸圍、管圍等指標均低于帕里牦牛、類烏齊牦牛和麥洼牦牛；而斯布牦牛大多數(shù)個體后驅(qū)股部發(fā)育欠佳，2個牦牛群體個體發(fā)育除受所處生態(tài)環(huán)境影響外，基因調(diào)控也起到重要作用，后續(xù)可對CTGF基因?qū)﹃笈ｓw尺性狀的影響開展相關(guān)研究。CTGF基因中3個SNPs位點均位于內(nèi)含子區(qū)域，這與Chang[28]研究表明內(nèi)含子也可通過影響基因的表達來影響動物表型的結(jié)論一致。雖然內(nèi)含子區(qū)域的變異并不直接涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，但是內(nèi)含子區(qū)域的突變很可能與某些突變位點的不平衡狀態(tài)有關(guān)，大多數(shù)復雜性狀的遺傳變異均位于基因間和內(nèi)含子區(qū)域，參與相關(guān)基因的表達調(diào)控，但卻并不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)?？勺兗羟锌烧{(diào)控基因的表達和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性，目前研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子也可參與可變剪切調(diào)控，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進而影響動物的相關(guān)性狀[27]。在本研究5個牦牛類群中，Gprin3基因C414T位點與牦牛體重、體高、體斜長和胸圍均呈顯著相關(guān)，其中CC和CT基因型個體牦牛體重、體斜長和胸圍均顯著高于TT基因型；在斯布牦牛和申扎牦牛中，C1100T位點CC基因型個體胸圍和前肢長均顯著低于CT和TT基因型。推測這2個SNPs位點可能是影響牦牛體尺性狀的重要調(diào)控位點，但具體調(diào)控機制和功能尚需進一步研究。目前關(guān)于CTGF、Gprin3基因在家畜中的研究較少，缺少可供參考及對比的數(shù)據(jù)，可進一步從蛋白質(zhì)組水平分析以上2個基因與性狀的相關(guān)性。

4 結(jié) 論

本研究中CTGF和Gprin3基因在牦牛中存在豐富的多態(tài)性，共檢測到7個SNPs位點，其中CTGF基因T1537A位點與牦牛體高顯著相關(guān)，C2421T位點與牦牛體重、體斜長、胸圍、管圍和前肢長呈顯著相關(guān)；Gprin3基因C414T位點與牦牛體重、體高、體斜長和胸圍均呈顯著相關(guān)，C1100T位點與牦牛胸圍和前肢長均呈顯著相關(guān)。