高倍瑤,劉艷光,賈 琪,柳儉強(qiáng),羅新惠,張立春
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,長春 130000;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物生物技術(shù)研究所,公主嶺 136100;3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,延吉 130021)
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)又稱宿主防御肽或抗微生物肽,是一類宿主經(jīng)病原微生物誘導(dǎo)所分泌且能夠?qū)共≡w的小分子多肽[1]。在過去的幾十年里,AMPs因其對細(xì)菌、真菌及病毒具有獨特的抗菌活性能有效降低細(xì)菌耐藥性,具有生物相容性,具有成為新型治療藥物替代品的廣闊發(fā)展前景[2-4]。AMPs的產(chǎn)生是宿主和病原在自然界長期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果,動物體內(nèi)的AMPs主要由吞噬細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生,并通過蛋白質(zhì)水解作用形成具有生物活性的成熟肽。成熟的AMPs具有廣泛的抗病原體譜系[5],對自然界的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲、病毒及腫瘤細(xì)胞的天然免疫都起著重要作用[6]。防御素是廣泛分布于動物、植物、昆蟲體內(nèi)具有6個半胱氨酸殘基和3個分子鏈間二硫鍵的陽離子內(nèi)源性AMPs[7],在牛、馬、羊、豬、鹿及駱駝等家畜體內(nèi)廣泛表達(dá)[8]。根據(jù)半胱氨酸殘基之間的不同聯(lián)系,哺乳動物防御素可分為α、β和θ 3種,從進(jìn)化的角度來看,β-防御素是最古老的防御素[3]。在豬體內(nèi),僅發(fā)現(xiàn)了β-防御素[9]且表達(dá)極為廣泛,Choi等[10]在豬的消化道、呼吸道、脾臟、淋巴結(jié)、腦、心臟、肝臟、腎臟、膀胱、睪丸、皮膚、肌肉、骨髓、外周血、嗜中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞以及臍帶中均檢測到豬β-防御素-1(porcine beta-defensin-1,PBD-1)mRNA表達(dá)。β-防御素因其在豬體內(nèi)廣泛表達(dá)和其對微生物的廣譜抗性、調(diào)節(jié)先天免疫的能力,具有開發(fā)成為良好的外源性抗生素替代品的潛質(zhì)[11],是目前研究最深入、廣泛的一類防御素,目前已發(fā)現(xiàn)了29種PBD[10],但并未發(fā)現(xiàn)針對豬PBD-124基因的報道。鑒于此,本試驗以大白豬、民豬和野雜豬3個群體為研究對象,采用RT-PCR方法擴(kuò)增并克隆PBD-124基因;利用PCR-RFLP限制性核酸內(nèi)切酶BlnⅠ對突變位點進(jìn)行酶切,檢測該基因的多態(tài)性;利用實時熒光定量PCR方法檢測該基因在不同品種豬組織中的差異表達(dá)情況,以期為進(jìn)一步探究PDB-124基因的生物學(xué)功能及免疫防御相關(guān)的候選基因提供參考依據(jù)。
于吉林省白山市隆興牧業(yè)有限公司興降豬場選取野雜豬31頭(民豬與野豬雜交豬,含75%長白山野豬血統(tǒng));于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院民豬保種場民豬34頭;于四平紅嘴集團(tuán)梨樹種豬場選取純種大白豬31頭,3個品種豬均為5~6月齡。采集3個品種96頭豬血樣,用抗凝血管收集,-20 ℃保存?zhèn)溆?。屠宰后取肝臟和脾臟,用滅菌剪刀剪成小塊,放入凍存管并做好標(biāo)記,于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>
Blood Genomic DNA提取試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司;Trizol購自Invitrogen公司;PrimeScript?RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×ESTaqMasterMix 均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;Gel Extraction Kit膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司。Light Cycler 480 SYBR Green Ⅰ Master和實時熒光定量PCR儀均購自羅氏公司;梯度PCR儀購自北京博輝生物科技有限公司。
根據(jù)GenBank中PBD-124基因mRNA預(yù)測序列(登錄號:XM_013983105),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物擴(kuò)增PBD-124基因CDS區(qū);根據(jù)PBD-124基因突變位點,利用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計PCR-RFLP酶切引物和實時熒光定量PCR引物,以豬HPRT1為內(nèi)參基因,引物信息見表1。 引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
表1 引物信息
1.4.1 DNA、總RNA提取及cDNA合成 按照Blood Genomic DNA試劑盒說明書提取3個品種豬血液基因組DNA。采用Trizol法提取3個品種豬肝臟、脾臟和血液總RNA,采用Quawell-Q5000超微量分光光度計對純度及濃度進(jìn)行檢測。參照PrimeScript?RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明進(jìn)行cDNA合成,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.2 PCR擴(kuò)增、克隆及測序分析 以3個品種豬cDNA為模板,擴(kuò)增PBD-124基因CDS區(qū)。PCR反應(yīng)體系20 μL:2×EsTaqMasterMix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA 0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共34個循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,參照Gel Extraction Kit膠回收試劑盒切膠回收,取回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接,連接體系10 μL:回收產(chǎn)物4.5 μL,pMD18-T載體0.5 μL,Solution 5 μL。16 ℃連接1 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,加入450 μL LB培養(yǎng)液(不含AMP+)置于37 ℃搖床220 r/min震蕩培養(yǎng)45 min使菌體復(fù)蘇,取200 μL復(fù)蘇菌液用一次性涂布棒均勻涂在固體LB平板上(含AMP+),37 ℃倒置培養(yǎng)12~16 h,挑取單個菌落置于1 L液體LB(含AMP+)中37 ℃搖床220 r/min震蕩培養(yǎng)10 h。取鑒定正確的陽性克隆產(chǎn)物送測,并對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。
以3個品種豬所提取的DNA為模板,根據(jù)PCR-RFLP所設(shè)計的引物進(jìn)行PBD-124基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL:2×EsTaqMasterMix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,DNA 0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共34 個循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用限制性內(nèi)切酶BlnⅠ對豬PBD-124基因目的片段進(jìn)行酶切,反應(yīng)體系10 μL:BlnⅠ 0.5 μL,10×K Buffer 1 μL,PCR產(chǎn)物5 μL,ddH2O補(bǔ)足體系。37 ℃水浴4 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型檢測。
分析PBD-124基因不同基因型的基因頻率和基因型頻率,計算遺傳純合度(Ho)、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC),通過卡方檢驗分析基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。
采用實時熒光定量PCR檢測PBD-124基因在大白豬、民豬和野雜豬的肝臟、脾臟和血液中的表達(dá)情況,并比較相同組織不同品種和相同品種不同組織間的差異表達(dá)。 PCR反應(yīng)體系20 μL:cDNA 1 μL,上、下游引物各0.5 μL,2×SYBR Premix Dimer Eraser 10 μL,ddH2O補(bǔ)足體系。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,57 ℃退火15 s,72 ℃延伸35 s,共45 個循環(huán);95 ℃變性5 s,60 ℃遞增到97 ℃最后降到40 ℃保存。每組試驗重復(fù)3次,采用2-△△Ct方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,組間比較采取t檢驗,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
以野雜豬、民豬和大白豬的血液cDNA為模板,PCR產(chǎn)物片段大小約500 bp(圖1),與預(yù)期相符??寺y序發(fā)現(xiàn),目的條帶全長500 bp;BLASTN比對發(fā)現(xiàn),該片段與PBD-124基因預(yù)測mRNA序列(登錄號:XM_013983105)高度同源,其中,包含完整CDS序列423 bp,共編碼140個氨基酸。序列比對發(fā)現(xiàn),PBD-124基因存在2個突變位點:c.257 G>A和c.263 T>C,但均沒有引起氨基酸的改變。因2個突變位點間隔過近,可能存在連鎖,僅對第1個突變位點進(jìn)行酶切分型。
由圖2可知,PBD-124基因產(chǎn)物片段大小約為700 bp,與預(yù)期一致,可用于下一步酶切。 由圖3可知,豬PBD-124基因存在3種基因型:GG(700 bp)、GA(700/500/200 bp)和AA(500/200 bp),該基因CDS區(qū)第257 bp處存在突變c.257G>A,引起了BlnⅠ限制性核酸內(nèi)切酶的存在與丟失。
M,DL2000 DNA Marker;D1、D2,大白豬PBD-124基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M1、M2,民豬PBD-124基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;WI,野雜豬PBD-124基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M,DL2000 DNA Marker;D1 and D2,PCR amplification products of PBD-124 gene in Large White pigs;M1 and M2,PCR amplification products of PBD-124 gene in Min pigs;W1,PCR amplification products of PBD-124 gene in wild hybrid pigs圖1 不同品種豬PBD-124基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification of PBD-124 gene from different pig populations
M,DL2000 Plus DNA Marker;1~4,PBD-124基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M,DL2000 Plus DNA Marker;1-4,PCR amplification products of PBD-124 gene圖2 豬PBD-124基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of PBD-124 gene in pigs
M,DL2000 Plus DNA Marker;1、9、11、12、16、18-24,AA基因型;3、4、13,GG基因型;2、5~8、10、14、15、17,AG基因型M,DL2000 Plus DNA Marker;1,9,11,12,16 and 18-24,AA genotype;3,4 and 13,GG genotype;2,5-8,10,14 ,15 and 17,AG genotype圖3 PBD-124基因Bln Ⅰ酶切結(jié)果Fig.3 Results of PBD-124 gene digested with Bln Ⅰ
對96頭豬做PCR-RFLP酶切,統(tǒng)計分析各個品種豬的基因型頻率和等位基因頻率,結(jié)果見表2。由表2可知,大白豬群體中檢測出AA、AG和GG 3種基因型,基因型頻率分別為0.5161、0.3256和0.1613;而民豬和野雜豬群體中僅檢測出AA和AG 2種基因型,基因型頻率分別為0.9412、0.6542和0.0588、0.3548。3個品種中優(yōu)勢等位基因均為A,該位點均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。3個群體中AA、AG和GG的總基因型頻率分別為0.698、 0.400和0.520,經(jīng)卡方檢驗計算,按自由度=2,查表得知該位點在總?cè)后w中符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),達(dá)到了遺傳平衡。
由表3可知,在3個品種中大白豬的遺傳雜合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量均高于民豬和野雜豬,處于中度多態(tài)(0.25 表2 PBD-124基因Bln Ⅰ酶切位點的基因型頻率和基因頻率 表3 豬PBD-124基因的遺傳多樣性指標(biāo) 由表4可知,PBD-124基因在大白豬血液中的表達(dá)量顯著高于肝臟和脾臟(P<0.05),肝臟中的表達(dá)量略高于脾臟,但差異不顯著(P>0.05);在民豬和野雜豬不同組織間PBD-124基因表達(dá)量均存在顯著差異(P<0.05)。PBD-124基因在民豬脾臟中的表達(dá)量顯著高于大白豬和野雜豬(P<0.05),野雜豬的表達(dá)量略高于大白豬,但差異不顯著(P>0.05);在3個品種豬肝臟中的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05);在大白豬血液中的表達(dá)量顯著高于民豬和野雜豬(P<0.05),在民豬中的表達(dá)量高于野雜豬,但差異不顯著(P>0.05)。 表4 PBD-124基因在3個品種豬各組織中的相對表達(dá)量 研究表明,AMPs作為機(jī)體抵御外源微生物的第一道防線,廣泛分布于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲、兩棲類及脊椎動物中[12]。防御素家族作為一類重要的AMPs,在哺乳動物中最為豐富,研究也較為透徹,其中β-防御素分布最廣,在所有脊椎動物中均有發(fā)現(xiàn),α-防御素則存在于大部分哺乳動物中,而θ-防御素只存在于靈長類動物中。目前,在人基因組中已發(fā)現(xiàn)6種α-防御素和39種β-防御素[8];在牛和豬基因組中發(fā)現(xiàn)了至少57和31個編碼β-防御素的基因[9];在雞基因組中含有14種β-防御素,未發(fā)現(xiàn)α-防御素基因,說明不同物種防御素基因在天然免疫系統(tǒng)構(gòu)建中的作用不盡相同。本試驗通過RT-PCR方法成功獲得豬PBD-124基因CDS序列,并證實不同遺傳背景群體不同組織中該基因表達(dá)量存在差異,為進(jìn)一步研究其功能及在豬抗病表型中的作用奠定基礎(chǔ)。 目前,在豬基因組中所預(yù)測的β-防御素基因家族成員眾多,僅有少部分基因結(jié)構(gòu)功能得到驗證。本實驗室前期參照GenBank數(shù)據(jù)庫中預(yù)測序列設(shè)計擴(kuò)增引物,嘗試從外周血、肝臟和脾臟組織中檢測β-防御素基因表達(dá),結(jié)果顯示,只有包括PBD-124基因在內(nèi)的防御素基因表達(dá),證實β-防御素家族基因存在組織器官表達(dá)特異性(未發(fā)表)。哺乳動物中β-防御素基因高度保守,目前鮮有在基因編碼區(qū)檢測到SNP位點的報道。本試驗在PBD-124基因CDS區(qū)發(fā)現(xiàn)2個SNPs位點,盡管未引起氨基酸位點改變,但其在不同品種群體中存在不同頻率的遺傳多樣性,且遵循Hardy-Weinberg平衡定律,說明該SNP位點并未受到較強(qiáng)的選擇壓力。研究表明,機(jī)體受到多種病原感染或病理條件下可激活防御素基因表達(dá)。本試驗中,3個品種豬的脾臟、肝臟和血液中均有PBD-124基因的表達(dá)且表達(dá)量各不相同,提示其可能參與黏膜和全身免疫構(gòu)建[13]。血常規(guī)和抗體滴度檢測證實野雜豬、民豬較大白豬具有更強(qiáng)的抵抗能力[14-15],3個群體豬PBD-124基因表達(dá)模式存在一定差異,可能是3個群體豬所處外界環(huán)境不同所引起的,或者主要由于遺傳差異所決定,仍有待于進(jìn)一步研究。 盡管β-防御素存在結(jié)構(gòu)功能的高度保守性,但越來越多的研究證實,β-防御素存在抗菌[16]、抗寄生蟲[17]、抗病毒、抗炎[18]及調(diào)節(jié)免疫等多種功能,因其抗菌的廣譜性和低耐藥性,使其成為具有潛在應(yīng)用價值的抗生素替代品[19]。挖掘出包括β-防御素在內(nèi)的具有廣譜高效抗菌活性的AMPs類物質(zhì),對提高豬群健康水平具有重要的意義,也是未來重要的研究方向。研究表明,不同品種豬自身免疫與抗菌能力也有所差異。本試驗中,脾臟、肝臟和血液中PBD-124基因表達(dá)趨勢在3個品種豬中各不相同,這與劉艷光等[20-21]研究結(jié)果相似,但具體原因尚不明確。在民豬和野雜豬免疫器官脾臟和肝臟中PBD-124基因的表達(dá)量多于大白豬,這可能與民豬和野雜豬比大白豬具有更強(qiáng)的抗逆能力有關(guān)。本試驗進(jìn)一步證實了防御素廣泛分布在哺乳動物全身的各個器官組織中[8],對于抵抗外界病原體、調(diào)節(jié)自身免疫、促進(jìn)生長發(fā)育有一定功能[22]??股氐拇罅渴褂眉觿×藵撛诘娜蚬残l(wèi)生危機(jī)[23]。為了減少抗菌素耐藥性的出現(xiàn),需采取措施減少動物生產(chǎn)中抗生素的使用。AMPs存在于各種生命形式中,并在先天免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用,由于其抵抗病原體和微生物的能力,已被開發(fā)為維持腸道健康和減少抗生素使用的新戰(zhàn)略[24]。本試驗結(jié)果可為研究PBD-124基因在豬β-防御素先天免疫系統(tǒng)中的作用,以及為進(jìn)一步完善AMPs作為抗生素替代品的抗菌、抗病毒作用提供參考。 本試驗成功克隆豬PBD-124基因CDS區(qū),發(fā)現(xiàn)c.257 G>A和c.263 T>G 2個突變位點,因2個突變位點間隔過近,可能存在連鎖,僅對第1個突變位點進(jìn)行酶切;PCR-RFLP酶切發(fā)現(xiàn)大白豬中存在GG、GA、AA 3種基因型,而民豬和野雜豬僅檢測到GA和AA 2種基因型;3個品種豬的脾臟、肝臟和血液中均有PBD-124基因的表達(dá)且存在表達(dá)差異,提示該基因可能參與機(jī)體先天免疫功能的構(gòu)建。2.4 PBD-124基因在不同品種豬不同組織中的相對表達(dá)量
3 討 論
4 結(jié) 論