高倍瑤，劉艷光，賈 琪，柳儉強(qiáng)，羅新惠，張立春

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春 130000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物生物技術(shù)研究所，公主嶺 136100；3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 130021)

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)又稱宿主防御肽或抗微生物肽，是一類宿主經(jīng)病原微生物誘導(dǎo)所分泌且能夠?qū)共≡w的小分子多肽[1]。在過去的幾十年里，AMPs因其對細(xì)菌、真菌及病毒具有獨特的抗菌活性能有效降低細(xì)菌耐藥性，具有生物相容性，具有成為新型治療藥物替代品的廣闊發(fā)展前景[2-4]。AMPs的產(chǎn)生是宿主和病原在自然界長期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，動物體內(nèi)的AMPs主要由吞噬細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生，并通過蛋白質(zhì)水解作用形成具有生物活性的成熟肽。成熟的AMPs具有廣泛的抗病原體譜系[5]，對自然界的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲、病毒及腫瘤細(xì)胞的天然免疫都起著重要作用[6]。防御素是廣泛分布于動物、植物、昆蟲體內(nèi)具有6個半胱氨酸殘基和3個分子鏈間二硫鍵的陽離子內(nèi)源性AMPs[7]，在牛、馬、羊、豬、鹿及駱駝等家畜體內(nèi)廣泛表達(dá)[8]。根據(jù)半胱氨酸殘基之間的不同聯(lián)系，哺乳動物防御素可分為α、β和θ 3種，從進(jìn)化的角度來看，β-防御素是最古老的防御素[3]。在豬體內(nèi)，僅發(fā)現(xiàn)了β-防御素[9]且表達(dá)極為廣泛，Choi等[10]在豬的消化道、呼吸道、脾臟、淋巴結(jié)、腦、心臟、肝臟、腎臟、膀胱、睪丸、皮膚、肌肉、骨髓、外周血、嗜中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞以及臍帶中均檢測到豬β-防御素-1(porcine beta-defensin-1，PBD-1)mRNA表達(dá)。β-防御素因其在豬體內(nèi)廣泛表達(dá)和其對微生物的廣譜抗性、調(diào)節(jié)先天免疫的能力，具有開發(fā)成為良好的外源性抗生素替代品的潛質(zhì)[11]，是目前研究最深入、廣泛的一類防御素，目前已發(fā)現(xiàn)了29種PBD[10]，但并未發(fā)現(xiàn)針對豬PBD-124基因的報道。鑒于此，本試驗以大白豬、民豬和野雜豬3個群體為研究對象，采用RT-PCR方法擴(kuò)增并克隆PBD-124基因；利用PCR-RFLP限制性核酸內(nèi)切酶BlnⅠ對突變位點進(jìn)行酶切，檢測該基因的多態(tài)性；利用實時熒光定量PCR方法檢測該基因在不同品種豬組織中的差異表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步探究PDB-124基因的生物學(xué)功能及免疫防御相關(guān)的候選基因提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于吉林省白山市隆興牧業(yè)有限公司興降豬場選取野雜豬31頭(民豬與野豬雜交豬，含75%長白山野豬血統(tǒng));于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院民豬保種場民豬34頭;于四平紅嘴集團(tuán)梨樹種豬場選取純種大白豬31頭，3個品種豬均為5～6月齡。采集3個品種96頭豬血樣，用抗凝血管收集，-20 ℃保存?zhèn)溆?。屠宰后取肝臟和脾臟，用滅菌剪刀剪成小塊，放入凍存管并做好標(biāo)記，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

Blood Genomic DNA提取試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；PrimeScript?RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×ESTaqMasterMix 均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Gel Extraction Kit膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司。Light Cycler 480 SYBR Green Ⅰ Master和實時熒光定量PCR儀均購自羅氏公司；梯度PCR儀購自北京博輝生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中PBD-124基因mRNA預(yù)測序列(登錄號：XM_013983105)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物擴(kuò)增PBD-124基因CDS區(qū)；根據(jù)PBD-124基因突變位點，利用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計PCR-RFLP酶切引物和實時熒光定量PCR引物，以豬HPRT1為內(nèi)參基因，引物信息見表1。 引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 豬PBD-124基因克隆及測序

1.4.1 DNA、總RNA提取及cDNA合成 按照Blood Genomic DNA試劑盒說明書提取3個品種豬血液基因組DNA。采用Trizol法提取3個品種豬肝臟、脾臟和血液總RNA，采用Quawell-Q5000超微量分光光度計對純度及濃度進(jìn)行檢測。參照PrimeScript?RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明進(jìn)行cDNA合成，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR擴(kuò)增、克隆及測序分析 以3個品種豬cDNA為模板，擴(kuò)增PBD-124基因CDS區(qū)。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×EsTaqMasterMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，參照Gel Extraction Kit膠回收試劑盒切膠回收，取回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，連接體系10 μL：回收產(chǎn)物4.5 μL，pMD18-T載體0.5 μL，Solution 5 μL。16 ℃連接1 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入450 μL LB培養(yǎng)液(不含AMP+)置于37 ℃搖床220 r/min震蕩培養(yǎng)45 min使菌體復(fù)蘇，取200 μL復(fù)蘇菌液用一次性涂布棒均勻涂在固體LB平板上(含AMP+)，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h，挑取單個菌落置于1 L液體LB(含AMP+)中37 ℃搖床220 r/min震蕩培養(yǎng)10 h。取鑒定正確的陽性克隆產(chǎn)物送測，并對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.5 PCR-RFLP法檢測豬PBD-124基因多態(tài)性

以3個品種豬所提取的DNA為模板，根據(jù)PCR-RFLP所設(shè)計的引物進(jìn)行PBD-124基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×EsTaqMasterMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用限制性內(nèi)切酶BlnⅠ對豬PBD-124基因目的片段進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系10 μL：BlnⅠ 0.5 μL，10×K Buffer 1 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。37 ℃水浴4 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型檢測。

1.6 遺傳多樣性分析

分析PBD-124基因不同基因型的基因頻率和基因型頻率，計算遺傳純合度(Ho)、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)，通過卡方檢驗分析基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

1.7 實時熒光定量PCR檢測不同品種豬不同組織中PBD-124基因的表達(dá)

采用實時熒光定量PCR檢測PBD-124基因在大白豬、民豬和野雜豬的肝臟、脾臟和血液中的表達(dá)情況，并比較相同組織不同品種和相同品種不同組織間的差異表達(dá)。 PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×SYBR Premix Dimer Eraser 10 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸35 s，共45 個循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃遞增到97 ℃最后降到40 ℃保存。每組試驗重復(fù)3次，采用2-△△Ct方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采取t檢驗，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 PBD-124基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增及測序

以野雜豬、民豬和大白豬的血液cDNA為模板，PCR產(chǎn)物片段大小約500 bp(圖1)，與預(yù)期相符?？寺y序發(fā)現(xiàn)，目的條帶全長500 bp；BLASTN比對發(fā)現(xiàn)，該片段與PBD-124基因預(yù)測mRNA序列(登錄號：XM_013983105)高度同源，其中，包含完整CDS序列423 bp，共編碼140個氨基酸。序列比對發(fā)現(xiàn)，PBD-124基因存在2個突變位點：c.257 G>A和c.263 T>C，但均沒有引起氨基酸的改變。因2個突變位點間隔過近，可能存在連鎖，僅對第1個突變位點進(jìn)行酶切分型。

2.2 PBD-124基因PCR-RFLP酶切分型

由圖2可知，PBD-124基因產(chǎn)物片段大小約為700 bp，與預(yù)期一致，可用于下一步酶切。 由圖3可知，豬PBD-124基因存在3種基因型：GG(700 bp)、GA(700/500/200 bp)和AA(500/200 bp)，該基因CDS區(qū)第257 bp處存在突變c.257G>A，引起了BlnⅠ限制性核酸內(nèi)切酶的存在與丟失。

M，DL2000 DNA Marker；D1、D2，大白豬PBD-124基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M1、M2，民豬PBD-124基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；WI，野雜豬PBD-124基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M，DL2000 DNA Marker；D1 and D2，PCR amplification products of PBD-124 gene in Large White pigs；M1 and M2,PCR amplification products of PBD-124 gene in Min pigs;W1,PCR amplification products of PBD-124 gene in wild hybrid pigs圖1 不同品種豬PBD-124基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification of PBD-124 gene from different pig populations

M，DL2000 Plus DNA Marker；1～4，PBD-124基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M，DL2000 Plus DNA Marker；1-4，PCR amplification products of PBD-124 gene圖2 豬PBD-124基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of PBD-124 gene in pigs

M，DL2000 Plus DNA Marker；1、9、11、12、16、18-24，AA基因型；3、4、13，GG基因型；2、5～8、10、14、15、17，AG基因型M，DL2000 Plus DNA Marker；1,9,11,12,16 and 18-24，AA genotype；3,4 and 13，GG genotype；2,5-8,10，14 ，15 and 17，AG genotype圖3 PBD-124基因Bln Ⅰ酶切結(jié)果Fig.3 Results of PBD-124 gene digested with Bln Ⅰ

2.3 遺傳多樣性分析

對96頭豬做PCR-RFLP酶切，統(tǒng)計分析各個品種豬的基因型頻率和等位基因頻率，結(jié)果見表2。由表2可知，大白豬群體中檢測出AA、AG和GG 3種基因型，基因型頻率分別為0.5161、0.3256和0.1613；而民豬和野雜豬群體中僅檢測出AA和AG 2種基因型，基因型頻率分別為0.9412、0.6542和0.0588、0.3548。3個品種中優(yōu)勢等位基因均為A，該位點均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。3個群體中AA、AG和GG的總基因型頻率分別為0.698、 0.400和0.520，經(jīng)卡方檢驗計算，按自由度=2，查表得知該位點在總?cè)后w中符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，達(dá)到了遺傳平衡。

由表3可知，在3個品種中大白豬的遺傳雜合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量均高于民豬和野雜豬，處于中度多態(tài)(0.25

表2 PBD-124基因Bln Ⅰ酶切位點的基因型頻率和基因頻率

表3 豬PBD-124基因的遺傳多樣性指標(biāo)

2.4 PBD-124基因在不同品種豬不同組織中的相對表達(dá)量

由表4可知，PBD-124基因在大白豬血液中的表達(dá)量顯著高于肝臟和脾臟(P<0.05)，肝臟中的表達(dá)量略高于脾臟，但差異不顯著(P>0.05)；在民豬和野雜豬不同組織間PBD-124基因表達(dá)量均存在顯著差異(P<0.05)。PBD-124基因在民豬脾臟中的表達(dá)量顯著高于大白豬和野雜豬(P<0.05),野雜豬的表達(dá)量略高于大白豬，但差異不顯著(P>0.05)；在3個品種豬肝臟中的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)；在大白豬血液中的表達(dá)量顯著高于民豬和野雜豬(P<0.05)，在民豬中的表達(dá)量高于野雜豬，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 PBD-124基因在3個品種豬各組織中的相對表達(dá)量

3 討 論

研究表明，AMPs作為機(jī)體抵御外源微生物的第一道防線，廣泛分布于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲、兩棲類及脊椎動物中[12]。防御素家族作為一類重要的AMPs，在哺乳動物中最為豐富，研究也較為透徹，其中β-防御素分布最廣，在所有脊椎動物中均有發(fā)現(xiàn)，α-防御素則存在于大部分哺乳動物中，而θ-防御素只存在于靈長類動物中。目前，在人基因組中已發(fā)現(xiàn)6種α-防御素和39種β-防御素[8]；在牛和豬基因組中發(fā)現(xiàn)了至少57和31個編碼β-防御素的基因[9]；在雞基因組中含有14種β-防御素，未發(fā)現(xiàn)α-防御素基因，說明不同物種防御素基因在天然免疫系統(tǒng)構(gòu)建中的作用不盡相同。本試驗通過RT-PCR方法成功獲得豬PBD-124基因CDS序列，并證實不同遺傳背景群體不同組織中該基因表達(dá)量存在差異，為進(jìn)一步研究其功能及在豬抗病表型中的作用奠定基礎(chǔ)。

目前，在豬基因組中所預(yù)測的β-防御素基因家族成員眾多，僅有少部分基因結(jié)構(gòu)功能得到驗證。本實驗室前期參照GenBank數(shù)據(jù)庫中預(yù)測序列設(shè)計擴(kuò)增引物，嘗試從外周血、肝臟和脾臟組織中檢測β-防御素基因表達(dá)，結(jié)果顯示，只有包括PBD-124基因在內(nèi)的防御素基因表達(dá)，證實β-防御素家族基因存在組織器官表達(dá)特異性(未發(fā)表)。哺乳動物中β-防御素基因高度保守，目前鮮有在基因編碼區(qū)檢測到SNP位點的報道。本試驗在PBD-124基因CDS區(qū)發(fā)現(xiàn)2個SNPs位點，盡管未引起氨基酸位點改變，但其在不同品種群體中存在不同頻率的遺傳多樣性，且遵循Hardy-Weinberg平衡定律，說明該SNP位點并未受到較強(qiáng)的選擇壓力。研究表明，機(jī)體受到多種病原感染或病理條件下可激活防御素基因表達(dá)。本試驗中，3個品種豬的脾臟、肝臟和血液中均有PBD-124基因的表達(dá)且表達(dá)量各不相同，提示其可能參與黏膜和全身免疫構(gòu)建[13]。血常規(guī)和抗體滴度檢測證實野雜豬、民豬較大白豬具有更強(qiáng)的抵抗能力[14-15]，3個群體豬PBD-124基因表達(dá)模式存在一定差異，可能是3個群體豬所處外界環(huán)境不同所引起的，或者主要由于遺傳差異所決定，仍有待于進(jìn)一步研究。

盡管β-防御素存在結(jié)構(gòu)功能的高度保守性，但越來越多的研究證實，β-防御素存在抗菌[16]、抗寄生蟲[17]、抗病毒、抗炎[18]及調(diào)節(jié)免疫等多種功能，因其抗菌的廣譜性和低耐藥性，使其成為具有潛在應(yīng)用價值的抗生素替代品[19]。挖掘出包括β-防御素在內(nèi)的具有廣譜高效抗菌活性的AMPs類物質(zhì)，對提高豬群健康水平具有重要的意義，也是未來重要的研究方向。研究表明，不同品種豬自身免疫與抗菌能力也有所差異。本試驗中，脾臟、肝臟和血液中PBD-124基因表達(dá)趨勢在3個品種豬中各不相同，這與劉艷光等[20-21]研究結(jié)果相似，但具體原因尚不明確。在民豬和野雜豬免疫器官脾臟和肝臟中PBD-124基因的表達(dá)量多于大白豬，這可能與民豬和野雜豬比大白豬具有更強(qiáng)的抗逆能力有關(guān)。本試驗進(jìn)一步證實了防御素廣泛分布在哺乳動物全身的各個器官組織中[8]，對于抵抗外界病原體、調(diào)節(jié)自身免疫、促進(jìn)生長發(fā)育有一定功能[22]?？股氐拇罅渴褂眉觿×藵撛诘娜蚬残l(wèi)生危機(jī)[23]。為了減少抗菌素耐藥性的出現(xiàn)，需采取措施減少動物生產(chǎn)中抗生素的使用。AMPs存在于各種生命形式中，并在先天免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，由于其抵抗病原體和微生物的能力，已被開發(fā)為維持腸道健康和減少抗生素使用的新戰(zhàn)略[24]。本試驗結(jié)果可為研究PBD-124基因在豬β-防御素先天免疫系統(tǒng)中的作用，以及為進(jìn)一步完善AMPs作為抗生素替代品的抗菌、抗病毒作用提供參考。

4 結(jié) 論

本試驗成功克隆豬PBD-124基因CDS區(qū)，發(fā)現(xiàn)c.257 G>A和c.263 T>G 2個突變位點，因2個突變位點間隔過近，可能存在連鎖，僅對第1個突變位點進(jìn)行酶切；PCR-RFLP酶切發(fā)現(xiàn)大白豬中存在GG、GA、AA 3種基因型，而民豬和野雜豬僅檢測到GA和AA 2種基因型；3個品種豬的脾臟、肝臟和血液中均有PBD-124基因的表達(dá)且存在表達(dá)差異，提示該基因可能參與機(jī)體先天免疫功能的構(gòu)建。