王梽名，王宇豪，顧以韌，龍科任，李明洲，金 龍

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川省畜牧科學(xué)研究院動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066)

脂肪沉積影響著豬肉的品質(zhì)和生長(zhǎng)效率，在豬生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的意義。脂肪沉積依賴脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加和體積的增大，而脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴不斷聚集融合可使其體積增大[1]，因此解析成脂分化的分子機(jī)制對(duì)于調(diào)控豬脂肪沉積、改善豬肉品質(zhì)以及畜牧業(yè)的生產(chǎn)有著非常重要的意義。

microRNA(miRNA)是一種具有調(diào)控基因表達(dá)功能的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度約為20～22 nt[2]。第一個(gè)被描述與脂肪生成相關(guān)的miRNA 是miR-143，它通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK5)調(diào)節(jié)脂肪生成[3]。隨著研究的深入，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)參與脂肪生成，如miR-103、miR-30c和miR-375均可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[4-6]；而miR-244和miR-155均可抑制脂肪細(xì)胞分化[7-9]。miR-181家族的5個(gè)成員(miR-181a-1/2、miR-181b-1/2和miR-181d-5p)在大網(wǎng)膜組織中高度富集，這個(gè)家族對(duì)B細(xì)胞和T細(xì)胞的產(chǎn)生與發(fā)育都很重要，與炎癥的產(chǎn)生息息相關(guān)[10]。顧以韌等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a在豬脂肪組織中存在特異性高表達(dá)，Li等[12]研究也指出，miR-181a能夠抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)蛋白表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)脂肪細(xì)胞成脂分化的目的。Jing等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂喂養(yǎng)的小鼠中miR-181d-5p特異性高表達(dá)，推測(cè)其可能與脂肪調(diào)控有關(guān)；Zhang等[14]研究結(jié)果表明，miR-181a通過直接靶向瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞科V成員1(TGFBR1)促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。

鑒于miR-181a和miR-181d-5p在脂肪組織中特異性高表達(dá)[10-15]，但是缺乏對(duì)后續(xù)調(diào)控機(jī)制的深入探究，且未在豬的脂肪細(xì)胞上進(jìn)行功能驗(yàn)證，本研究利用生物學(xué)信息方法預(yù)測(cè)miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其對(duì)脂肪分化調(diào)控基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)表達(dá)的影響，雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證其結(jié)合位點(diǎn)，研究miR-181a和miR-181d-5p對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞分化的影響，以期為提高豬肉的生產(chǎn)性能提供參考，對(duì)畜牧業(yè)動(dòng)物新品種培育具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 于四川省畜牧科學(xué)研究院隨機(jī)選取3只7日齡雄性榮昌豬為試驗(yàn)動(dòng)物，放血處死后迅速采取腿部肌肉和背部皮下脂肪組織樣品，腿部肌肉和一部分背部皮下脂肪組織立即置于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆?；另一部分背部皮下脂肪組織用于分離脂肪細(xì)胞。本試驗(yàn)的所有動(dòng)物試驗(yàn)都經(jīng)過四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑及儀器 地塞米松和重組牛胰島素購自MCE公司；IBMX購自上海Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗(青-鏈霉素)、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、胎牛血清(FBS)等均購自Gibco公司；雙熒光素酶試劑盒購自Promega公司；miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和HiScript?ⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taqpro Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒均購自諾唯贊生物科技股份有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96)購自Bio-Rad公司。

1.1.3 生物材料合成 根據(jù)miRbase上miRNA的序列，運(yùn)用化學(xué)方法合成本試驗(yàn)所用模擬物：miRNA mimics、inhibitor、陰性對(duì)照(NC)及靶基因siRNA均由生工生物工程(上海)有限公司合成；pmirGLO質(zhì)粒載體購自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-181a和miR-181d-5p序列保守性分析 通過在miRBase(https:∥www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫下載豬、人、大鼠和小鼠的miR-181a與miR-181d-5p的序列，通過對(duì)各物種miRNA的種子序列(5′-端第2～8位堿基)進(jìn)行比對(duì)，分析其序列保守性。

1.2.2 miR-181a和miR-181d-5p在肌肉和背部皮下脂肪組織的表達(dá) 參考NCBI和miRBase數(shù)據(jù)庫中miR-181a、miR-181d-5p的序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根據(jù)Trizol法提取背部皮下脂肪、腿肌組織的總RNA，使用miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒和HiScript?ⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以U6為內(nèi)參，根據(jù)TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系10 μL：Premix ExTaqⅡ 5.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，RNase-free ddH2O補(bǔ)至10 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，共35個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

1.2.3 miR-181a和miR-181d-5p靶基因篩選 采用miRandn(http:∥mirdb.org/)和TargetScan[16](http:∥www.targetscan.org/vert_70/)2個(gè)miRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測(cè)到的靶基因取交集以降低預(yù)測(cè)結(jié)果的假陽性，對(duì)獲得的靶基因使用在線工具M(jìn)etascape(https:∥bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)進(jìn)行GO功能和KEGG通路注釋。挑選與脂肪代謝相關(guān)的靶基因運(yùn)用RNAhybrid[17]在線軟件(http:∥metascape.org/gp/index.html#/main/step1)預(yù)測(cè)miRNA與靶基因的結(jié)合自由能，并將結(jié)合自由能<-87.8 kJ/mol的靶基因列為潛在靶基因。

1.2.4 miR-181a和miR-181d-5p與靶基因的靶向關(guān)系驗(yàn)證

1.2.4.1 靶基因載體構(gòu)建 以pmirGLO為質(zhì)粒載體，分別構(gòu)建miR-181a和miR-181d-5p靶基因的野生型及突變型雙熒光素酶載體，GPD2 3′-UTR 野生型質(zhì)粒載體(GPD2-WT)和GPD2 3′-UTR突變型質(zhì)粒載體(GPD2-MUT)；CREB1 3′-UTR 野生型質(zhì)粒載體(CREB1-WT)和CREB1 3′-UTR突變型質(zhì)粒載體(CREB1-MUT)。

1.2.4.2 豬前脂肪細(xì)胞的分離 將背部皮下脂肪用眼科剪剪成1 mm3大小之后用0.1%Ⅰ型膠原酶于37 ℃水浴消化70 min，之后將消化液過篩(70目)，過篩后置于離心管中1 200×g離心10 min，去掉上層漂浮的成熟脂肪細(xì)胞，過細(xì)胞篩后采用DMEM高糖培養(yǎng)基(DMEM+4% 雙抗)重懸細(xì)胞。再次離心10 min后采用含有10%的胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+1% 雙抗)重懸細(xì)胞。 將處理好的細(xì)胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4.3 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn) 將分離的原代豬前脂肪細(xì)胞分為4組進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。 按照LipofectamineTM3000試劑盒方法分別將miR-181a mimics+GPD2-WT、miR-181a NC+GPD2-WT、miR-181a mimics+GPD2-MUT和miR-181a NC+GPD2-MUT共轉(zhuǎn)染進(jìn)培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中,同理miR-181d-5p和靶基因CREB1也以同樣的方式轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞。具體轉(zhuǎn)染方法：當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，在5 μL的opti-MEMTM中加入0.1 μg重組質(zhì)粒和0.2 μL P3000試劑，混勻后形成A液靜置5 min。然后在5 μL的opti-MEMTM中加入1.5 μL LipofectamineTM3000和1 μL miRNA溶液，混勻后形成B液靜置5 min，并將上述A和B 2種溶液混勻后靜置15 min。將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為DMEM，加入混合的溶液后，在培養(yǎng)箱中孵育6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。36 h后根據(jù)雙熒光素酶試劑盒操作說明對(duì)轉(zhuǎn)染的前體脂肪細(xì)胞熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 豬前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中miR-181a和miR-181d-5p及其靶基因與成脂分化相關(guān)基因的表達(dá)變化 當(dāng)分離的前脂肪細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，將完全培養(yǎng)液替換為誘導(dǎo)液(DMEM+10% FBS+1.7 μmol/L胰島素+1 μmol/L地塞米松+0.5 μmol/L IBMX)；3 d后，將誘導(dǎo)液替換為維持液(DMEM+10% FBS+1.7 μmol/L胰島素)；3 d后，維持液替換為完全培養(yǎng)液，以培養(yǎng)液更換誘導(dǎo)液日期為第0天，分別收取誘導(dǎo)0、2、4和6 d的脂肪細(xì)胞提取總RNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miR-181a和miR-181d-5p及其靶基因的表達(dá)變化。參考NCBI和miRBase數(shù)據(jù)庫中CREB1、GPD2、PPARγ、C/EBPα和GAPDH基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法同1.2.2。

1.2.6 miR-181a和miR-181d-5p在脂肪細(xì)胞中的功能驗(yàn)證

1.2.6.1 miR-181a和miR-181d-5p轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞 將生長(zhǎng)良好的脂肪細(xì)胞以1.5×105/cm2的密度接種到24孔板中，培養(yǎng)24 h，在細(xì)胞匯合達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics、miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor、miR-181a NC、miR-181d-5p NC、miR-181a siRNA、miR-181d-5p siRNA 8組，具體方法同1.2.4.3。誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)染6 d后提取細(xì)胞RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，具體方法同1.2.2。

1.2.6.2 油紅O染色誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞 使用PBS清洗分別轉(zhuǎn)染mimics、inhibitor、siRNA以及空白對(duì)照組且已經(jīng)誘導(dǎo)6 d的脂肪細(xì)胞，隨后于室溫下用4%多聚甲醛固定30 min。去掉多聚甲醛，PBS清洗3遍，每遍5 min，之后用油紅O試劑室溫下孵育細(xì)胞30min。然后去掉油紅O試劑后用PBS清洗3遍，每遍5 min，最后每孔加入200 μL PBS將油紅O著色后的細(xì)胞覆蓋，于顯微鏡下觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 22.0軟件進(jìn)行Student’s t-test分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 序列保守分析

通過比對(duì)各物種miRNA的種子序列，發(fā)現(xiàn)miR-181a與miR-181d-5p在豬、人、大鼠和小鼠間具有高度序列保守性(表2)。

2.2 miR-181a和miR-181d-5p在豬肌肉和背部皮下脂肪組織中的表達(dá)量

由圖1可知，miR-181a在背部皮下脂肪組織中的表達(dá)量極顯著高于肌肉組織(P<0.01)；miR-181d-5p在背部皮下脂肪組織中的表達(dá)量顯著高于肌肉組織(P<0.05)。

2.3 miR-181a和miR-181d-5p靶基因篩選

通過數(shù)據(jù)庫共預(yù)測(cè)到381個(gè)miR-181a潛在靶基因和486個(gè)miR-181d-5p的潛在靶基因。對(duì)這些基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路注釋發(fā)現(xiàn)，miR-181a和miR-181d-5p潛在靶基因主要涉及細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、RNA聚合酶Ⅱ特異性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)磷酸化以及脂質(zhì)代謝等方面。共篩選出27個(gè)與成脂分化相關(guān)的靶基因，結(jié)合miRNA與靶基因的結(jié)合自由能分析結(jié)果，最終確定miR-181a的靶基因?yàn)榻Y(jié)合自由能為-107.9 kJ/mol的甘油-3-磷酸脫氫酶2(GPD2)基因；miR-181d-5p的靶基因?yàn)榻Y(jié)合自由能為-107.9 kJ/mol的 CAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白1(CREB1)基因(圖2)。

2.4 miRNA與預(yù)測(cè)基因靶標(biāo)關(guān)系驗(yàn)證

通過材料方法中的生物信息分析軟件，預(yù)測(cè)miR-181a和miR-181d-5p與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染的miR-181a-WT+GPD2-WT野生型載體組的細(xì)胞中熒光素酶的活性極顯著低于共轉(zhuǎn)染的miR-181a-NC+GPD2-WT野生型載體(P<0.01)，共轉(zhuǎn)染的miR-181d-5p-WT+CREB1-WT野生型載體組的細(xì)胞中熒光素酶的活性極顯著低于共轉(zhuǎn)染的miR-181d-5p-NC+CREB1-WT野生型載體(P<0.01)。將共轉(zhuǎn)染miRNA-NC+Gene-MUT與共轉(zhuǎn)染的miRNA-WT+Gene-MUT相比，前體脂肪細(xì)胞中的熒光素酶活性沒有明顯變化。因此，miR-181a和miR-181d-5p可以分別靶向結(jié)合GDP2和CREB1基因3′-UTR區(qū)域序列，抑制GDP2和CREB1基因的表達(dá)(圖3B)。

2.5 miR-181a和miR-181d-5p及其靶基因在豬脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)

由圖4可知，與未分化脂肪細(xì)胞(0 d)相比，miR-181a在分化的第4天顯著升高(P<0.05),到第6天達(dá)到極顯著差異(P<0.01)；miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因在分化的第4、6天均極顯著升高(P<0.01)(圖4)。

表2 miRNA序列的保守性分析

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。圖3同*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.3圖1 miR-181a(A)和miR-181d-5p(B)在肌肉和脂肪組織中表達(dá)Fig.1 Expression of miR-181a (A) and miR-181d-5p (B) in muscle and adipose tissue

A，miR-181a預(yù)測(cè)靶基因功能富集圖；B，miR-181d-5p預(yù)測(cè)靶基因功能富集圖；C，miR-181a與靶基因GPD2結(jié)合自由能；D，miR-181d-5p與靶基因CREB1結(jié)合自由能A,Functional enrichment map of miR-181a prediction target gene;B,Functional enrichment map of miR-181d-5p predicting target gene;C,Binding free energy of miR-181a and target gene GPD2;D,Binding free energy of miR-181d-5p and target gene CREB1圖2 miRNA與靶基因GO和KEGG分析及結(jié)合自由能預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of miRNA and target genes GO and KEGG analysis and binding free energy prediction

A，miRNA與靶基因3′-UTR序列比對(duì)結(jié)果；B、C，雙熒光檢測(cè)結(jié)果A,Sequence alignment result of miRNA and target gene 3′-UTR;B and C,Double fluorescence test results圖3 miRNA靶基因驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 miRNA target gene verification results

①A～D，分別為miR-181a、miR-181d-5p、GPD2和CREB1在脂肪細(xì)胞分化過程中的相對(duì)表達(dá)量。②與對(duì)照組(0 d/NC)相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。下同①A-D,The relative expression levels of miR-181a,miR-181d-5p,GPD2 and CREB1 during adipocyte differentiation,respectively.②Compared with the control group(0 d/NC),*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as below圖4 miRNA及其靶基因在豬脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)Fig.4 Expression of miRNAs and their target genes during porcine adipocyte differentiation

2.6 miR-181a與miR-181d-5p在脂肪細(xì)胞中功能驗(yàn)證

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與NC組相比，mimics組miR-181a與miR-181d-5p表達(dá)量均極顯著上升(P<0.01)，inhibitor組miR-181a與miR-181d-5p表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01)(圖5A、6A)；mimics和siRNA組的GPD2與CREB1基因表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01)，inhibitor組的GPD2與CREB1基因表達(dá)量均極顯著上升(P<0.01)(圖5B、6B)，mimics和siRNA組PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)量均顯著或極顯著上升(P<0.01)，inhibitor組PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)(圖5C、6C)。油紅O染色結(jié)果表明，與NC組相比，mimics和siRNA組細(xì)胞脂滴數(shù)目增加，inhibitor組細(xì)胞脂滴數(shù)目減少(圖5D、6D)。

A，miR-181a在不同處理細(xì)胞中表達(dá)變化；B，GPD2基因在不同處理細(xì)胞中表達(dá)變化；C，成脂分化標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα在不同處理細(xì)胞中表達(dá)變化；D，油紅O染色結(jié)果(100×)A,miR-181a expression changes in different treated cells;B,GPD2 gene expression changes in different treated cells;C,Adipogenic differentiation marker genes PPARγ and C/EBPα expression changes in different treated cells;D,Oil red O staining result (100×)圖5 miR-181a及其靶基因GPD2和成脂分化基因的表達(dá)Fig.5 Expression of miR-181a and its target gene GPD2 and adipogenic differentiation genes

A，miR-181d-5p在不同處理細(xì)胞中表達(dá)變化；B，CREB1基因在不同處理細(xì)胞中表達(dá)變化；C，脂肪分化標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα在不同處理細(xì)胞中表達(dá)變化；D，油紅O染色結(jié)果(100×)A,miR-181d-5p expression changes in different treated cells;B,CREB1 gene expression changes in different treated cells;C,adipose differentiation marker genes PPARγ and C/EBPα expression changes in different treated cells;D,Oil red O staining result (100×)圖6 miR-181d-5p及其靶基因CREB1和成脂分化基因的表達(dá)Fig.6 Expression of miR-181d-5p and its target gene CREB1 and adipogenic differentiation genes

3 討 論

在哺乳動(dòng)物中，miRNA與自身種子序列匹配的靶基因3′-UTR區(qū)域結(jié)合后，通過轉(zhuǎn)錄抑制或降解靶基因的mRNA，從而發(fā)揮作用。miRNA對(duì)豬脂肪細(xì)胞的增殖和分化的調(diào)控已成為近年來的研究熱點(diǎn)。已有研究表明，miRNA在前脂肪細(xì)胞的分化過程中扮演著重要作用[12]。miR-181a和miR-181d-5p屬于miR-181家族，本研究通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，miR-181a和miR-181d-5p在豬、人、大鼠和小鼠物種間高度保守，是重要的miRNA。組織表達(dá)譜結(jié)果顯示，miR-181a和miR-181d-5p在豬皮下脂肪組織中特異性高表達(dá)，且miR-181a和miR-181d-5p在豬脂肪細(xì)胞分化第4天開始大量表達(dá)，表明其在脂質(zhì)生成過程中具有重要作用。 研究表明，miR-181a可通過靶向轉(zhuǎn)錄因子7樣2(TCF7L2)和Smad家族成員7(Smad7)調(diào)節(jié)Wnt和TGF-β/Smad信號(hào)通路，促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂肪生成和分化,并且miR-181a通過靶向C2C12成肌細(xì)胞胰島素信號(hào)通路中的Akt3調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化[18]。Gao等[19]研究表明，miR-181d-5p是多個(gè)細(xì)胞過程中的抑制因子，通過CDKN3/Akt途徑抑制非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。 本研究使用miR-181a和miR-181d-5p的mimics轉(zhuǎn)染豬的前脂肪細(xì)胞，相較于陰性對(duì)照其靶基因GPD2和CREB1表達(dá)量下降，成脂分化標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα表達(dá)量上升，與靶基因siRNA干擾組結(jié)果一致；而miR-181a和miR-181d-5p的inhibitor轉(zhuǎn)染的脂肪細(xì)胞其靶基因GPD2和CREB1表達(dá)量上升，成脂分化標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα表達(dá)量下降，與靶基因siRNA干擾組結(jié)果相反。轉(zhuǎn)染miR-181a和miR-181d-5p mimics與轉(zhuǎn)染靶基因siRNA組脂肪細(xì)胞脂滴數(shù)目均增加，而轉(zhuǎn)染其inhibitor的脂肪細(xì)胞脂滴數(shù)目減少。綜上所述，miR-181a和miR-181d-5p分別結(jié)合靶基因GPD2和CREB1 3′-UTR區(qū)域序列，降低靶基因表達(dá)量，促進(jìn)脂肪細(xì)胞成脂分化。

GPD2基因可編碼線粒體3-磷酸甘油脫氫酶(mGPD)，研究表明mGPD在產(chǎn)熱中起作用[20]。mGPDH和3-磷酸甘油(G3P)?；D(zhuǎn)移酶競(jìng)爭(zhēng)相同的底物，并且由于其在脂肪組織中具有非常高的活性，mGPDH可以顯著影響可用G3P的濃度，進(jìn)而調(diào)控甘油三酯和磷脂的合成，最終對(duì)脂肪細(xì)胞的成脂分化產(chǎn)生影響[21]。Zhou等[22]研究指出,CREB1是一類細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控C/EBPα、C/EBPβ及PPARs基因的表達(dá)，從而抑制脂肪細(xì)胞的分化。Cui等[23]研究發(fā)現(xiàn)，CREB1直接調(diào)控瘦素(LEP)、低密度脂蛋白受體(LDLR)和3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶(HMGCR)等與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因的表達(dá)，表明CREB1在脂質(zhì)代謝過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過GO和KEGG功能注釋發(fā)現(xiàn)，miR-181a的靶基因GPD2涉及生長(zhǎng)發(fā)育、RNA聚合酶Ⅱ特異性以及蛋白質(zhì)磷酸化等多個(gè)與脂質(zhì)代謝功能相關(guān)，miR-181d-5p的靶基因CREB1涉及Wnt信號(hào)通路的調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化以及脂肪代謝等方面，所以可以通過抑制靶基因CREB1的翻譯從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的增殖和分化。通過轉(zhuǎn)染miR-181a與miR-181d-5p的模擬物發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞分化能力增強(qiáng)，脂肪標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα表達(dá)量上升，與靶基因GPD2和CREB1的干擾結(jié)果相似，而轉(zhuǎn)染miR-181a與miR-181d-5p的抑制物則可以抑制脂肪細(xì)胞的分化，脂肪標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα表達(dá)量下降，說明GPD2和CREB1基因在受到miRNA靶向結(jié)合后表達(dá)水平下降，相關(guān)功能受到抑制，最終可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。

研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA可通過靶向調(diào)控重要的成脂分化相關(guān)基因，從而調(diào)控脂肪沉積。如在脂肪細(xì)胞3T3-L1中，miR-139-5p、miR-155、miR-301a和miR-302a可以靶向結(jié)合PPARγ基因，抑制脂肪細(xì)胞分化[9]；miR-185可顯著降低成脂標(biāo)志基因PPARγ、脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)、Fas細(xì)胞表面死亡受體(FAS)、脂蛋白脂肪酶(LPL)等多個(gè)mRNAs的表達(dá)，從而負(fù)向調(diào)控3T3-L1細(xì)胞的分化[24]。對(duì)榮昌豬皮下脂肪進(jìn)行miRNA的測(cè)序分析鑒定出多個(gè)保守miRNA參與豬脂肪生成[25]，如miR-125b-5p抑制皮下脂肪細(xì)胞增殖并促進(jìn)分化；miR-17、miR-21和miR-143促進(jìn)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞細(xì)胞分化；miR-125a通過靶向結(jié)合雌激素相關(guān)受體α(ERRa)抑制豬皮下脂肪細(xì)胞的增殖和分化；miR-375靶向結(jié)合BMPR2抑制豬皮下脂肪細(xì)胞的增殖和分化；miR-196a和miR-33b抑制豬皮下脂肪細(xì)胞分化等。本研究所揭示的miR-181a與miR-181d-5p在脂肪沉積中的功能僅屬復(fù)雜調(diào)控過程中的一環(huán)，但是這些信息將為脂肪沉積發(fā)生和形成的分子機(jī)制解析提供重要線索。

4 結(jié) 論

本研究通過生物信息學(xué)的方法篩選出miR-181a的靶基因GPD2、miR-181d-5p的靶基因CREB1，miR-181a與miR-181d-5p在豬皮下脂肪組織中特異高表達(dá)，且在脂肪細(xì)胞分化過程中可以分別靶向結(jié)合基因GPD2與CREB1的3′-UTR區(qū)域序列，降低GPD2和CREB1基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞成脂分化。