薛 倩，李國輝，邢偉杰，周成浩，張會(huì)永，殷建玫，朱云芬，曹愉夏，蘇一軍，韓 威

(1.江蘇省家禽科學(xué)研究所科技創(chuàng)新有限公司，揚(yáng)州 225125;2.江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125)

近交衰退是指因近交而導(dǎo)致的后代適合度(群體均值)下降的現(xiàn)象[1]。在中國地方雞遺傳資源活體保護(hù)過程中，由于保種群規(guī)模有限，在保種群繼代繁殖過程中其繁殖性狀的近交衰退現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生，嚴(yán)重影響群體的世代延續(xù)。近年來，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在哺乳動(dòng)物和禽類繁殖方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。lncRNA是一類長度>200 nt、缺少蛋白編碼功能的RNA，可從多層面調(diào)控基因表達(dá)，影響表型性狀[2]。在哺乳動(dòng)物中，lncRNA已被證明在性成熟前后小鼠、山羊和湖羊等睪丸組織中存在差異表達(dá)[3-4]，參與雄性生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)控，一些關(guān)鍵lncRNAs如Tsx和ALKBH5可能與雄性不育有關(guān)[5]；MSTRG.42992和MSTRG.52048 2個(gè)lncRNAs可能參與豬卵母細(xì)胞體外成熟調(diào)控[6]。在禽類中，黃子妍等[7]研究雞弱精子癥調(diào)節(jié)機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MSTRG.15568.9可能調(diào)控精子相關(guān)抗原4(sperm associated antigen 4，SPAG4)基因的表達(dá)，參與雞精子發(fā)生和精子活力調(diào)控；任晉東[8]通過研究不同繁殖階段鴨卵巢轉(zhuǎn)錄組差異發(fā)現(xiàn)，lncRNA在鴨產(chǎn)蛋性能調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。因此，不管雄性還是雌性動(dòng)物的繁殖調(diào)控，lncRNA均可在其中發(fā)揮重要作用。

雞繁殖性狀近交衰退調(diào)控是個(gè)復(fù)雜的過程，盡管研究者對(duì)近交衰退分子機(jī)理的研究已較為深入，但關(guān)于雞繁殖性狀近交衰退的調(diào)控機(jī)理少有報(bào)道，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，需要從多角度多層面進(jìn)行研究。本研究從轉(zhuǎn)錄組lncRNA水平探索雞繁殖性狀近交衰退的調(diào)控機(jī)制，篩選雞繁殖性狀近交衰退相關(guān)的lncRNA及其靶基因，以期為深入闡明雞繁殖性狀近交衰退分子調(diào)控機(jī)制提供參考，為物種資源保護(hù)和家禽育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

前期研究中，以江蘇省家禽科學(xué)研究所國家級(jí)地方雞種基因庫狼山雞保種群為素材，組建了狼山雞高、低近交試驗(yàn)群體[9]，高、低近交群體平均開產(chǎn)日齡分別為173和150 d，300 d產(chǎn)蛋數(shù)分別為84和98枚?；谶@2個(gè)試驗(yàn)群體，本研究從高近交群體中選取繁殖性能顯著衰退的健康個(gè)體3只，從低近交群體中選取繁殖性能處于群體平均值附近的個(gè)體3只，300日齡時(shí)快速屠宰并采集其下丘腦和卵巢組織，投入液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA-Seq測序及數(shù)據(jù)質(zhì)控

試驗(yàn)分為4組，分別為：高近交組下丘腦(Sinb_H)、低近交組下丘腦(Winb_H)、高近交組卵巢(Sinb_O)和低近交組卵巢(Winb_O)。使用Trizol法分別提取各組織總RNA，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)等對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，質(zhì)檢合格后，去除核糖體RNA；將RNA片段化，連接上測序接頭；PCR擴(kuò)增構(gòu)建鏈特異性lncRNA測序文庫，測序文庫通過安捷倫生物分析儀2100系統(tǒng)評(píng)價(jià)檢測合格后，使用IlluminaHiseq 4000測序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測序。

對(duì)測序獲得的原始數(shù)據(jù)(raw data)，使用Cutadapt 1.10軟件[10]去除帶接頭、空讀和低質(zhì)量堿基序列，使用FASTQC 0.10.1軟件[11]進(jìn)行質(zhì)量控制，針對(duì)獲得的有效數(shù)據(jù)，采用Hisat 2.0.4軟件[12]將其與參考基因組(GRCg6a:RefSeq GCF_000002315.6)比對(duì)，基于比對(duì)結(jié)果，使用轉(zhuǎn)錄本組裝軟件StringTie 1.3.0[13]對(duì)reads進(jìn)行組裝和定量。

1.3 lncRNA鑒定和差異lncRNA篩選

對(duì)拼接好的轉(zhuǎn)錄本，通過以下步驟進(jìn)行篩選和預(yù)測：①轉(zhuǎn)錄本長度≥200 bp，且包含外顯子數(shù)目≥1；②轉(zhuǎn)錄本覆蓋度≥3；③使用Cuffcompare將其與雞已知的非lncRNA序列(mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、pre-miRNA、Pseudogenes 等)進(jìn)行比對(duì)，去除與以上非lncRNA序列相似或相同的轉(zhuǎn)錄本，并確定剩余轉(zhuǎn)錄本的基因組位置；④利用CPC(coding potential calculator)[14]和CNCI(coding-non-coding index)[15]等軟件對(duì)剩余轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行蛋白編碼潛能預(yù)測，最終獲得無編碼潛能的轉(zhuǎn)錄本被鑒定為lncRNA。采用edgeR軟件[16]進(jìn)行l(wèi)ncRNA差異表達(dá)分析，篩選狼山雞高、低近交組間表達(dá)量差異倍數(shù)≥2(log2|FoldChange|≥1)，且P<0.05的lncRNA為差異lncRNA。

1.4 lncRNA靶基因預(yù)測及其功能分析

lncRNA調(diào)控方式主要分為兩類，一類為順式調(diào)控(cisregulation)，即lncRNA調(diào)控同一染色體上與其鄰近基因的表達(dá)；另一類為反式調(diào)控(transregulation)，即lncRNA跨染色體調(diào)控基因的表達(dá)。本研究中主要對(duì)差異lncRNA順式調(diào)控的靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，將lncRNA上下游100 kb距離的蛋白編碼基因作為其順式作用靶基因，并通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)靶基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，來預(yù)測lncRNA的功能。

2 結(jié) 果

2.1 測序結(jié)果

來自4個(gè)分組的12個(gè)樣本經(jīng)測序質(zhì)控后，下丘腦和卵巢平均每個(gè)樣本分別獲得98.20和96.9 M的有效reads數(shù)，共產(chǎn)生有效數(shù)據(jù)量175.65 Gb，堿基質(zhì)量值Q30均>95%(表1)，測序數(shù)據(jù)可滿足后續(xù)分析要求。

表1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 lncRNA鑒定和特征分析

對(duì)reads進(jìn)行拼接和組裝后，去除已知的mRNA和<200 bp的轉(zhuǎn)錄本，對(duì)余下的轉(zhuǎn)錄本通過CPC、CNCI等軟件進(jìn)行編碼能力預(yù)測，篩選沒有蛋白編碼潛能的轉(zhuǎn)錄本，最終在12個(gè)樣本中共鑒定出4 222個(gè)lncRNAs，占所有轉(zhuǎn)錄本數(shù)量(63 828個(gè))的6.6%。統(tǒng)計(jì)分析lncRNA轉(zhuǎn)錄本長度、外顯子數(shù)和開放閱讀框(ORF)長度等結(jié)構(gòu)特征，并與mRNA進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長度>1 000 bp的lncRNAs占比(64%)顯著低于mRNA(91%)(圖1)；大部分lncRNAs外顯子數(shù)量只有1～3個(gè)，而50%以上的mRNA外顯子數(shù)量在9個(gè)以上(圖2)；lncRNA ORF長度主要分布在100 bp以內(nèi)，而大部分mRNA ORF長度均>100 bp(圖3)。因此，與蛋白編碼基因相比，lncRNA具有序列和ORF長度短、外顯子數(shù)目少的特征。對(duì)lncRNA和mRNA的整體表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)本研究中l(wèi)ncRNA的表達(dá)水平顯著高于mRNA(P<0.05,圖4)。

*,差異顯著(P<0.05)。圖4同*,Significant difference (P<0.05).The same as fig.4圖1 lncRNA和mRNA長度分布Fig.1 Distribution of lncRNA and mRNA length

圖2 lncRNA和mRNA外顯子數(shù)量分布Fig.2 Distribution of lncRNA and mRNA number

圖3 lncRNA(A)和mRNA(B)開放閱讀框長度分布Fig.3 Distribution of lncRNA (A) and mRNA (B) ORF length

圖4 lncRNA和mRNA表達(dá)水平比較Fig.4 Expression comparison of lncRNA and mRNA

2.3 差異lncRNA篩選鑒定

與狼山雞低近交組相比，高近交組下丘腦中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)lncRNAs 35個(gè)(|FoldChange|≥2，P<0.05)，其中上調(diào)21個(gè)，下調(diào)14個(gè)；高近交組卵巢中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)lncRNAs 215個(gè)，其中上調(diào)176個(gè)，下調(diào)39個(gè)(圖5)。下丘腦和卵巢中共同差異表達(dá)的lncRNAs有10個(gè)(圖6)，包括MSTRG.9195.2、MSTRG.4054.1等。對(duì)部分差異lncRNAs表達(dá)水平進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，來自同一個(gè)分組的3個(gè)重復(fù)樣本聚在一起(圖7、8)，驗(yàn)證了試驗(yàn)樣本采集的準(zhǔn)確性。

圖5 下丘腦和卵巢中差異表達(dá)lncRNAsFig.5 Differentially expressed lncRNAs in hypothalamus and ovary

圖6 下丘腦和卵巢中共同差異表達(dá)lncRNAsFig.6 Common differentially expressed lncRNAs in hypothalamus and ovary

所有差異lncRNAs中隨機(jī)挑選35個(gè)做聚類結(jié)果展示。圖8同35 of all differential lncRNAs were randomly selected for clustering results display.The same as fig.8圖7 下丘腦中差異表達(dá)lncRNAs熱圖Fig.7 Heatmap of differentially expressed lncRNAs in hypothalamus

2.4 差異lncRNA靶基因預(yù)測及其功能分析

對(duì)下丘腦中差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行順式調(diào)控靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)28個(gè)差異lncRNAs預(yù)測到靶基因98個(gè)，這些靶基因顯著富集到出生或孵化時(shí)胚胎發(fā)育終止(embryo development ending in birth or egg hatching)、胚胎心導(dǎo)管發(fā)育(embryonic heart tube development)、視黃酸應(yīng)答(response to retinoic acid)等繁殖相關(guān)GO生物過程(P<0.05)，涉及差異lncRNAs MSTRG.9196.4、MSTRG.9195.2、MSTRG.6254.2及相應(yīng)靶基因DNAAF2、FKBP1B(表2)；卵巢中159個(gè)差異lncRNAs預(yù)測到靶基因414個(gè)，這些基因顯著富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、基因表達(dá)晝夜節(jié)律調(diào)控(circadian regulation of gene expression)、神經(jīng)突觸聚集正調(diào)控(positive regulation of synapse assembly)等生物過程(P<0.05)，以及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(oocyte meiosis)、MAPK、葉酸合成(folate biosynthesis)等繁殖相關(guān)KEGG信號(hào)通路(表3)，篩選到MSTRG.7683.1、MSTRG.13604.4、MSTRG.16570.1、MSTRG.8330.5、MSTRG.8330.4等lncRNAs可能與狼山雞繁殖調(diào)控相關(guān)。細(xì)胞組分和分子功能中沒有發(fā)現(xiàn)顯著富集的繁殖相關(guān)條目。

圖8 卵巢中差異表達(dá)lncRNAs熱圖Fig.8 Heatmap of differentially expressed lncRNAs in ovary

表2 下丘腦中差異lncRNAs靶基因顯著富集的繁殖相關(guān)GO生物過程

表3 卵巢中差異lncRNAs靶基因富集的繁殖相關(guān)KEGG通路

3 討 論

下丘腦和卵巢是動(dòng)物性腺軸中的重要組織，雞下丘腦和卵巢中基因的表達(dá)情況與其繁殖性能密切相關(guān)，如促性腺激素釋放素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌激素受體(ESR)等[17]。哺乳動(dòng)物和鳥類性腺軸組織轉(zhuǎn)錄組測序顯示，卵巢和下丘腦中存在編碼和非編碼RNA，它們參與繁殖性能神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和生殖發(fā)育，其中l(wèi)ncRNA近幾年被廣泛研究并證明在動(dòng)物繁殖調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[18]。本研究在下丘腦和卵巢中共鑒定出4 222個(gè)lncRNAs，對(duì)其結(jié)構(gòu)特征分析發(fā)現(xiàn)，這些lncRNA具有序列和ORF短、外顯子數(shù)目少的特征。本研究結(jié)果與李輝等[2]研究表明雞lncRNA平均長度小于雞蛋白編碼基因平均長度且外顯子數(shù)普遍少于雞蛋白編碼基因外顯子數(shù)的結(jié)果相一致，同時(shí)驗(yàn)證了本研究lncRNA鑒定的準(zhǔn)確性。

高、低近交組間下丘腦和卵巢中分別篩選出35和215個(gè)差異表達(dá)lncRNAs，lncRNA的功能與其相鄰的蛋白編碼基因相關(guān)，通過尋找lncRNA周圍蛋白編碼基因的方式來預(yù)測lncRNA的靶基因，以推測其主要功能。下丘腦中差異lncRNA靶基因顯著富集到出生或孵化時(shí)胚胎發(fā)育終止、胚胎心導(dǎo)管發(fā)育、視黃酸應(yīng)答等繁殖相關(guān)GO生物過程。視黃酸是維生素A的一種形式，在雄性和雌性生殖及胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其參與胚胎早期神經(jīng)系統(tǒng)、心臟等組織器官發(fā)育[19]。Cheong等[20]研究表明，DNAAF2的一個(gè)空等位基因與胚胎發(fā)育缺陷和死亡率有關(guān)。本研究中，下丘腦差異lncRNAs MSTRG.9196.4、MSTRG.9195.2、MSTRG.6254.2及相應(yīng)靶基因DNAAF2、FKBP1B顯著富集于視黃酸應(yīng)答通路中，其中DNAAF2基因?yàn)椴町恖ncRNAs MSTRG.9196.4、MSTRG.9195.2的靶基因，推測差異lncRNA MSTRG.9196.4和MSTRG.9195.2在狼山雞繁殖性能近交衰退調(diào)控中發(fā)揮重要作用。FKBP1B基因編碼肽基-脯氨酸順反異構(gòu)酶，調(diào)節(jié)神經(jīng)元肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放，進(jìn)而影響神經(jīng)元的功能活動(dòng)[21]，研究證實(shí)，F(xiàn)KBP1B參與心臟發(fā)育、疾病發(fā)生、大腦衰老及神經(jīng)功能障礙等重要機(jī)體活動(dòng)[22-23]，本研究中FKBP1B基因?yàn)橄虑鹉X差異lncRNA MSTRG.6254.2的靶基因，推測lncRNA MSTRG.6254.2靶向正調(diào)控該基因，使該基因在狼山雞高近交組中顯著下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致狼山雞高近交組胚胎期心臟發(fā)育異常及神經(jīng)功能障礙等。

機(jī)體晝夜節(jié)律的變化影響激素的分泌及釋放，進(jìn)而影響神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及生理機(jī)能[24]。本研究中，卵巢內(nèi)差異表達(dá)lncRNAs MSTRG.16570.1和MSTRG.6979.1靶基因功能與晝夜節(jié)律調(diào)控有關(guān)，推測lncRNAs MSTRG.16570.1和MSTRG.6979.1可能通過調(diào)控高近交組狼山雞晝夜節(jié)律引起其神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及繁殖機(jī)能的改變。葉酸是動(dòng)物繁殖和胚胎發(fā)育過程中所必需的，飼糧中添加葉酸可以改善畜禽的繁殖性能[25]。本研究卵巢中差異lncRNA靶基因顯著富集于葉酸合成、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、MAPK等繁殖相關(guān)KEGG信號(hào)通路,其中差異lncRNA MSTRG.7683.1的靶基因CCDC149在卵母細(xì)胞成熟分裂中發(fā)揮重要作用[26]，而CPEB4基因作為差異lncRNA MSTRG.13604.4的靶基因與細(xì)胞周期和減數(shù)分裂相關(guān)[27]。推測狼山雞卵巢中差異lncRNA主要參與繁殖相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及配子生成，進(jìn)而影響其高近交組的繁殖性能。本研究結(jié)果為揭示狼山雞繁殖性能近交衰退調(diào)控機(jī)制提供了線索，為物種資源保護(hù)和家禽育種提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究在狼山雞下丘腦和卵巢中共鑒定出4 222個(gè)lncRNAs，高、低近交組間下丘腦中差異表達(dá)lncRNAs 35個(gè)，卵巢中差異表達(dá)lncRNAs 215個(gè)。下丘腦中差異lncRNA靶基因顯著富集于胚胎發(fā)育相關(guān)生物過程，涉及l(fā)ncRNAs MSTRG.9196.4、MSTRG.9195.2、MSTRG.6254.2及相應(yīng)靶基因DNAAF2和FKBP1B；卵巢中差異lncRNA靶基因富集到了神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及配子生成等繁殖相關(guān)生物學(xué)過程和信號(hào)通路，篩選到MSTRG.7683.1、MSTRG.13604.4、MSTRG.16570.1、MSTRG.8330.5、MSTRG.8330.4等繁殖相關(guān)候選lncRNAs。