嚴啊妮，沈 奔，王洪榮，馮春燕，魏宗友

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009；2.上海美農生物科技股份有限公司，嘉定 201800；3.江蘇省蘇州市太倉肉羊推廣示范基地，太倉 215400)

綿羊是恒溫動物，在極端環(huán)境條件下都能保持接近恒定的體溫[1]。在中國南方地區(qū)，夏季熱應激對綿羊的影響普遍存在。熱應激會引起綿羊發(fā)生一系列的生物學功能的改變，包括心率、直腸溫度(RT)、呼吸頻率(RR)的增加，采食效率和飼料利用率下降，水、蛋白質、能量和礦物質代謝紊亂，酶反應和激素分泌發(fā)生變化[2-3]，還會導致體重、生長速度、平均日增重和體總固體含量下降[4]。綿羊在高溫環(huán)境條件下，行為會發(fā)生改變，比如主動尋找陰涼地、唾液量分泌增加、飲水量增加、大口喘氣、精神萎靡等[5]。在養(yǎng)羊生產中，怎樣有效地緩解熱應激對綿羊的不利影響是生產中急需解決的問題。

前人研究表明，在熱應激狀態(tài)下，動物需要消耗更多生理有效能和蛋白質來自我調節(jié)熱應激的影響，有研究發(fā)現(xiàn)熱應激會引起反芻動物機體出現(xiàn)能量負平衡，血清中葡萄糖含量減少[6]。而過瘤胃葡萄糖作為外源性葡萄糖，是一種快發(fā)酵能，可避免瘤胃發(fā)酵，順利到達小腸，直接作為能量供應者為機體快速補充能量，提高了能量利用率，有效緩解能量負平衡[7]。蛋白質飼料短缺已成為全球性的問題，且中國豆粕價格居高不下，養(yǎng)殖成本增加，因此，尋找一種蛋白質飼料來代替豆粕是目前急需解決的問題[8]。尿素是一種瘤胃可降解蛋白質(RDP)的重要來源，具有較高的蛋白質當量[9]。在反芻動物飼糧中，尿素作為蛋白質的替代品具有較高的瘤胃降解率和較低的成本[10]。利用緩釋技術，一方面將尿素的釋放速率與瘤胃內碳水化合物的降解速率同步，可以最大限度地提高微生物蛋白的合成效率；另一方面可為機體提供足夠的能量，提高動物的生產性能，維持瘤胃內環(huán)境的穩(wěn)定[11]。緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖對泌乳奶牛和圍產期奶牛具有積極影響，而有關緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖應用于熱應激綿羊的研究卻鮮有報道。本試驗旨在探究飼糧中添加緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖對熱應激綿羊生產性能和瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，為生產實際中緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖的科學合理應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2020年7-9月在江蘇省蘇州市太倉肉羊推廣示范基地進行。

1.2 試驗材料

緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖均由上海美農生物科技股份有限公司生產，其中緩釋尿素：含氮量≥38%，蛋白當量≥238%。過瘤胃葡萄糖：葡萄糖含量≥50%，過瘤胃率≥80%，小腸釋放率≥90%。

1.3 試驗動物與分組

試驗選取40只健康、體重相近的3月齡湖羊公羔，按初始體重隨機分成4個處理組(n=10)，依次為對照(CON)組(飼喂基礎飼糧)、緩釋尿素(SRU)組(基礎飼糧中添加緩釋尿素15 g/d)、過瘤胃葡萄糖(RPG)組(基礎飼糧中添加過瘤胃葡萄糖10 g/d)和聯(lián)合添加(UG)組(基礎飼糧中添加緩釋尿素15 g/d+過瘤胃葡萄糖10 g/d)。預飼期15 d，正飼期50 d。

1.4 試驗飼糧及飼養(yǎng)管理

飼糧配方及營養(yǎng)水平見表1。試驗前對羊舍及周圍環(huán)境進行清理和消毒，對所有試驗羔羊打耳標，并進行驅蟲和防疫，使每只羔羊達到試驗所需的健康標準。試驗羊統(tǒng)一單欄飼養(yǎng)，每個單欄均配有水槽，確保有足夠的飲水。每天7：00和16：30各飼喂1次，早上喂料前，清理并收集食槽中的剩料進行稱重，記錄試驗羊的剩料量和飼喂量。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1.5 樣品采集與指標測定

1.5.1 溫濕度指數(shù)的測定 試驗期間羊舍的四角在距離地面約1.5 m處各放置干濕球溫濕度計(河北衡水武強佳益儀器有限公司)1個，試驗期間每天8：00、14：00和20：00分別記錄羊舍內干球溫度和濕球溫度，并計算溫濕度指數(shù)(THI)，計算公式為：THI=0.72(Td+Tw)+40.6。式中，Td為干球溫度(℃)；Tw為濕球溫度(℃)。根據(jù)THI數(shù)值的大小，熱應激可分為輕度(7288)[12]。

1.5.2 呼吸頻率和直腸溫度的測定 試驗期間，每周連續(xù)2 d記錄湖羊的呼吸頻率，并于當天8：00、14：00和20：00測定呼吸頻率，根據(jù)湖羊腹部和胸廓1 min的起伏次數(shù)，計算湖羊的呼吸頻率，每只羊重復計數(shù)2次。試驗期間，每周的最后1天14：00測定湖羊的直腸溫度，用獸用體溫計(成都鑄盛醫(yī)療器械有限公司)用75%消毒酒精消毒后，插入試驗羊肛門測定，5 min后取出，進行讀數(shù)和記錄。

1.5.3 生產性能指標的測定 正飼期的第1天清晨飼喂前對試驗羊稱重，為試驗羊的初始體重；正飼第50天晨飼前稱重，為試驗羊的最終體重。正飼期開始后，每天飼喂前清理食槽內的剩料，稱重后記錄飼喂量和剩料量。平均日增重(ADG)=試驗期間體重增加量(kg)/試驗期間天數(shù)(d)；平均日采食量(ADFI)=總采食量(kg)/試驗總天數(shù)(d)；料重比(F/G)=平均日采食量(kg)/平均日增重(kg/d)。

1.5.4 血清免疫指標的測定 正飼期的最后1天，每組隨機抽取6只試驗羊,于晨飼前用促凝真空采血管進行空腹頸靜脈采血各5 mL,促凝真空采血管在室溫下靜置30 min后，3 000 r/min、4 ℃低溫離心機離心10 min制備血清樣品，分裝于2 mL無酶離心管中，于-80 ℃冷凍保存用于后續(xù)血清指標的檢測。血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-2(IL-2)均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定，試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，嚴格按照說明書要求進行測定。

1.5.5 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定 正飼期的最后1天晨飼前，每組隨機抽取6只試驗羔羊，用口腔采樣器采集瘤胃液，經4層紗布過濾后，裝入50 mL的離心管。剩余瘤胃液快速分裝至2 mL離心管和10 mL的離心管中，于-20 ℃冷凍保存，用于瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定。其中，pH采用便攜式pH測定儀測定；氨態(tài)氮(NH3-N)采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定；微生物蛋白(MCP)采用嘌呤法測定；揮發(fā)性脂肪酸(VFA)采用氣象色譜儀(GC-14B,shimadzu)測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗原始數(shù)據(jù)采用Excel進行初步整理，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，并采用Duncan法進行多重比較；選擇有重復測量值的一般線性模型進行兩因素方差分析，并通過Tukey’s檢驗進行多重比較。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 試驗期間羊舍內THI的變化

圖1為試驗期間羊舍內1天中3個時間點的溫度變化情況，最低溫度為26 ℃，最高溫度為38 ℃，14:00是一天中溫度最高點。由圖2可知，試驗期間羊舍內THI范圍在77.39～89.85之間，羊舍內早、中、晚的平均THI>72，THI最低值為77.39，最高值為89.85，說明湖羊在試驗期間一直處于熱應激狀態(tài)，且大部分時間處于中度熱應激環(huán)境范圍內。

2.2 緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖對熱應激綿羊直腸溫度和呼吸頻率的影響

由表2可知，與CON組相比，UG組熱應激綿羊的直腸溫度顯著降低(P<0.05)，SRU組、RPG組、UG組熱應激綿羊的呼吸頻率均顯著降低(P<0.05)。

圖1 試驗期間羊舍內溫度變化曲線Fig.1 Temperature change curve in sheep shed during the experiment

圖2 羊舍溫濕度指數(shù)變化曲線Fig.2 Temperature and humidity index curve of sheep shed

表2 各組熱應激綿羊直腸溫度和呼吸頻率測定結果

2.3 緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖對熱應激綿羊生產性能的影響

由表3可知，與CON組相比，飼糧中添加緩釋尿素、過瘤胃葡萄糖顯著提高了熱應激綿羊的終末體重和平均日增重(P<0.05)，顯著降低了料重比(P<0.05)。

表3 各組熱應激綿羊生產性能測定結果

2.4 緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖對熱應激綿羊免疫指標的影響

由表4可知，與CON組相比，RPG和UG組熱應激綿羊血清中IgG和IgM含量均顯著提高(P<0.05)，各處理組熱應激綿羊血清中IgA含量均無顯著差異(P>0.05)。與CON組相比，RPG和UG組熱應激綿羊血清中TNF-α和IL-2的含量均顯著降低 (P<0.05)。

表4 各組熱應激綿羊血清免疫指標測定結果

2.5 緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖對熱應激綿羊瘤胃發(fā)酵指標的影響

如表5所示，與CON組相比，RPG組熱應激綿羊瘤胃液pH顯著提高(P<0.05)，SRU組和UG組的瘤胃pH均無顯著差異(P>0.05)；與CON組相比，RPG組和UG組瘤胃內氨態(tài)氮的濃度顯著降低 (P<0.05)，各處理組瘤胃內乙酸與丙酸的比值均顯著提高(P<0.05)；與CON組相比，SRU組瘤胃內乙酸、異丁酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸的比例均顯著提高(P<0.05)，RPG組瘤胃內異戊酸比例顯著提高(P<0.05)，丙酸、丁酸的比例顯著降低(P<0.05)，UG組瘤胃內乙酸、總揮發(fā)性脂肪酸及微生物蛋白的含量均顯著提高(P<0.05)。

表5 各組熱應激綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定結果

3 討 論

3.1 緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖對熱應激綿羊直腸溫度和呼吸頻率的影響

直腸溫度和呼吸頻率是評價動物熱應激最常見的敏感指標，反映動物受到熱應激的程度以及對環(huán)境改變所作出的直觀變化。綿羊的等溫區(qū)均為5～25 ℃之間[13]，綿羊可以通過物理調節(jié)和行為改變來維持自身產熱和散熱平衡。當環(huán)境溫度升高到36 ℃時，動物自身的生理機制不能抵消過多的熱負荷，直腸溫度就會升高[2]。綿羊可以通過提高呼吸頻率來增大肺部通氣量，消散總熱負荷的60%～90%[14]。Silvanikove等[15]根據(jù)呼吸頻率對熱應激的嚴重程度進行了分類，在綿羊中，40～60次/min為輕度熱應激，60～80次/min為中度應激，80～120次/min為重度熱應激，≥150次/min為極度熱應激。本試驗中綿羊處于重度熱應激和極度熱應激，飼糧中添加緩釋尿素、過瘤胃葡萄糖均能顯著降低熱應激綿羊的直腸溫度和呼吸頻率。宋良榮等[16]研究表明通過調節(jié)飼糧中代謝葡萄糖水平可以降低熱應激對荷斯坦奶牛生理指標的影響，緩解奶牛的直腸溫度和呼吸頻率出現(xiàn)的異常。過瘤胃葡萄糖的添加，提高了飼糧中代謝葡萄糖水平，從而降低了熱應激綿羊的直腸溫度和呼吸頻率。據(jù)報道，綿羊主要通過呼吸和出汗分別從呼吸道和皮膚表面蒸發(fā)散熱[2]，緩釋尿素可能引起皮膚血管舒張，通過血液循環(huán)將機體產生的熱量運送到體表，進行蒸發(fā)散熱，從而起到緩解綿羊熱應激的作用，但其影響機制還有待進一步研究。綜上，緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖可以通過降低直腸溫度和呼吸頻率有效地緩解熱應激對綿羊造成的負面影響。

3.2 緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖對熱應激綿羊生產性能的影響

長期暴露在高溫環(huán)境下，會導致綿羊體重、平均日增重、生長速率、飼料利用率、繁殖率和體總固形物含量降低[17]。熱應激可通過改變瘤胃的組織形態(tài)、瘤胃內的溫度、pH及滲透壓等降低瘤胃微生物的降解和繁殖能力，不利于養(yǎng)分的消化吸收，從而降低動物的生產性能和飼料轉化率[18]。大量研究表明，飼糧中添加緩釋尿素能顯著提高反芻動物的生產性能。Sweeny等[19]發(fā)現(xiàn)飼糧中添加尿素可提高綿羊干物質采食量和生長性能。Khattab等[20]試驗表明，當飼糧中添加的緩釋尿素從0 g/kg增加到15 g/kg時，可提高綿羊對干物質、有機物和粗蛋白質的消化率，顯著提高瘤胃微生物生長和瘤胃發(fā)酵功能。Ahmed等[21]試驗發(fā)現(xiàn)，在玉米青貯飼糧中添加緩釋尿素可顯著提高綿羊的平均體重和羊毛品質。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)飼糧中添加緩釋尿素可提高荷斯坦奶牛的平均日增重。本試驗中，飼糧添加緩釋尿素能顯著提高熱應激綿羊的平均日增重，降低料重比，這一結果與之前的研究報道相符。緩釋尿素能同步瘤胃內氮和碳水化合物的利用，滿足氨基酸的需要，促進瘤胃微生物對氨的吸收，提高微生物蛋白的合成。同時緩釋尿素也為淀粉分解菌和纖維分解菌提供了所需的氮源，提高了瘤胃微生物分解和利用飼料養(yǎng)分的能力，實現(xiàn)瘤胃內微生態(tài)平衡，從而提高動物的生產性能[23]。

有報道稱熱應激降低了綿羊、荷斯坦奶牛體內的循環(huán)葡萄糖水平[24]，葡萄糖具有重要的營養(yǎng)生理功能，當體內缺乏足夠的葡萄糖時，會引起動物生產性能下降。反芻動物幾乎完全依賴肝臟的糖異生來滿足機體其他組織的葡萄糖需要，過瘤胃葡萄糖是良好的外源性葡萄糖，可以避免在瘤胃中被破壞，進入腸道后再完全釋放出來，因此有更多的葡萄糖被運輸?shù)叫∧c，被小腸上皮細胞吸收，提高能量利用率[25]。李妍等[26]試驗表明，過瘤胃葡萄糖能提高荷斯坦奶牛產奶量和血清中葡萄糖濃度。Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)，向肉牛皺胃中注入葡萄糖能顯著降低產熱與代謝能的比值，提高能量沉積效率，促進體脂和蛋白質的沉積。代謝葡萄糖水平的增加還可以顯著提高動物體內氮沉積及可消化氮轉化為沉積氮的效率，提高蛋白質在胴體和肌肉中沉積比例[28]。本試驗中添加過瘤胃葡萄糖顯著提高了熱應激綿羊的終末體重和平均日增重，可能是過瘤胃葡萄糖減少了內源葡萄糖的合成，節(jié)約了能量和生糖氨基酸，促進了脂質和蛋白質代謝，從而改善了動物的生產性能。綜上，飼糧中添加緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖能顯著提高熱應激綿羊的生產性能，其中緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖聯(lián)合添加對提高熱應激綿羊的終末體重和平均日增重、降低料重比的效果最好。

3.3 緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖對熱應激綿羊免疫功能的影響

熱應激會降低動物機體的免疫力，引發(fā)炎癥反應。Bernabuccid等[29]發(fā)現(xiàn)熱應激會誘導反芻動物體內調節(jié)因子發(fā)生變化，改變了動物機體能量、脂質和蛋白質代謝，損害肝功能，免疫機能顯著下降，增加感染和疾病發(fā)生的風險，嚴重時可導致動物死亡。同時有研究表明，綿羊在熱應激條件下，體內骨骼肌中TNF-α和核因子-κB的表達量上調，機體內的炎癥反應也隨之發(fā)生[30]。淋巴細胞需要通過攝取葡萄糖來維持自身生存和正常功能，活化后的免疫細胞顯著增加代謝需求，葡萄糖代謝會發(fā)生數(shù)量級變化，以滿足生長、增殖和發(fā)揮效應所需的能量和生物合成需要。如果葡萄糖攝取受到限制，不能再維持免疫細胞生存，促凋亡B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)的家族成員會被激活，促進細胞的凋亡，不能產生所需的免疫效應[31]。Kvidera等[32]試驗也表明，免疫細胞被激活后，會顯著破壞葡萄糖的體內平衡，消耗的葡萄糖顯著增加，表現(xiàn)為低血糖癥。Zhang等[33]研究表明過瘤胃葡萄糖可參與回腸上皮代謝，調節(jié)與免疫穩(wěn)態(tài)相關的基因。本試驗中，添加過瘤胃葡萄糖顯著提高了熱應激綿羊血清中IgG和IgM含量，說明過瘤胃葡萄糖能為免疫細胞提供能量物質，促進體內葡萄糖代謝的穩(wěn)定，從而提高熱應激綿羊的免疫功能。Li等[27]試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加過瘤胃葡萄糖使泌乳奶牛的產奶量提高了12%，血漿中白細胞介素-8(IL-8)和TNF-α的濃度顯著降低，表明過瘤胃葡萄糖可以提高奶牛產奶量，減少機體的炎癥反應。本試驗中，添加過瘤胃葡萄糖顯著降低了熱應激綿羊血清中TNF-α和IL-2的水平，這與前人的研究報道相符。本試驗中添加緩釋尿素對熱應激綿羊血清中的免疫指標均無顯著影響，這與張嬌嬌[34]的研究結果一致，該研究表明在飼糧中添加不同比例的緩釋尿素對同一品種肉牛血清中免疫球蛋白含量均無顯著影響，但不同品種肉牛之間的血清免疫水平表現(xiàn)出差異，緩釋尿素的添加效果可能與動物的種類和環(huán)境溫度有關。

3.4 緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖對熱應激綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)是保證營養(yǎng)物質正常消化吸收的必要條件。正常情況下，瘤胃內含有大量的細菌、厭氧真菌、纖毛蟲和原蟲等微生物[35]。有報道稱，熱應激會導致綿羊瘤胃內pH、瘤胃內滲透壓、纖維素分解菌及淀粉分解菌數(shù)量顯著降低[36]。鐘書[37]研究發(fā)現(xiàn)，熱應激會使山羊瘤胃內微生物的種類和多樣性發(fā)生顯著改變，瘤胃內致病菌增加而益生菌減少。熱應激會顯著改變動物的采食方式，使其對粗飼料的采食量減少，而對精料的攝入量增加。攝入大量精料會導致瘤胃內有機酸產生增加，有可能引起動物發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒[38]。

瘤胃內的微生物可以將飼糧中所含有的蛋白質降解成微生物所需的NH3，NH3不僅為微生物蛋白的合成提供氮源，在纖維素分解菌和淀粉分解菌中也具有重要的作用[39]。Goulart等[40]研究表明，反芻動物能利用非蛋白氮化合物(如緩釋尿素)加快瘤胃內的微生物對氮源的攝取和利用，提高瘤胃微生物合成蛋白質的能力。Broderick等[41]報道稱，在飼喂高水平可快速發(fā)酵碳水化合物的反芻動物飼糧中添加緩釋尿素可提高微生物蛋白的合成能力。試驗中單獨添加緩釋尿素提高了瘤胃內微生物蛋白的濃度，但差異不顯著，而聯(lián)合添加緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖顯著提高了微生物蛋白的濃度，可能是緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖在瘤胃內實現(xiàn)了能量和氮利用的同步性，從而使微生物蛋白的合成效率顯著提高。Yan等[42]向牦?；A飼糧中分別添加10和20 g/kg的緩釋尿素，結果發(fā)現(xiàn)添加10 g/kg緩釋尿素組牦牛瘤胃細菌和真菌多樣性、生物多樣性均顯著升高。可見緩釋尿素能促進瘤胃微生物的生長和繁殖，提高氮源的利用率和代謝蛋白含量。本試驗中添加緩釋尿素提高了瘤胃內乙酸、異丁酸的比例，降低了丙酸的比例，這與Yang等[43]研究結果一致。尿素在瘤胃內緩慢水解釋放NH3，刺激瘤胃上皮對丙酸的吸收，同時緩釋尿素為纖維素分解菌提供氮源，促進纖維素降解產生乙酸，提高了乙丙比，從而改善瘤胃發(fā)酵。

葡萄糖是所有哺乳動物細胞能量代謝和合成途徑的基本物質，葡萄糖及其糖酵解代謝是胚胎生長、乳汁合成的重要燃料來源[44]。李影等[45]研究表明，過瘤胃葡萄糖能通過瘤胃順利進入到小腸內，通過小腸上皮細胞被吸收，避免了瘤胃發(fā)酵的不平衡性。Wang等[46]試驗發(fā)現(xiàn)，過瘤胃葡萄糖可顯著影響瘤胃發(fā)酵指標和瘤胃內有機酸代謝，提高瘤胃微生物的活性和瘤胃上皮功能，顯著增加有益菌的豐度，從而促進瘤胃系統(tǒng)的發(fā)育、微生物的生長和能量代謝。毛螺旋菌科和瘤胃球菌科能夠降解纖維素和半纖維素，將其轉化成短鏈脂肪酸[47]。王亞品等[48]在早期泌乳奶牛飼糧中添加350 g/d的過瘤胃葡萄糖后發(fā)現(xiàn)瘤胃內乙酸、丙酸、丁酸及總揮發(fā)性脂肪酸的濃度顯著提高，而本試驗中添加過瘤胃葡萄糖后，乙酸的比例升高，丙酸、丁酸及總揮發(fā)性脂肪酸的比例降低，產生這一現(xiàn)象的原因可能與綿羊所處的熱應激狀態(tài)以及過瘤胃葡萄糖的添加量有關。熱應激會導致綿羊瘤胃內的有益菌減少、致病菌增加，推測毛螺旋菌科和瘤胃球菌科的豐度和數(shù)量減少，從而導致瘤胃內短鏈脂肪酸水平的降低。添加不同劑量的過瘤胃葡萄糖對動物的影響也是不同的，本試驗中過瘤胃葡萄糖的添加劑量可能過低，對調節(jié)瘤胃內短鏈脂肪酸的效果并不顯著。

4 結 論

本試驗條件下，飼糧中添加緩釋尿素和過瘤胃葡萄糖可降低熱應激綿羊的呼吸頻率和直腸溫度，有效緩解綿羊的熱應激，并可顯著提高熱應激綿羊的生產性能，同時改善瘤胃內環(huán)境。