呂香州，張 琪，李 欣，于永生

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)研究所，公主嶺 136100)

葛根素是從豆科植物野葛根部提取出來的一種異黃酮衍生物，在生物學(xué)中被廣泛用于治療代謝類疾病，在小鼠[1]、草原紅牛[2]前體脂肪細(xì)胞中添加葛根素能夠顯著增加脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和脂質(zhì)沉積。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液中加入40 μmol/L葛根素能夠顯著提高細(xì)胞甘油三酯含量，并對成脂標(biāo)志基因及蛋白有顯著上調(diào)作用[3]。但葛根素通過何種途徑對脂肪細(xì)胞成脂分化進(jìn)行調(diào)節(jié)尚未得知。

脂肪代謝是一個(gè)由多種通路和因子參與的復(fù)雜過程，其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)扮演著重要的角色，其表達(dá)量高低能夠說明脂肪細(xì)胞分化程度，因此常作為成脂標(biāo)志基因[2-3]。以腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)依賴的蛋白激酶(AMPK)主導(dǎo)的AMPK通路也在脂肪代謝中發(fā)揮著重要的作用，AMPK蛋白是一種由3個(gè)蛋白質(zhì)亞基(α、β和γ)組成的活性酶[4]，該蛋白能夠調(diào)節(jié)各種生理應(yīng)激中的AMP和腺嘌呤核糖二磷酸(ADP)水平，從而直接調(diào)節(jié)所有能量消耗和產(chǎn)生途徑，可通過檢測AMPK各亞基(PPKAG1、PPKAG2、PPKAB1、PPKAB2、PPKAA1)的相對表達(dá)量來反映AMPK蛋白在mRNA層面的相對表達(dá)量[5-6]。AMPK蛋白作為AMPK通路核心蛋白有許多下游蛋白，其中乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶是最早發(fā)現(xiàn)的AMPK的2個(gè)受體蛋白。HMG-CoA在機(jī)體催化甘油三酯(TG)合成過程中起限速酶作用，當(dāng)AMPK被激活時(shí)，其下游受體蛋白HMG-CoA還原酶活性降低，肝臟中甘油三酯合成下調(diào)[7]。

脂肪酸合成酶(FAS)可催化相關(guān)酶聚合成長鏈脂肪酸，最終在肝細(xì)胞中以甘油三酯的形式貯存。激活的AMPK蛋白可降低FAS活性，降低游離脂肪酸(FFA)含量，從而降低甘油三酯含量[8]。下游因子ACC在AMPK作用下發(fā)生磷酸化失去活性，從而導(dǎo)致脂肪酸合成關(guān)鍵中間產(chǎn)物丙二酰輔酶A的合成減少[9]，丙二酰輔酶A由乙酰輔酶A經(jīng)ACC羧化形成，其在細(xì)胞內(nèi)蓄積程度將影響脂質(zhì)沉積和脂肪酸氧化[10]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(PGC-1α)是一種激活線粒體脂肪酸氧化以產(chǎn)生熱量的分子開關(guān)，其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)是促進(jìn)棕色脂肪譜系分化的必要過程[11]。AMPK通過調(diào)節(jié)PGC-1α刺激線粒體形成，且AMPK調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)基因表達(dá)從而通過脂肪酸氧化和肝臟糖異生促進(jìn)脂質(zhì)代謝[12]，即AMPK可通過激活PGC-1α促進(jìn)脂肪分解。呂香州等[3]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素誘導(dǎo)的松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞中ACC基因表達(dá)量顯著上調(diào)，但ACC上調(diào)是否由AMPK的變化導(dǎo)致并未做深層研究。

本試驗(yàn)以松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞為研究對象，通過在細(xì)胞誘導(dǎo)過程中添加葛根素、AMPK激活劑和抑制劑，檢測分化完全的脂肪細(xì)胞中甘油三酯含量、脂肪分化基因及蛋白相對表達(dá)量，以探究葛根素對松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞的影響以及其與AMPK通路之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

葛根素購自北京索萊寶科技有限公司；青-鏈霉素、胎牛血清(FBS)、PBS、Trypsin-EDTA、Trizol Reagent、PageRuler Prestained Protein Ladder均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；胰島素(insulin)、地塞米松(DEX)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、油紅O干粉均購自Sigma公司；4%多聚甲醛購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；AICAR、CompoundC購自MedChemExpress公司；Nonfat Dry Milk、Anti-rabbit購自CST公司；PPARγ、β-actin抗體均購自愛必信(上海)生物科技有限公司；ACC、AMPK、p-AMPK(Thr172)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；甘油三酯酶法測定試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master試劑盒購自羅氏(中國)有限公司；Western blotting所需PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%、7.5%)購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；10×Membrane Blocking/Washing Buffer(TBST)購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；PVDF免疫印跡膜均購自默克(中國)有限科技公司。酶標(biāo)儀(FC)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche 480)購自Roche公司。

1.2 松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞分離、傳代及誘導(dǎo)分化

取12日齡松遼黑豬(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所提供)腹股溝脂肪組織，用75%酒精消毒清洗后在PBS中剪碎，加入0.1%膠原酶37 ℃水浴消化30 min。將消化液反復(fù)吹打并用25 μm(100目)孔徑尼龍篩網(wǎng)過濾，濾液1 800 r/min離心5 min，用完全培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+1%青-鏈霉素)清洗3次，加入完全培養(yǎng)基并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。分離的前體脂肪細(xì)胞每48 h更換完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞長至完全匯合后吸棄完全培養(yǎng)基并用PBS洗去殘余培養(yǎng)基。加入0.25%胰酶消化2～3 min，將細(xì)胞懸液1 500 r/min離心5 min，用完全培養(yǎng)基吹打混勻細(xì)胞沉淀，并按1∶3進(jìn)行傳代。

待傳代后的松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞匯合度為90%時(shí)將完全培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)液Ⅰ(DMEM+10% FBS+0.5 mmol/L IBMX+1 μmol/L DEX+10 μg/mL胰島素)，記為第0天，48 h后將誘導(dǎo)液Ⅰ更換為誘導(dǎo)液Ⅱ(DMEM+10% FBS+10 μg/mL胰島素)。 將細(xì)胞分為對照組(Con)、葛根素組(Pue)、葛根素+AMPK激活劑AICAR組(AICAR)及葛根素+AMPK抑制劑CompoundC組(CompoundC)，對照組誘導(dǎo)液Ⅱ中不添加葛根素，Pue組添加40 μmol/L葛根素[3]，AICAR組添加40 μmol/L葛根素+500 μmol/L AICAR[13]，CompoundC組添加40 μmol/L葛根素+20 μmol/L CompoundC[13]。誘導(dǎo)液Ⅱ處理48 h后更換為完全培養(yǎng)基，每48 h換液，培養(yǎng)至第8天，收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測。

1.3 葛根素對脂質(zhì)沉積的影響

1.3.1 油紅O染色 培養(yǎng)至第8天，用PBS清洗3次各組松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞，在37 ℃培養(yǎng)箱中用4%多聚甲醛固定30 min。用PBS清洗3次后加1 mL油紅O染色工作液，30 min后用PBS清洗3次，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照。

1.3.2 甘油三酯濃度測定 將換液培養(yǎng)至第8天的各組細(xì)胞用PBS清洗2遍，用0.1%胰酶消化后將細(xì)胞收集至15 mL離心管內(nèi)，1 500 r/min離心5 min，吸棄上清后加入200 μL甘油三酯裂解液，室溫裂解10 min后取上清。70 ℃加熱10 min后室溫2 000 r/min離心5 min。PBS稀釋甘油標(biāo)準(zhǔn)品為1 000、500、250 μmol/L以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品、先前取得待測樣品與試劑盒內(nèi)的R1、R2以4∶1混合后的工作液混合后在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。用FC型酶標(biāo)儀檢測550 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中甘油三酯濃度。

1.4 葛根素對成脂分化的影響

1.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測成脂分化基因的表達(dá) Trizol法提取培養(yǎng)至第8天的各組細(xì)胞的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank中各基因序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 以GAPDH為內(nèi)參，檢測脂肪細(xì)胞中C/EBPα、PPARγ、ACC以及AMPK各亞基的表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×SYBR Green Ⅰ10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，退火(溫度見表1) 15 s，72 ℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min。

表1 引物信息

續(xù)表

1.4.2 Western blotting檢測成脂分化蛋白的表達(dá) 將培養(yǎng)至第8天的各組細(xì)胞用PBS清洗2次后加入200 μL RIPA(含磷酸酶抑制劑)裂解液，吹打混勻并收集至1.5 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min并取上清。用BCA法測定上清中蛋白濃度，取30 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠濃度為12.5%(ACC所用凝膠為7.5%)，濃縮膠與分離膠體積之比為1∶3。80 V電壓電泳至蛋白完全穿過濃縮膠后更換電壓為120 V，待Marker分離完全后，將蛋白以200 mA電流濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，裁剪膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h。TBST洗膜3次，每次5 min。 一抗PPARγ(1∶1 000)、ACC(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶500)、β-actin(1∶5 000) 4 ℃搖床上80 r/min孵育過夜。TBST洗膜3次后，加二抗Anti-rabbit IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后用ECL超敏顯色液顯色。

1.5 葛根素與AMPKα分子對接預(yù)測

在NCBI上下載AMPKα氨基酸序列(登錄號：NM_001167633)，在SWISS網(wǎng)站上對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測并保存PDB格式，通過Autodock Vina 1.20軟件進(jìn)行分子對接預(yù)測，用PyMol 2.2軟件進(jìn)行3D圖繪制，用Discovery Studio 2021軟件進(jìn)行二維圖繪制。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析，采用鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Image J V1.8.0軟件對Western blotting圖像進(jìn)行灰度分析，用GraphPad Prism 7.0軟件作圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 葛根素對脂質(zhì)沉積的影響

由圖1、2可知，與Con組相比，Pue組脂滴含量明顯上升，甘油三酯濃度顯著上調(diào)(P<0.05)；與Pue組相比，AICAR組脂滴含量減少，甘油三酯濃度顯著降低(P<0.05)，CompoundC組甘油三酯濃度無顯著變化(P>0.05)。

2.2 葛根素對成脂分化基因的影響

由圖3可知，與Con組相比，Pue組PPKAG2、PPKAB1、PPKAB2、PPKAA1、PGC-1α表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，Pue組C/EBPα、PPARγ、ACC表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)；與Pue組相比，AICAR組PPKAG1、PPKAG2、PPKAB1、PPKAB2、PPKAA1表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，AICAR組C/EBPα、PPARγ、ACC表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，CompoundC組PPKAG1、PPKAG2、PPKAB2表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，CompoundC組C/EBPα、ACC表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)。

2.3 葛根素對成脂分化相關(guān)蛋白的影響

由圖4可知，與Con組相比，Pue組成PPARγ、ACC蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，AMPK、p-AMPK蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，且p-AMPK/AMPK顯著降低(P<0.05)；與Pue組相比，AICAR組PPARγ、 ACC蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，AMPK、 p-AMPK蛋白表達(dá)量及p-AMPK/AMPK顯著增加(P<0.05)，CompoundC組PPARγ、ACC蛋白表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)，AMPK、p-AMPK蛋白表達(dá)量及p-AMPK/AMPK均顯著降低(P<0.05)。

2.4 葛根素與AMPKα亞基對接預(yù)測

葛根素與AMPKα最佳結(jié)合模式如圖5A所示。由圖5A可知，葛根素與GLU281、ARG265、LYS262、GLU196、HIS133之間可形成5個(gè)氫鍵。由圖5B可知，除5個(gè)氫鍵外，葛根素還可與ARG134、ILE261、PRO195之間形成5個(gè)Pi-陽離子鍵，與ASP130之間形成Pi-陰離子鍵。

圖1 不同處理組脂滴形態(tài)(200×)Fig.1 Lipid droplet morphology in different treatment groups (200×)

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different letters superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖2 不同處理組甘油三酯含量Fig.2 Triglyceride content in different treatment groups

A，AMPK各亞基的表達(dá)量；B，成脂分化基因的表達(dá)量A,Expression of each subunit of AMPK;B,expression of adipogenic differentiation genes圖3 不同處理組AMPK各亞基及脂肪分化基因的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression of AMPK subunits and adipose differentiation genes in different treatment groups

A，Western blotting檢測成脂分化相關(guān)蛋白的表達(dá)；B，成脂分化相關(guān)蛋白灰度分析A,The expression of adipogenic differentiation related proteins was detected by Western blotting;B,Grayscale analysis of adipogenic differentiation related proteins圖4 不同處理組成脂分化相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of lipid differentiation related proteins in different treatments

A，葛根素與AMPKα結(jié)合3D模型；B，葛根素與AMPKα結(jié)合二維模型A,3D model of puerarin and AMPKα binding;B,Two-dimensional model of puerarin and AMPKα binding圖5 葛根素與AMPKα亞基對接預(yù)測結(jié)果Fig.5 Prediction results of puerarin and AMPKα subunit docking

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可抑制氧化應(yīng)激并改善肝線粒體呼吸功能，增加ATP的產(chǎn)生[14]，而此時(shí)AMP/ATP比值降低，AMPK蛋白活性降低[15]，即葛根素可通過調(diào)節(jié)ATP含量間接降低AMPK蛋白活性。在3T3-L細(xì)胞培養(yǎng)中添加葛根素發(fā)現(xiàn)，葛根素可通過PI3-AMPK通路降低3T3-L細(xì)胞中葡萄糖濃度，表明葛根素能增加3T3-L脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型對葡萄糖的利用從而提升脂質(zhì)沉積水平[16]。在本試驗(yàn)中，與對照組相比，葛根素組AMPK蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，成脂標(biāo)志基因PPARγ與C/EBPα相對表達(dá)量顯著上調(diào)，甘油三酯濃度顯著提升，而葛根素激活劑AICAR組較葛根素組效果顯著減弱，此結(jié)果與楊維波等[16]的結(jié)果一致。但同時(shí)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AMPK蛋白下游基因ACC表達(dá)量顯著上升，PGC-1α基因表達(dá)量顯著下降，表明葛根素或可通過不同AMPK通路對脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積進(jìn)行調(diào)節(jié)，后續(xù)將針對AMPK蛋白對ACC、PGC-1α的影響展開試驗(yàn)。

ACC主要通過可逆性磷酸化的共價(jià)修飾方式調(diào)控脂肪代謝[17]。研究發(fā)現(xiàn)，ACC的表達(dá)受AMPK蛋白的調(diào)控，共同形成AMPK-ACC調(diào)節(jié)通路[18]。研究表明，葛根素可通過AMPK-ACC信號通路降低2型糖尿病小鼠胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，表明葛根素可改善2型糖尿病小鼠胰島素抵抗進(jìn)而提升其脂質(zhì)沉積水平[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，葛根素可通過上調(diào)ACC基因及蛋白的表達(dá)量促進(jìn)松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積。但小型動(dòng)物無法有效反映大型家畜的真實(shí)情況，葛根素作為飼料添加劑對大型家畜有何效果仍需進(jìn)一步研究。PGC-1α表達(dá)水平的改變與肥胖、糖尿病、脂代謝紊亂等代謝疾病密切相關(guān)[20]，且PGC-1α可通過增加線粒體內(nèi)解偶聯(lián)蛋白(UCP)的表達(dá)量，從而實(shí)現(xiàn)白色脂肪褐色化改變[21]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病小鼠模型中，葛根素能通過去乙?；?過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(SIRT-PGC-1α)通路下調(diào)小鼠血糖濃度[22]，而AMPK同樣可作為PGC-1α上游因子調(diào)節(jié)PGC-1α的表達(dá)量[23-24]。 本試驗(yàn)通過對PGC-1α基因定量分析發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠顯著下調(diào)其表達(dá)量，與徐小惠等[22]研究的結(jié)果一致，但葛根素激活劑AICAR組PGC-1α表達(dá)量與葛根素組差異不顯著，葛根素是否能通過AMPK對PGC-1α進(jìn)行調(diào)控仍需進(jìn)一步探究。分子對接試驗(yàn)則顯示葛根素與AMPKα之間可形成5個(gè)氫鍵，5個(gè)Pi-陽離子鍵及1個(gè)Pi-陰離子鍵，多種力的作用使二者的結(jié)合趨于穩(wěn)定狀態(tài)。目前已知葛根素可通過調(diào)節(jié)AMP/ATP比值間接調(diào)節(jié)AMPK磷酸化[16-17]，葛根素是否可直接作用于AMPKα亞基從而抑制Thr-172位點(diǎn)磷酸化仍需進(jìn)一步研究。

綜上，葛根素可通過AMPK通路促進(jìn)松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞的成脂分化，該結(jié)果可為在飼糧中添加葛根素以改善豬肉肉質(zhì)提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)，也為進(jìn)一步研究松遼黑豬脂肪的代謝調(diào)節(jié)方式提供參考。

4 結(jié) 論

松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)，添加40 μmol/L葛根素能夠顯著增加脂肪細(xì)胞中甘油三酯含量，顯著上調(diào)成脂分化相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)量，顯著下調(diào)AMPK各亞基mRNA和蛋白的表達(dá)量。 在添加AMPK激活劑AIRCR(500 μmol/L)后，40 μmol/L葛根素對AMPK的影響效果被顯著抑制。說明葛根素可通過抑制AMPK Thr172磷酸化位點(diǎn)的磷酸化改善松遼黑豬前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積與細(xì)胞分化能力。