昝庚秀，秦穎超，朱 超，王修啟

(1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642;2.廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室,廣州 510642;3.國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心,廣州 510642)

腸道不僅是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要部位，也是重要的免疫和內(nèi)分泌器官。維持腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的完整對保障機體健康、提高養(yǎng)分轉(zhuǎn)化效率、降低動物死淘率具有重要意義[1]。腸道黏膜上皮具有很強的代謝能力，其不斷更新的動力來自隱窩基底部腸道干細胞(intestinal stem cell，ISCs)正常的增殖和分化[2]。隱窩中與ISCs相鄰的潘氏細胞(Paneth cells，PCs)及其周邊的腸間充質(zhì)細胞(intestinal stromal cells)、腸上皮下成纖維細胞(intestinal subepithelial myofibroblasts，ISEMFs)和免疫細胞等組成ISCs生活的微環(huán)境(ISC巢)。其中，PCs、腸間充質(zhì)細胞和ISEMFs主要依賴Wnt、BMP、Notch等信號分子調(diào)控ISCs活性。Herrera等[3]發(fā)現(xiàn)，腸道免疫細胞，尤其是輔助型T細胞(Th細胞)，能響應(yīng)腸腔中有益或有害刺激因子，通過分泌表皮生長因子、白細胞介素(interleukins，ILs)和干擾素(interferons，IFNs)等生長因子和/或細胞因子，結(jié)合酪氨酸激酶相關(guān)受體，激活JAK/STAT信號通路，促進ISCs分裂，抑制其失巢凋亡，加快隱窩再生和絨毛重建。相反，JAK/STAT失活將導(dǎo)致ISCs不斷丟失，腸細胞分化異常，隱窩消失，絨毛萎縮，腸道發(fā)育嚴重受阻[4]。目前，大多數(shù)研究聚焦于JAK/STAT信號通路在腸黏膜再生中作用，而關(guān)于其調(diào)節(jié)不同類型的免疫細胞與ISCs互作的研究相對較少，尤其是JAK/STAT在畜禽腸道免疫性疾病發(fā)生和發(fā)展過程中的重要性未被充分認識。探討JAK/STAT信號通路在腸黏膜再生和免疫應(yīng)答中的作用機制，有助于剖析腸道疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，為開發(fā)穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激狀態(tài)下腸道健康調(diào)控劑提供依據(jù)。

1 JAK/STAT信號通路

1.1 JAK/STAT信號級聯(lián)反應(yīng)

JAK/STAT信號通路構(gòu)成相對簡單，主要由酪氨酸激酶相關(guān)受體、傳遞信號的酪氨酸激酶JAK和產(chǎn)生效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子STAT組成。其信號傳遞過程如下：細胞外信號因子結(jié)合膜上相應(yīng)受體，誘導(dǎo)其發(fā)生二聚化；受體募集和藕聯(lián)JAK，促使后者活化；激活的JAK以正反饋的方式磷酸化受體的酪氨酸殘基，在受體上形成停泊位點，招募并磷酸化STAT；磷酸化的STAT從受體鏈上解離，形成二聚體后轉(zhuǎn)移至細胞核并結(jié)合啟動子，從而激活下游基因轉(zhuǎn)錄(圖1)[5-6]。

1.1.1 JAK蛋白家族 JAK屬于非受體型激酶，包括JAK1～JAK3和酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2，TYK2)4個成員，其中JAK1、JAK2和TYK2在腸道表達。JAK蛋白家族成員有7個JAK同源結(jié)構(gòu)域(JAK homology domain，JH)。其中C-末端JH1、JH2結(jié)構(gòu)域分別為激酶區(qū)和“假”激酶區(qū)，具有催化功能；N-末端的4個JH是受體結(jié)合區(qū)域[7-8]。生理條件下，細胞因子與其特定的細胞表面受體結(jié)合，受體構(gòu)象發(fā)生改變，活化其胞內(nèi)段的JAK結(jié)合位點，隨后招募JAK激酶并使其磷酸化。多數(shù)受體由1條或2條配體特異鏈和共用亞基組成。根據(jù)共用亞基的不同可將受體分為以下3種：①gp130型，是IL-6、IL-11、IL-12、IL-23、IL-27和IL-35受體，能激活JAK1、JAK2、JAK3和TYK2[9-10]；②βc型，是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、IL-3和IL-5的受體，激活JAK2[11-13]；③γc型，是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13，IL-15和IL-21的受體，激活JAK1和JAK3[14-16]。此外，IFN受體家族，包括IFNs(α、β和γ)和ILs(10、19、20、22、24和26)通過JAK1、JAK2和TYK2傳導(dǎo)信號[17-19]。

1.1.2 轉(zhuǎn)錄因子STAT STAT是一類轉(zhuǎn)錄因子，有STAT1～STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6共7個成員。STAT蛋白由3個結(jié)構(gòu)域、2個激活域和1個DNA結(jié)合域組成[20]。氨基末段結(jié)構(gòu)域不僅是活化的STAT形成二聚體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是STAT與啟動子結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的親水性表面能與調(diào)節(jié)因子結(jié)合，調(diào)控STAT活性；Src同源2區(qū)(Src homology 2 domain，SH2)結(jié)構(gòu)域是其與受體磷酸化的特異性結(jié)合區(qū)，如IL-4和IL-12分別特異性激活STAT6和STAT4[21]；酪氨酸激活域與Src同源2區(qū)結(jié)構(gòu)域相鄰，防止STAT蛋白自身磷酸化；轉(zhuǎn)錄激活域由C-末端殘基組成，感應(yīng)不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；DNA結(jié)合域是其與增強子γ活化位點(gamma activated site，GAS)家族結(jié)合部位[22]。

1.2 JAK/STAT信號負調(diào)節(jié)因子

活化的STATs移位至細胞核，與啟動子結(jié)合后啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，隨后STATs失活，重新回到細胞質(zhì)中。這種快速的失活機制主要依賴于細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)、蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)和活化STATs蛋白抑制因子(protein inhibitors of activated stats，PIAS)[23]。

1.2.1 SOCS家族 SOCS家族成員由SOCS1～SOCS7和細胞因子誘導(dǎo)的含SH2結(jié)構(gòu)域蛋白(cytokine inducible SH2 containing protein，CIS)組成[24]?；罨腟TATs促進SOCS基因轉(zhuǎn)錄，SOCS蛋白與受體競爭性結(jié)合磷酸化的JAKs，抑制STATs的活化。通過體外激酶測定系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，SOCS3疏水性表面能特異性結(jié)合到JAK2催化結(jié)構(gòu)域JH1，從而阻斷底物和JAK2結(jié)合，抑制JAK2的活化[23]。研究表明，CIS1基因過表達或STAT5缺陷都會導(dǎo)致小鼠IL-2信號級聯(lián)缺陷[25]。進一步的證據(jù)顯示CIS1與STAT5可形成負反饋環(huán)，即CIS1基因轉(zhuǎn)錄依賴于STAT5，翻譯后的CIS1又反過來抑制STAT5的活性[26]。

1.2.2 PTPs家族 PTPs家族成員包括SHP1、SHP2和T細胞PTP等。其中關(guān)于SHP2的研究最多。SHP2含有N-SH2和C-SH2 2個串聯(lián)結(jié)構(gòu)域，可調(diào)節(jié)自身和磷酸化酪氨酸殘基上的信號分子的相互作用，以及C-末端具有Tyr542和Tyr580磷酸化位點的酪氨酸磷酸酶域，促進SHP2對信號分子的識別，后者能夠磷酸化[27]。SHP2阻斷STAT1、STAT5磷酸化或加速其脫磷酸化，下調(diào)JAK/STAT信號活性[28-29]。

1.2.3 PIAS家族 PIAS家族成員包括PIAS1、PIAS3、PIASx(PIASx A和PIASx B)和PIASy。與SOCS家族作用機制不同，PIAS蛋白存在于胞質(zhì)中，阻礙STATs單體二聚化，阻斷JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[30]。 目前已知PIAS1和PIAS3分別特異性抑制STAT1和STAT3的活性[31-32]。胞外細胞因子水平和胞內(nèi)負調(diào)節(jié)因子家族的活性變化可適當激活或抑制不同的JAK/STAT磷酸化水平，以及下游靶基因豐度，控制細胞命運，從而保持腸道平衡狀態(tài)，維護腸道正常功能，調(diào)控腸道發(fā)育進程。

2 JAK/STAT調(diào)控ISCs增殖、凋亡和分化命運

ISCs不斷分裂生成新的腸道干細胞或其子代細胞——短暫擴增細胞，短暫擴增細胞在離開隱窩底部后不斷增殖并分化為各類成熟腸上皮細胞，這些細胞向腸絨毛頂端主動遷移，補充絨毛頂端凋亡脫落的腸上皮細胞[33]。研究表明，JAK/STAT通路的自主激活足以誘導(dǎo)ISCs增殖和腸道更新，這種快速應(yīng)答對損傷條件下ISCs存活尤為重要[34]。此過程涉及到STAT靶基因survivin、pim1、c-Myc、細胞周期蛋白質(zhì)cyclin、細胞分裂周期蛋白質(zhì)25A(Cdc25A)、細胞外基質(zhì)金屬酶MMP和Bcl-2基因，它們參與調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡和分化進程[35]。

穩(wěn)態(tài)條件下，果蠅ISCs不對稱分裂產(chǎn)生ISC和腸母細胞(EB)，腸母細胞退出細胞周期并直接分化為吸收性腸母細胞(EC)[36]。普遍的觀點認為，Notch信號誘導(dǎo)EB向EC分化，因此，ISCs中Notch缺失引起由ISCs組成的腫瘤發(fā)生；而EB中JAK/STAT活性最高，缺乏Stat92E的EB不能分化為成熟的腸道細胞，致使由祖細胞組成的腫瘤的形成。盡管Notch和Stat92E是EB分化所必需的，但二者上下游關(guān)系尚不確定。Beebe等[37]研究發(fā)現(xiàn)，Stat92E突變導(dǎo)致的分化缺陷不能通過激活Notch來挽救，提示它們可能平行發(fā)揮作用。 然而Liu等[38]針對果蠅進行研究，結(jié)果顯示激活Notch信號可以促進Stat92E突變體中的ISCs轉(zhuǎn)化為腸上皮細胞。

當果蠅腸細胞在受到凋亡或感染等應(yīng)激信號時，會分泌Upd1、Upd2和Upd3，通過與膜受體結(jié)合，激活JAK/STAT信號，促進ISC的自我更新和分化[39]。同時，沉默型干細胞標記BMI1基因座可直接與STAT5結(jié)合，促進沉默型小腸干細胞向Lgr5+活躍型ISCs的轉(zhuǎn)化。敲除STAT5后隱窩中增殖細胞數(shù)量顯著減少；而重新導(dǎo)入STAT5則能恢復(fù)ISC活性，維持腸上皮正常形態(tài)[40-41]。

此外，IFN-γ和TNF-α能通過JAK/STAT1通路激活沉默型干細胞，促使其重新進入細胞周期，修復(fù)腸道損傷[42]。Lindemans等[43]發(fā)現(xiàn)，IL-22能夠促進STAT3 Tyr705磷酸化，增加小鼠腸道類器官表面積，誘導(dǎo)腸干細胞向杯狀細胞的分化。STAT3缺失會導(dǎo)致Caspase3活性增強，誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[44]。 相反，STAT3過表達增加CyclinD1的表達，促進細胞增殖。而生長激素(GH)和GM-CSF則通過激活STAT5提高炎癥狀態(tài)下腸上皮細胞活力[45-46]。

JAK/STAT介導(dǎo)的腸道穩(wěn)態(tài)和損傷后修復(fù)的焦點在于ISC的增殖、凋亡和分化活性，驅(qū)動ISC再生，維持隱窩絨毛軸正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和上皮屏障功能，促進腸細胞對營養(yǎng)物質(zhì)吸收，是保障動物腸道健康的關(guān)鍵。

3 JAK/STAT信號通路調(diào)控腸道屏障功能

腸道屏障，包括微生物屏障、免疫屏障和機械屏障，是機體抵御外源病原微生物和毒素攻擊的主要防線，其中機械屏障最為重要，它能選擇性地允許腸腔內(nèi)某些物質(zhì)進入機體內(nèi)環(huán)境[47]。腸道受損后，經(jīng)免疫系統(tǒng)活化誘導(dǎo)產(chǎn)生的ILs等細胞因子不但參與T細胞和B細胞的活性調(diào)節(jié)，還可通過JAK/STAT信號通路控制腸上皮細胞凋亡進程，減少各種外界損傷引起的細胞凋亡。王瑞娟等[48]發(fā)現(xiàn)，IL-11預(yù)處理激活JAK/STAT信號通路，增加增殖細胞核抗原陽性細胞數(shù)量，緩解放化療造成的小鼠腸道損傷。IL-22提高抗凋亡基因(BIRC5、pla2g5)和促增殖基因(MO、MYC和MCL1)的轉(zhuǎn)錄，對促進組織修復(fù)有明顯效果[49]。此外，IL-22還可上調(diào)小鼠結(jié)腸及Caco-2細胞Claudin-2的表達，從而增加腸上皮屏障功能[50]。作者所在研究團隊2020年的研究結(jié)果表明，在斷奶仔豬飼糧中添加谷氨酸可上調(diào)JAK2/STAT3信號通路活性，而通過染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)發(fā)現(xiàn)，p-STATs可以結(jié)合Occludin和ZO-1基因的啟動子區(qū)域，調(diào)節(jié)Occludin和ZO-1的表達，增強腸道機械屏障功能[51-53]。

4 JAK/STAT信號通路與Th細胞平衡

腸道免疫細胞保持著高度的免疫應(yīng)答，以快速清除腸腔中的病原菌。Th細胞主要包括Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)，對維持腸道免疫屏障至關(guān)重要。正常生理狀態(tài)下，Th1/Th2細胞和Th17/Treg分別兩兩相互頡頏，保持動態(tài)平衡。Th1/Th2或Th17/Treg的平衡被打破都會導(dǎo)致腸道慢性炎癥[54-55]。

特異性STAT激活是Th細胞命運決定的關(guān)鍵事件。STAT1和STAT6分別是Th1和Th2的特異性轉(zhuǎn)錄因子[56-57]，其中，Th2細胞是清除寄生蟲(尤其是蠕蟲)的主要免疫細胞，可通過產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13(刺激B細胞產(chǎn)生IgE)參與機體過敏反應(yīng)[58]；STAT3能促進Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體相關(guān)的孤兒核受體γ的表達，增加IL-17的分泌，促進中性粒細胞的富集，減弱致病真菌的定植能力，降低腸道感染風險[59]。同樣有研究者發(fā)現(xiàn)，降低JAK2/STAT3信號活性，可抑制Th17成熟與分化，緩解黏膜炎癥引起的免疫失調(diào)和紊亂[60]。視黃酸(維生素A的代謝產(chǎn)物)能增強STAT5的表達，后者與Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子FoxP3基因啟動子結(jié)合以促進Treg分化，抑制其他Th細胞過度活化，維持免疫耐受[61-62]。這些結(jié)果說明STAT信號是控制機體腸道免疫機能的開關(guān)。

體外研究發(fā)現(xiàn)，多種Th細胞及其產(chǎn)生的細胞因子能與膜上MHCⅡ結(jié)合，調(diào)節(jié)ISCs擴增[63]。Th1細胞分泌的IFNγ可能促進ISCs分化為潘氏細胞[64]；也可直接作用于細胞膜表面受體IFN-γR，激活JAK/STAT信號通路，啟動包括趨化因子、抗原呈遞分子和各種具有抗菌抗病毒效應(yīng)的細胞因子的表達[65]。Th1和Th17與小腸類器官共培養(yǎng)可抑制Lgr5+干細胞發(fā)育為類器官，它們各自分泌的IL-1和IL-17均具有降低Lgr5+干細胞活性的作用,而Th2的分化水平對維持干細胞的活性具有重要意義[66]。Treg與小腸類器官共培養(yǎng)增強Lgr5+干細胞的活性，小腸中的Treg敲除引起Lgr5+細胞的丟失[67]。以上這些研究證實Th細胞能調(diào)節(jié)JAK/STAT信號，影響干細胞的增殖和分化命運(圖2)[68]。

圖2 JAK/STAT信號通路與Th細胞的相互作用[68]Fig.2 JAK/STAT signaling pathway interacts with Th cells[68]

5 JAK/STAT信號通路與畜禽腸道疾病

JAK/STAT信號通路與腸道黏膜免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，當機體被感染時，受攻擊的細胞會分泌干擾素，與干擾素受體結(jié)合，激活JAK/STAT信號通路；該通路的關(guān)鍵靶蛋白STAT被激活后，與特定的干擾素家族成員一起組成干擾素基因復(fù)合物，后移位至細胞核，誘導(dǎo)干擾素刺激基因的表達，啟動自身免疫；而抑制干擾素介導(dǎo)的免疫途徑，機體則無法建立有效的抗病毒屏障[69]。然而，某些病毒，如非洲豬瘟病毒則通過抑制STAT1和STAT2蛋白表達，阻斷干擾素信號通路，完成免疫逃逸過程[70]。這可能是非洲豬瘟病毒侵入機體后，誘導(dǎo)腸黏膜出現(xiàn)典型出血癥狀的原因。同樣，豬三角洲病毒依賴自身NSP5結(jié)構(gòu)域，特異性抑制STAT2，是其躲避機體免疫、破壞腸道結(jié)構(gòu)、引起腹瀉的主要途徑[71]。Li等[72]和Zhao等[73]在豬小腸上皮細胞模型上發(fā)現(xiàn)，IFN-λ3比INFα具有更好的抗病毒能力，原因在于其對激活JAK/STAT信號通路具有更強的刺激作用。然而，過度激活的JAK/STAT信號通路也是誘發(fā)畜禽腸道疾病的重要原因，如豬傳染性胃腸炎，豬流行性腹瀉病毒和雞產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的腸道炎癥等[74-77]。因此，關(guān)注JAK/STAT信號通路對保護畜禽腸道健康具有重大意義，而如何合理干預(yù)JAK/STAT信號通路，可能成為生產(chǎn)中防治畜禽腸道疾病的新途徑。

6 小 結(jié)

JAK/STAT信號通路介導(dǎo)ISC驅(qū)動的腸上皮更新和再生及Th細胞參與的腸道炎癥的發(fā)生和發(fā)展，以維持腸道功能的正常運轉(zhuǎn)。 然而，調(diào)控該過程的直接靶點在很大程度上尚不清楚；且以JAK/STAT為核心構(gòu)筑的復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)尚未被完全解析。大量研究表明，功能性營養(yǎng)素具有促進腸道損傷后修復(fù)的功能，但大多缺乏足夠證據(jù)證實營養(yǎng)素促進腸道修復(fù)是通過JAK/STAT信號通路實現(xiàn)的。未來的研究應(yīng)側(cè)重于如何精確調(diào)控JAK/STAT途徑更好地維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及其與其他信號通路的相互聯(lián)系，并借助腸道類器官模型和基因編輯技術(shù)篩選確定JAK/STAT相關(guān)的腸道疾病中的干預(yù)靶標，為畜禽養(yǎng)殖過程中開發(fā)新的功能性飼料添加劑，以及調(diào)控畜禽腸道健康、減輕腸道疾病提供理論依據(jù)。