潘鈺，夏海華，葉陽，曲曉軍，于沖

(黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010)

納豆是一種日本傳統(tǒng)的發(fā)酵大豆食品，眾所周知，納豆營養(yǎng)豐富，具有輔助降血脂、調(diào)節(jié)血糖、增強免疫力等功效，對健康有益，它的主要活性成分納豆激酶具有很強的溶解血栓功能[1-2]，Oba Mami等[3]最新研究發(fā)現(xiàn)納豆提取物含有一種蛋白酶，能通過水解病毒蛋白質(zhì)抑制病毒感染，納豆激酶粉末可與其他輔助成分復合，作為保健食品開發(fā)，預防和治療心血管疾病[4-5]。

本研究在前期研究[6-7]的基礎上，探索以納豆凍干粉、低聚果糖、亞麻籽油為主要功效成分復配成的納豆軟膠囊的安全性及功能，通過對膠囊內(nèi)容物進行急性毒性試驗與30 d喂養(yǎng)試驗對其安全性進行評價，并研究其對小鼠細胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細胞功能和自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)活性的影響，為納豆軟膠囊作為保健食品的研究和開發(fā)提供了理論及試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

樣品：納豆軟膠囊，由黑龍江省科學院微生物研究所提供，規(guī)格為0.5 g/粒，儲存條件為密封，口服，按60 kg體重計算，推薦劑量為成人3次/d，每次2粒。取納豆軟膠囊內(nèi)容物作為試驗的樣品。

1.2 試劑

試驗動物：ICR小鼠SPF級、Wistar大鼠及飼料：長春市億斯實驗動物技術有限責任公司；試驗動物使用許可證號：SYXK-(吉)2010-0011；試驗條件合格證：吉動設字10-1005；飼養(yǎng)條件：溫度20～22 ℃，相對濕度40%～70%。綿陽紅細胞(SRBC)、生理鹽水、Hank's液、RPMI1640培養(yǎng)液、Giemsa染液等：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3 主要儀器與設備

Olympus-CH顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；HPP110恒溫培養(yǎng)箱、PURA22電熱恒溫水浴箱 瑞軒電子科技(上海)有限公司；SYSMEX XT-1800i全自動血液分析儀 上海涵飛醫(yī)療器械有限公司；JE203GE電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Infinite M200 Pro酶標儀 帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；ZHJH-C1115C超凈工作臺 北京中儀友信科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 急性毒性試驗[8]

采用最大耐受劑量法，劑量為24.8 g/kg BW，取31.0 g樣品溶于植物油至50.0 mL，小鼠禁食不禁水16 h后，間隔4 h灌胃2次，每次灌胃量0.2 mL/10 g BW，灌胃后觀察14 d并記錄下小鼠的中毒情況，在第14天稱量體重，計算增重，試驗結束后對小鼠做大體解剖，根據(jù)毒性分級標準評價受試物的急性毒性。

1.4.2 骨髓細胞微核試驗

采用間隔24 h兩次經(jīng)口灌胃法，各組每次灌胃量為0.2 mL/10 g BW，試驗設高(10.0 g/kg BW)、中(5.0 g/kg BW)、低(2.5 g/kg BW)3個劑量組，植物油為陰性對照，40 mg/kg BW劑量的環(huán)磷酰胺為陽性對照，于末次灌胃后6 h，處死小鼠，制備骨髓液并涂片，經(jīng)固定和染色后，于光學顯微鏡下計數(shù)。

1.4.3 精子畸變試驗

采用經(jīng)口灌胃方式給予小鼠受試物[9]，連續(xù)5 d每天灌胃一次，灌胃量及分組同1.4.2，經(jīng)過一定時間后處死小鼠，取其附睪制備涂片，經(jīng)固定、染色，顯微鏡下計數(shù)畸形精子。

1.4.4 Ames試驗

Ames試驗即沙門氏菌回復突變試驗，采用平板摻入法，選取5000，1000，200，40，8 μg/皿5個受試物劑量，利用4株鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，具體操作詳見文獻[10]。

1.4.5 30 d喂養(yǎng)試驗[11]

采用經(jīng)口灌胃給予受試物，將高、中、低3個試驗組(分別取樣50.0，37.5，25.0 g至100 mL植物油中)及對照組均按1.0 mL/100 g BW的量灌胃，對照組給予植物油。觀察大鼠一般情況，檢測大鼠血液學指標、血液生化指標，大體解剖后稱量臟器質(zhì)量，對大鼠主要臟器進行組織病理學觀察。

1.4.6 免疫功能學評價檢驗

按照衛(wèi)生部頒發(fā)的《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中增強免疫力功能檢驗方法操作[12]，包括測定臟器/體重比值、遲發(fā)型變態(tài)反應、半數(shù)溶血值(HC50)、NK細胞活性、小鼠碳廓清試驗、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗。

1.4.7 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，進行單因素方差分析，試驗分析結果用平均數(shù)±標準差(x±s)形式表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 急性毒性試驗結果

小鼠經(jīng)最大耐受劑量灌胃后14 d內(nèi)，雌性、雄性小鼠均未觀察到異常癥狀，無死亡，最大耐受劑量(MTD)均>24.80 g/kg BW。根據(jù)急性毒性半數(shù)致死劑量分級，判斷納豆軟膠囊內(nèi)容物屬無毒級。

2.2 骨髓細胞微核試驗結果

微核試驗是用于染色體損傷和干擾細胞有絲分裂的化學毒物的快速檢測方法。3個劑量組微核率與陰性對照相比，差異均無顯著性(P>0.05)；陽性對照與陰性對照的微核率比較，差異極顯著(P<0.01)，各劑量組PCE與NCE的比值均高于對照組的20%，結果見圖1。納豆軟膠囊內(nèi)容物小鼠骨髓細胞微核試驗為陰性。

圖1 小鼠骨髓細胞微核試驗結果(x±s, n=5)Fig.1 The results of mice bone marrow micronucleus test (x±s, n=5)

2.3 精子畸變試驗結果

表1 納豆軟膠囊對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響(x±s, n=5)Table 1 Effect of natto soft capsules on the sperm malformation rate of mice (x±s, n=5)

經(jīng)統(tǒng)計學分析，由表1可知，各劑量組精子畸形發(fā)生率與陰性對照比較無顯著性差異(P>0.05)；陽性對照與陰性對照比較差異極顯著(P<0.01)。納豆軟膠囊內(nèi)容物小鼠精子畸變試驗結果為陰性。

2.4 Ames試驗結果

將納豆軟膠囊內(nèi)容物在4株TA97、TA98、TA100、TA102鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株中進行平板摻入試驗，無論加與不加S9，不同納豆膠囊內(nèi)容物含量組均未顯著增加試驗菌株回復突變菌落數(shù)，判定沙門氏菌回復突變試驗結果為陰性。

2.5 30 d喂養(yǎng)試驗結果

2.5.1 納豆軟膠囊對大鼠體重的影響

表2 納豆軟膠囊對大鼠體重的影響(x±s, n=10)Table 2 Effect of natto soft capsules on the body weight of rats (x±s, n=10)

由表2可知，各劑量組不同性別大鼠生長活動正常，未見異常，各組大鼠體重與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，說明不同含量納豆膠囊內(nèi)容物未對大鼠的體重產(chǎn)生明顯影響。

2.5.2 納豆軟膠囊對大鼠食物利用率的影響

表3 納豆軟膠囊對大鼠進食量及食物利用率的影響(x±s, n=10)Table 3 Effect of natto soft capsules on food intake amount and food utilization rates of rats (x±s, n=10)

由表3可知，給予不同含量納豆軟膠囊內(nèi)容物進行灌胃后，各劑量組雌性、雄性大鼠食物利用率與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，納豆軟膠囊內(nèi)容物沒有對動物的進食量和食物利用率造成明顯影響。

2.5.3 血液學檢查結果

表4 納豆軟膠囊對大鼠血常規(guī)的影響(x±s, n=10)Table 4 Effect of natto soft capsules on blood routine parameters of rats (x±s, n=10)

由表4可知，各劑量組動物的血液學檢查結果中，紅、白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量及白細胞分類與對照組比較接近，差異不顯著(P>0.05)，各項數(shù)值均在正常范圍內(nèi)，說明納豆軟膠囊內(nèi)容物對動物的血常規(guī)指標無明顯影響。

2.5.4 血清生化檢驗結果

表5 血液生化指標結果(x±s, n=10)Table 5 The results of blood biochemistry indexes (x±s, n=10)

由表5可知，受試物各劑量組與空白對照組大鼠各項血液生化指標無明顯差異(P>0.05)，且血液生化指標各項數(shù)值處于大鼠血液指標正常參考值范圍內(nèi)。

2.5.5 納豆軟膠囊對大鼠臟器重量和臟體比的影響

受試物各劑量組重要臟器的重量和臟體比見表6。

表6 納豆軟膠囊對大鼠臟器重量及臟體比的影響(x±s, n=10)Table 6 Effect of natto soft capsules on viscera weight and viscera-body ratio of rats (x±s, n=10)

由表6可知，雄性、雌性大鼠各劑量組肝、脾、腎、睪丸(雄鼠)的重量和各臟器系數(shù)與陰性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。

2.5.6 病理組織學檢查

3個劑量組與對照組雌性、雄性大鼠在試驗期內(nèi)各組間動物體重無顯著差異，生長活動均正常，排泄物無異常。大體檢查各組動物臟器均未見病變，高劑量組與對照組雌性、雄性動物的主要臟器經(jīng)組織病理學檢查只發(fā)現(xiàn)個別輕微程度病變且沒有特異性分布，考慮為個體化因素，故總結為未發(fā)現(xiàn)明顯病理性改變，中、低劑量組動物未進行組織病理學檢查。

2.6 增強免疫力功能試驗結果

2.6.1 對小鼠臟器/體重值的影響

胸腺和脾臟是身體的中心免疫器官，是T淋巴細胞定居、分化及成熟的器官，它們與體重的比值可粗略估計機體的免疫水平[13]，脾臟指數(shù)指脾臟與體重的比值，胸腺指數(shù)指胸腺與體重的比值。

圖2 小鼠免疫器官臟器指數(shù)測定結果(x±s, n=12)Fig.2 The test results of viscera indexes of immune organs of mice (x±s, n=12)

由圖2可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量受試物30 d，各劑量組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)基本無差異且與陰性對照組間比較差異無顯著性(P>0.05)，表明受試物未對小鼠脾臟和胸腺產(chǎn)生影響。

2.6.2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)試驗結果

遲發(fā)型變態(tài)反應是由致敏T細胞介導的以單核細胞浸潤和細胞變性壞死為特征的損傷性炎癥反應，炎癥反應的強度可間接體現(xiàn)細胞免疫能力[14]。

圖3 受試物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響Fig.3 Effect of tested substances on delayed allergy of mice

由圖3可知，小鼠的足跖腫脹度隨著劑量的增加而升高，且數(shù)值均高于對照組。與對照組比較，中、高劑量組對小鼠足跖腫脹度的影響達到顯著水平(P<0.05)，即對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應能力有顯著影響。

2.6.3 對小鼠半數(shù)溶血值(HC50)的影響

半數(shù)溶血值，是指血清中溶血素的含量，是體外檢測體液免疫最佳的方法，小鼠血清中溶血素抗體的生成量能直觀清晰地反映出體液免疫功能的強弱[15]。當用綿羊紅細胞(SRBC)免疫小鼠淋巴細胞后，會產(chǎn)生溶血素，通過檢測釋放到血清中的溶血素抗體水平來評估個體特異性免疫功能。

表7 受試物對小鼠半數(shù)溶血值HC50的影響(x±s, n=12)Table 7 Effect of tested substances on half hemolysis value (HC50) of mice (x±s, n=12)

由表7可知，中、高劑量組小鼠半數(shù)溶血值有增高趨勢，但沒有顯著性差異(P>0.05)，即受試物對小鼠HC50無明顯影響。

2.6.4 對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響

采用小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗測定單核-巨噬細胞功能，巨噬細胞是機體發(fā)揮先天性免疫反應的主要免疫細胞，它能對細胞殘片及病原體進行噬菌作用，是機體免疫系統(tǒng)的第一道防線，評估小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力能夠衡量機體先天性免疫和細胞免疫功能[16]。

表8 小鼠單核-巨噬細胞功能的測定結果(x±s, n=12)Table 8 The testing results of mice monocyte-macrophage function (x±s, n=12)

由表8可知，經(jīng)統(tǒng)計學分析，經(jīng)口給予受試物30 d，各劑量組小鼠單核-巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)與陰性對照比較均有不同程度升高，無顯著性差異(P>0.05)，即受試物對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力無影響。

2.6.5 小鼠碳廓清試驗吞噬指數(shù)結果

圖4 小鼠碳廓清試驗吞噬指數(shù)結果Fig.4 The results of phagocytic indexes of mice carbon clearance test

經(jīng)口給予小鼠不同劑量受試物30 d，由圖4可知，中、高劑量組與陰性對照組比較差異有顯著性(P<0.05)，即中、高劑量組受試物能提高小鼠單核-巨噬細胞的碳廓清能力。

2.6.6 小鼠自然殺傷(NK)細胞活性試驗結果

NK細胞是機體重要的免疫細胞，具有天然防御功能，能夠識別靶細胞，殺傷介質(zhì)，其殺傷能力和范圍遠大于T細胞，無需預先致敏也能發(fā)揮免疫功能，殺傷多數(shù)受感染細胞和腫瘤細胞，維護機體免受感染[17]。

圖5 小鼠NK細胞活性試驗結果Fig.5 The results of mice NK cell activity test

采用乳酸脫氫酶測定法測定NK細胞活性，由圖5可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的受試物30 d，經(jīng)統(tǒng)計學處理，各劑量組NK細胞活性與對照相比均有所提高，但無顯著性差異(P>0.05)，說明受試物對小鼠的NK細胞活性無明顯影響。

3 結論

急性經(jīng)口毒性試驗是最基礎的毒理學安全性評價試驗，能夠初步評估毒性作用的靶器官和作用機制，為以后的亞急(慢)性等毒性試驗提供毒性作用和劑量選擇的依據(jù)[18]。本研究中納豆軟膠囊內(nèi)容物急性經(jīng)口毒性試驗最大耐受劑量MTD>24.8 g/kg BW，屬無毒級；骨髓細胞微核試驗能檢測染色體和染色體組畸變，精子畸形試驗通過評估受試物是否對精子生成、發(fā)育產(chǎn)生影響，判斷其對體內(nèi)生殖細胞是否具有遺傳毒性作用，Ames試驗是從原核細胞水平檢測受試物是否具有誘發(fā)基因突變能力[19]。 本研究中以上3項試驗結果均為陰性，表明納豆軟膠囊沒有致突變性。

本試驗納豆軟膠囊內(nèi)容物以2.50，3.75，5.00 g/kg BW的劑量(相當于人體推薦攝入量的50，75，100倍)，連續(xù)喂養(yǎng)30 d，各劑量組動物生長情況良好，未見異常，試驗期間各劑量組動物體重、進食情況、血液指標與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)；動物的各內(nèi)臟器官的大體觀察和高劑量組動物內(nèi)臟病理組織學檢查均未見與受試物有關的病理學改變，初步估計納豆激酶軟膠囊在本試驗劑量范圍內(nèi)，作為保健食品是安全的。

分別從細胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細胞和NK細胞活性方面測定研究了納豆軟膠囊對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。細胞免疫試驗發(fā)現(xiàn)，在遲發(fā)型免疫反應中，中、高劑量組足跖腫脹度顯著高于對照組(P<0.05)，表明其具有增強細胞免疫功能作用。單核-巨噬細胞功能試驗表明，其能夠顯著調(diào)節(jié)碳廓清能力。納豆軟膠囊對小鼠體重增長、小鼠半數(shù)溶血值、臟器/體重比值、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力、NK細胞活性沒有顯著性影響。參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》，試驗結果符合評價程序中“具有增強免疫力”的評價標準，因此可判斷納豆軟膠囊具有增強免疫力的功能。

隨著時代的進步和人們生活方式的變遷，人口老齡化問題日益凸顯，居民疾病譜已然發(fā)生重大變化，未來醫(yī)學將進入預防醫(yī)學年代，從單純的治療向預防保健方向轉(zhuǎn)化[20]，本研究初步驗證了納豆軟膠囊功效成分無毒無害且具有增強免疫力的功效，加上納豆激酶本身具有良好的溶血栓作用，為開發(fā)出安全性高、可供正常人群食用的增強免疫力的保健食品奠定了基礎。