胡棟寶，王艷，楊猛，李琛

(玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100)

老人頭菌，又名仙人頭，主要分布于云南、四川、西藏等地，生長在云貴高原3000 m以上松杉木、油杉等針葉林中陰濕疏松的地上，目前人工無法培植, 是一種珍稀的野生食用菌。老人頭菌潔白細嫩、滋味鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)及維生素，常被用作調(diào)味品。真菌多糖具有抗菌、抗病毒、抗凝血、降血脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1]，在食品工業(yè)及調(diào)味品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，例如：添加猴頭菇輔料制成的黑木耳復(fù)合多糖口服液能夠顯著增強小鼠的免疫能力[2]；香菇多糖能提高人體內(nèi)短鏈脂肪酸的含量，從而具有調(diào)節(jié)腸道菌群的能力[3]；雞腿菇多糖、靈芝多糖具有較強的抗氧化及降血糖功效[4]。目前，尚未見有關(guān)老人頭菌中多糖的提取及抗氧化活性的報道，為了進一步開發(fā)利用這種野生食用菌資源，本研究以云南產(chǎn)老人頭菌為原料，在單因素實驗的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)曲面法優(yōu)化其多糖的提取工藝，此外，采用體外清除DPPH自由基、ABTS+自由基及還原三價鐵離子3種方法評價了老人頭菌多糖提取物的抗氧化活性，將為老人頭菌在調(diào)味品領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與化學(xué)試劑

野生云南老人頭菌：購自云南玉溪市野生菌市場，曬干粉碎后過60目篩，干燥備用；葡萄糖、濃硫酸、苯酚：天津市風船化學(xué)試劑科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀和三氯化鐵：西隴科學(xué)股份有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)：美國Sigma公司；抗壞血酸：天津市雙船化學(xué)試劑廠；ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽：成都艾科達化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：四川西隴化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 主要實驗儀器

分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司；超聲清洗儀 上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；721可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 實驗處理方法

1.3.1 老人頭菌多糖的提取

準確稱取0.5000 g老人頭菌粉末，采用水提醇沉法超聲提取，濾液中加入3倍體積的95%乙醇于4～8 ℃放置12 h醇沉，離心，得多糖沉淀，復(fù)溶定容到25 mL，得多糖溶液。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的建立

精確稱取0.0500 g葡萄糖標準品，溶解，定容至100 mL，移取10.00 mL定容至50 mL，加純水稀釋成0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別移取0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.70，0.90 mL濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，加蒸餾水到2.00 mL，加1.00 mL 5%的苯酚溶液，加5.0 mL濃硫酸，搖勻，放置30 min，在波長490 nm處測定吸光度值，平行3次，繪制標準曲線，方程為y=54.013x+0.0045，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，線性擬合程度較好。

1.3.3 多糖得率的測定

取老人頭菌多糖溶液0.10 mL，加純水到2.00 mL，再加入1.00 mL 5%的苯酚溶液，加5.00 mL濃硫酸，混勻，靜置30 min，在490 nm處測吸光值，由標準曲線計算老人頭菌多糖提取率。

多糖提取率(%)=(C×V1×V2/V3×m)×100%。

(1)

式中：C為提取液中多糖的含量(mg/mL)；V1為比色液體積(mL)；V2為定容體積(mL)；V3為供試樣品體積(mL)；m為實驗樣品質(zhì)量(mg)。

1.4 單因素實驗

稱取0.5000 g樣品，分別在液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g)、超聲時間(10，20，30，40，50 min)、超聲溫度(30，35，40，45，50，55 ℃)、超聲提取次數(shù)(1，2，3次)4種不同的實驗條件下進行多糖的提取，參照多糖提取率測定方法進行測定，平行3次，計算得率[5]。

1.5 響應(yīng)面實驗分析

采用Box-Behnken方法進行四因素三水平實驗設(shè)計，以老人頭菌多糖提取率為指標，確定單因素中每個因素的最佳值后，進行響應(yīng)面實驗。實驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計Table 1 The response surface experiment design

1.6 抗氧化實驗

1.6.1 清除DPPH自由基能力的測定

取2.0 mL不同濃度的老人頭菌多糖溶液(0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 mg/mL)于比色管中，加入2.00 mL無水乙醇，加入2.00 mL 0.02 mg/mL DPPH溶液，混勻，室溫避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光度Ai[6]；以2.00 mL超純水替代0.02 mg/mL DPPH溶液，測吸光度Aj；以超純水替代多糖溶液測吸光度Ac，平行3次實驗。用VC作陽性對照，計算DPPH自由基清除率，公式如下：

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

(2)

1.6.2 清除ABTS+自由基能力的測定

取2.00 mL不同濃度的老人頭菌多糖溶液(0.075，0.1，0.125，0.15，0.175，0.2 mg/mL)于比色管中，加入3.00 mL ABTS+工作液，搖勻，室溫下避光放置6 min，在波長734 nm處測吸光度記為Ai，以3.00 mL無水乙醇替代ABTS+工作液測吸光度Aj，以2.00 mL無水乙醇替代多糖溶液測吸光度Ac，平行3次實驗，以VC作陽性對照，計算ABTS+自由基清除率，公式如下：

ABTS+自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

(3)

1.6.3 還原Fe3+能力的測定

取2.00 mL不同濃度的老人頭菌多糖溶液(0.075，0.1，0.125，0.15，0.175，0.2 mg/mL)，加入2.00 mL pH 6.6的磷酸緩沖溶液，再加入2.00 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻后加入2.00 mL 10%三氯乙酸溶液，搖勻，取2.00 mL溶液加入2.00 mL超純水，再加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，放置8 min,在700 nm處測吸光度，平行3次實驗，以VC作為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 液料比的選擇

在超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g)對老人頭菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 液料比對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction yield of polysaccharides

由圖1可知，當液料比達到20∶1時，多糖得率達到最大，之后逐漸下降，其原因可能是水的用量較小時，老人頭菌中的多糖溶解不夠完全，從而得率較低；當水的用量過大時，提取出來的其他雜質(zhì)的量隨之增加，降低了多糖得率[7-8]。故選擇液料比20∶1為最佳提取條件。

2.1.2 超聲時間的選擇

在液料比20∶1(mL/g)、超聲溫度50 ℃、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同超聲時間(10，20，30，40，50 min)對老人頭菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides

由圖2可知，超聲時間在10～30 min內(nèi)多糖得率逐步增加，30 min時達到峰值，之后多糖得率開始下降,可能是因為提取時間過短，多糖溶解不充分，但時間過長則可能會使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而使多糖得率降低。因此，最佳的超聲時間選擇30 min。

2.1.3 超聲溫度的選擇

在液料比20∶1(mL/g)、超聲時間30 min、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同超聲溫度(30，35，40，45，50，55 ℃)對老人頭菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of polysaccharides

由圖3可知，超聲溫度在30～50 ℃內(nèi)多糖提取率逐步增加，50 ℃時達到頂峰，之后多糖提取率下降，其原因可能是溫度較低時多糖提取不充分，而溫度過高會導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[9-10]。故最佳超聲溫度選擇50 ℃。

2.1.4 提取次數(shù)的選擇

在液料比20∶1(mL/g)、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃的條件下，研究老人頭菌提取1，2，3次對老人頭菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取次數(shù)對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the extraction yield of polysaccharides

由圖4可知，當提取次數(shù)為2次時其多糖提取率達到最高，2次之后提取率開始下降，可見超聲提取次數(shù)對老人頭菌多糖提取率有著很大的影響。因此，最佳提取次數(shù)為2次。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果

根據(jù)表1中的四因素三水平，生成29組實驗，得到多糖提取率,結(jié)果見表2，對其結(jié)果進行多元回歸擬合分析，得二次回歸方程為：Y=+2.66+0.0683A-0.0550B+0.0233C+0.0717D-0.0125AB-0.0025AC+0.0100AD-0.0425BC+0.0100BD+0.0150CD-0.2464A2-0.3814B2-0.04539C2-0.4262D2。

表2 響應(yīng)面實驗優(yōu)化設(shè)計結(jié)果Table 2 The response surface optimization scheme and test results

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the response surface quadratic model

續(xù) 表

由表3可知，模型的P<0.0001，非常顯著，而失擬殘差項的P=0.1488>0.05為不顯著[11-12]，因此，該模型能用于老人頭菌多糖提取的預(yù)測。在一次項A、B、C、D 4個影響因素中，D因素的F值最大，影響極顯著，A、B、C次之，在二次項中C2極顯著，A2、B2、D2顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖越陡峭則顯示該因素對其影響越明顯，反之，越平坦則影響越不明顯[13-14]，見圖5～圖8。

圖5 液料比和超聲時間對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour diagram of effects of liquid-solid ratio and ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides

圖6 液料比和超聲溫度對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour diagram of effects of liquid-solid ratio and ultrasonic temperature on the extraction yield of polysaccharides

圖7 液料比和超聲提取次數(shù)對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour diagram of effects of liquid-solid ratio and ultrasonic extraction times on the extraction yield of polysaccharides

圖8 超聲時間和超聲提取次數(shù)對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour diagram of effects of ultrasonic time and ultrasonic extraction times on the extraction yield of polysaccharides

由圖5可知，超聲時間變化曲面比液料比變化曲面陡峭，說明超聲時間對老人頭菌多糖提取率的影響更大；等高線呈橢圓形表明二者交互作用顯著。由圖6可知，液料比變化曲面比超聲溫度變化曲面平緩，說明液料比對老人頭菌多糖提取率的影響較小。由圖7可知，超聲提取次數(shù)變化曲面比液料比變化曲面陡峭，說明提取次數(shù)對多糖提取率的影響較大。

2.2.3 優(yōu)化與驗證實驗

依據(jù)以上響應(yīng)面實驗?zāi)Ｐ秃徒Y(jié)果，將多糖提取參數(shù)確定為：液料比20.701∶1(mL/g),超聲時間29.243 min，超聲溫度50.151 ℃，超聲提取次數(shù)2.086次；該實驗參數(shù)下老人頭菌多糖提取率為2.672%。應(yīng)用至實際中，調(diào)整實驗參數(shù)為：液料比21∶1(mL/g)，超聲時間29 min，超聲溫度50 ℃，超聲提取次數(shù)2次，老人頭菌多糖得率為2.625%。

2.3 老人頭菌多糖提取物體外抗氧化活性實驗

2.3.1 DPPH自由基的清除能力

由圖9可知，老人頭菌多糖提取物和抗壞血酸對DPPH自由基的清除效果均隨著濃度的升高而升高，當老人頭菌多糖濃度為1.3 mg/mL時，清除率達到94.22%。

圖9 不同濃度老人頭菌多糖提取物與抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力Fig.9 The scavenging activity of polysaccharide extracts fromCatathelasma ventricosum and ascorbic acids with different concentrations on DPPH free radicals

2.3.2 ABTS+自由基的清除能力

圖10 不同濃度老人頭菌多糖提取物與抗壞血酸對ABTS+自由基的清除能力Fig.10 The scavenging activity of polysaccharide extracts fromCatathelasma ventricosum and ascorbic acids with different concentrations on ABTS+ free radicals

由圖10可知，老人頭菌多糖提取物和抗壞血酸均能較好地清除ABTS+自由基，且兩者的清除效果隨著濃度的升高而增強，當其多糖濃度為0.2 mg/mL時，清除率達到90.29%。

2.3.3 還原Fe3+能力分析

圖11 不同濃度老人頭菌多糖提取物與抗壞血酸還原Fe3+能力Fig.11 The reducing activity of polysaccharide extracts from Catathelasma ventricosum and ascorbic acids with different concentrations on Fe3+

由圖11可知，隨著老人頭菌多糖濃度的升高，吸光度不斷增大，即還原力增強。老人頭菌多糖與VC陽性對照，老人頭菌多糖的總還原能力弱于VC。

3 結(jié)論

利用超聲波提取老人頭菌中的多糖，采取四因素三水平響應(yīng)面分析方法探討了4個因素對其多糖提取率的影響，得到老人頭菌中多糖最佳條件為：液料比21∶1(mL/g)，超聲時間29 min，超聲溫度50 ℃，提取次數(shù)2次。此外，研究了老人頭菌多糖的抗氧化活性，隨著其濃度的增加，其對DPPH、ABTS+自由基的清除作用增強，對Fe3+的還原能力也增強。