王志鵬，王璐

(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

葵花籽是制油工業(yè)原料的重要來(lái)源之一，用于榨油的葵花籽占總產(chǎn)量的50%～55%[1]，所產(chǎn)生的葵花籽粕多用作生產(chǎn)飼料、葵花蛋白，用部分葵花籽粕代替豆粕生產(chǎn)高附加值的醬油，葵花籽粕釀制的醬油有特殊香氣，具有一定的防腐功能，可以減少對(duì)供應(yīng)緊張的豆粕的需求?？ǖ鞍椎臓I(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)比例接近人體的需求，不僅沒(méi)有已知的毒性成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子，而且具有良好的消化率。同時(shí)，葵花蛋白具有優(yōu)異的功能和感官特性，可作為食品工業(yè)的風(fēng)味保持劑。但是在食品加工處理過(guò)程中，由于其自身成分的交互作用，影響葵花蛋白的營(yíng)養(yǎng)功能性質(zhì)和感官特性，不僅會(huì)降低其在人體內(nèi)的消化率，破壞其穩(wěn)定性，而且會(huì)縮短其儲(chǔ)存壽命。如葵花籽中存在殼和多酚，多酚的存在會(huì)導(dǎo)致葵花蛋白在堿性條件下提取時(shí)發(fā)生變色，生成綠色的產(chǎn)物從而影響葵花蛋白的感官特性[2]。多酚的存在不但會(huì)與賴氨酸和蛋氨酸等必需氨基酸相互作用，還會(huì)抑制蛋白酶活性[3-4]，引起消化不良及胃脹現(xiàn)象，降低葵花蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，無(wú)法滿足現(xiàn)代食品開(kāi)發(fā)的需要。

綠原酸作為葵花籽粕中主要的酚類物質(zhì)，在葵花蛋白提取過(guò)程中會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生共價(jià)及非共價(jià)作用，其共價(jià)作用會(huì)不可逆地生成CGA-蛋白共價(jià)復(fù)合物，非共價(jià)作用會(huì)可逆地生成CGA-蛋白復(fù)合物。但綠原酸并不會(huì)全部與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，在不同的酸堿環(huán)境和不同綠原酸與蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度條件下，蛋白質(zhì)與綠原酸結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目不同，因此在反應(yīng)體系中會(huì)同時(shí)存在結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的綠原酸。葵花蛋白與綠原酸形成CGA-蛋白復(fù)合物后，其平均相對(duì)分子質(zhì)量和分子柔性發(fā)生改變，從而影響葵花蛋白的溶解性、乳化性、持水性和持油性[5-6]。因此，進(jìn)一步探究綠原酸與葵花蛋白的不同結(jié)合狀態(tài)對(duì)葵花蛋白功能特性的影響具有十分重要的意義。

本研究采用不同的脫酚方式獲得葵花蛋白，并以堿溶酸沉法所得蛋白為對(duì)照，系統(tǒng)地研究綠原酸對(duì)葵花蛋白功能特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葵花籽仁：齊齊哈爾市甘南縣；綠原酸水解酶：日本天野酶制劑株式會(huì)社；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)：Sigma公司；大豆油：魯花，壓榨一級(jí)；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、乙腈(分析純)。

1.2 試驗(yàn)儀器

1260型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；FW80型高速粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；Kjeltec 8200型自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥福斯公司；S210-K型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；Alpha 2-4/LSC型真空冷凍干燥機(jī) 北京思達(dá)興業(yè)儀器有限公司；CF15RX型高速冷凍離心機(jī) Hitachi公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同工藝脫酚葵花蛋白的制備[7]

具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)：

篩選葵花籽：將去皮后的葵花籽放置于50 ℃的烘箱中烘干后脫脂3 h，自然干燥并粉碎得到葵花脫脂粕粉；

提取蛋白：將葵花脫脂粕粉以1∶10(m/V)料水比混合，并加入1 mol/L NaOH至溶液pH為8.5，然后放入水浴鍋(50 ℃)中水浴并攪拌2 h。利用離心機(jī)(4000 r/min)離心10 min，將上清液倒出并保留，再將沉淀物以1∶8(m/V)料水比洗滌，并重復(fù)上述操作，將2次離心出的上清液合并；

脫酚：將葵花脫脂粕粉以1∶5(m/V)料水比混合，將溫度升至30 ℃后，加入1 mol/L的HCl至溶液pH為6.5，加入1 U/g的酶，酶解3 h；

酸沉：將1 mol/L的HCl加入到酶解后的溶液中，調(diào)節(jié)溶液pH至4.5，利用離心機(jī)(4000 r/min)離心10 min，保留沉淀；

水洗：將沉淀以1∶10(m/V)料水比洗滌2次，利用離心機(jī)(4000 r/min)離心10 min，保留沉淀；

中和：將沉淀以1∶3(m/V)料水比加入去離子水，并加入1 mol/L NaOH至溶液pH為7.0左右；

干燥：利用真空冷凍干燥機(jī)將蛋白干燥，從而得到葵花蛋白。

工藝流程見(jiàn)圖1。

1.3.2 綠原酸含量的測(cè)定

參考GB/T 22250-2008和賈國(guó)凱等[8]的方法并稍加修改，利用高效液相色譜儀對(duì)綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定。

稱取0.1 g葵花蛋白置于離心管中，并加入30 mL 70%乙醇溶液，利用超聲波提取儀超聲提取30 min，利用離心機(jī)(3000 r/min)離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm水相濾膜待測(cè)。

色譜柱為T(mén)hermo Hypersil ODS-2 (250 mm×4.6 mm×5 μm)，流動(dòng)相為0.4%磷酸與乙腈以83∶17體積比混合的溶液，流動(dòng)相流動(dòng)速度為1.0 mL/min，等梯度洗脫，色譜柱溫度為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，進(jìn)樣量為10 μL。橫坐標(biāo)為綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，縱坐標(biāo)為峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=26.678x-43.18，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算葵花蛋白中綠原酸含量。

1.3.3 溶解性的測(cè)定

參照郭曉歌等[9]的方法，將0.2 g葵花蛋白分散于15 mL 0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，分別加入1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH至溶液pH分別為2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，7.0，9.0，并定容至20 mL，然后置于水浴搖床振蕩30 min，利用離心機(jī)(3000 r/min)離心20 min。取上清液，用微量凱氏定氮法測(cè)定上清液和蛋白樣品中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算公式為：

1.3.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照Pearce和Kinsella的方法比濁法[10]。將葵花蛋白加入到0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，制成1 g/L的蛋白溶液，然后將大豆油和蛋白溶液按照50∶150體積比進(jìn)行混合。利用均質(zhì)機(jī)(12000 r/min)將混合溶液均質(zhì)1 min。分別在均質(zhì)完成0 min和10 min時(shí)在底部取出50 μL的混合液，同時(shí)加入5 mL 1 g/L的SDS溶液并攪拌均勻。以1 g/L的SDS溶液為空白參比，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算公式為：

式中：EAI為乳化活性指數(shù)(m2/g)；T=2.303；A0為均質(zhì)完成0 min的吸光度值；C為蛋白溶液的濃度(g/mL)；Φ為溶液中油的體積分?jǐn)?shù)，0.25；ESI為乳化穩(wěn)定性；A10為均質(zhì)完成10 min的吸光度值。

1.3.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

參照Motoi等[11]的方法。將葵花蛋白加入到0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，制成1 g/L的蛋白溶液。利用高速組織攪拌機(jī)(12000 r/min)將蛋白樣品溶液攪拌1 min。利用攪拌后泡沫體積與攪拌前液體體積比，測(cè)定蛋白的起泡性FC。利用攪拌后靜置30 min的泡沫體積與攪拌后泡沫體積比，測(cè)定泡沫的穩(wěn)定性FS，重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算的公式為：

式中：V0為攪拌后泡沫體積，mL；VL為攪拌前液體體積，mL；V30為攪拌后靜置30 min泡沫體積，mL。

1.3.6 持水性和持油性的測(cè)定

參照Saetae等[12]的方法。

持水性的測(cè)定：稱取0.2 g葵花蛋白加入到離心管中，稱重為W1，然后將10 mL蒸餾水加入到離心管中并攪拌，靜置30 min。利用離心機(jī)(5000 r/min)離心30 min，倒出上清液，稱重為W2，計(jì)算公式如下：

式中：W0為葵花蛋白干重，g；W1為離心管與葵花蛋白重量之和，g；W2為離心后離心管與葵花蛋白重量之和，g。

持油性的測(cè)定：稱取0.2 g葵花蛋白加入到離心管中，然后將10 mL大豆油(V1)加入到離心管中并攪拌，靜置30 min。利用離心機(jī)(5000 r/min)離心30 min，將上清液倒進(jìn)量筒中讀數(shù)，記為V2，計(jì)算公式如下：

式中：W0為葵花蛋白干重，g；V1為大豆油的體積，mL；V2為離心后上清液的體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白樣品基本參數(shù)的測(cè)定

蛋白質(zhì)樣品的各項(xiàng)基本參數(shù)是蛋白功能特性指標(biāo)評(píng)定的基礎(chǔ)，原料蛋白和不同葵花蛋白產(chǎn)物指標(biāo)的測(cè)定參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 原料基本成分Table 1 The basic ingredients of different sunflower proteins

2.2 不同脫酚工藝對(duì)葵花蛋白溶解性的影響

圖2 不同葵花蛋白在pH 2～9的溶解性Fig.2 The solubility of different sunflower proteins at pH 2～9

由圖2可知，SFP、DDM-1和DDM-2在pH 4附近溶解性最低。DDM-1和DDM-2的溶解性在pH 2～9范圍內(nèi)始終高于SFP，且DDM-2的溶解性略優(yōu)于DDM-1。這是由于DDM-1和DDM-2中綠原酸大部分被脫除，其綠原酸的含量分別為SFP的12.5%和10.4%，大大減少了多酚與蛋白質(zhì)作用形成復(fù)合物的機(jī)會(huì)，并且DDM-2的綠原酸在堿溶酸沉過(guò)程前進(jìn)行脫除，從根本上減少了CGA-蛋白復(fù)合物的形成，使DDM-2的溶解性略優(yōu)于DDM-1。同時(shí)，由于在脫酚過(guò)程中，葵花蛋白需要進(jìn)行酶解處理，該過(guò)程可能改變了蛋白分子的大小和結(jié)構(gòu)，使親水基團(tuán)暴露在蛋白分子表面，對(duì)水分子的吸附能力增強(qiáng)，使葵花蛋白的溶解性增強(qiáng)[13]。

2.3 不同脫酚工藝對(duì)葵花蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

圖3 不同葵花蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig.3 The emulsifying activity and emulsifying stability of different sunflower proteins

由圖3可知，DDM-1和DDM-2的乳化性均高于SFP，分別為19.85 m2/g和18.65 m2/g，但DDM-1和DDM-2的乳化穩(wěn)定性均低于SFP?？赡苁怯捎谠诿摲舆^(guò)程中酶解作用會(huì)使蛋白質(zhì)的分子柔性增大，蛋白分子束縛力降低，端基的極性基團(tuán)增加，顯著提高了葵花蛋白的乳化活性[14-15]。同時(shí)，由于DDM-1和DDM-2的綠原酸被脫除，葵花蛋白與酚類作用減弱，使葵花蛋白的平均相對(duì)分子質(zhì)量降低，更容易在界面擴(kuò)散，降低了界面張力。但SFP中的蛋白與綠原酸作用，使葵花蛋白的平均相對(duì)分子質(zhì)量增加，更容易形成穩(wěn)定的乳化層，SFP的乳化穩(wěn)定性最高。

2.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)的起泡能力主要取決于蛋白質(zhì)的構(gòu)象，蛋白在溶于水時(shí)，小分子蛋白(肽鏈)迅速到達(dá)內(nèi)表面，吸附并快速形成疏水層，在蛋白表面形成疏水保護(hù)膜，其涉及蛋白內(nèi)在表面的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)。發(fā)泡能力在一定范圍內(nèi)與相對(duì)分子質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，相對(duì)分子質(zhì)量越小的蛋白質(zhì)發(fā)泡能力越好，但超過(guò)特定范圍時(shí)，發(fā)泡能力會(huì)隨相對(duì)分子質(zhì)量的減小而降低[16]。

圖4 不同葵花蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性Fig.4 The foamability and foam stability of different sunflower proteins

由圖4可知，DDM-2的起泡性顯著高于SFP和DDM-1(P<0.05)，為64.66%。這可能是由于DDM-2從根本上減少了綠原酸和蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合，降低了葵花蛋白的平均相對(duì)分子質(zhì)量，使蛋白質(zhì)能夠快速展開(kāi)并擴(kuò)散到界面形成界面膜[17]。同時(shí)在脫酚過(guò)程中的酶解作用會(huì)使蛋白質(zhì)的分子柔性增大[18]，易附在氣液的界面上，界面張力的降低導(dǎo)致了起泡性的增加。

DDM-1和DDM-2的泡沫穩(wěn)定性顯著高于SFP(P<0.05)，分別為82.88%和75.22%。且DDM-1的泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于DDM-2。這可能是由于在脫除綠原酸的過(guò)程中使用的乙醇使蛋白質(zhì)發(fā)生輕微變性[19]，蛋白質(zhì)重新折疊，使內(nèi)埋的疏水肽段暴露出來(lái)，增加了蛋白質(zhì)的疏水性，提高了泡沫穩(wěn)定性。同時(shí)，DDM-1的綠原酸在堿溶酸沉過(guò)程后進(jìn)行脫除，其蛋白的平均相對(duì)分子質(zhì)量較DDM-2大，有利于蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性[19]，使DDM-1的泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于DDM-2。

2.5 持水性及持油性

蛋白質(zhì)的持水性、持油性是食品加工過(guò)程中的重要功能特性，如肉制品加工、烘焙和冰激凌等，若應(yīng)用于風(fēng)味食品加工中，持油性可以提高蛋白與脂肪的結(jié)合能力，改善食品對(duì)脂肪的吸收和持油能力。

圖5 不同葵花蛋白的持水性及持油性Fig.5 The water holding capacity and oil absorption capacity of different sunflower proteins

由圖5可知，未脫酚蛋白質(zhì)SFP的持水性為2.71 g/g，DDM-1的持水性為2.52 g/g，DDM-2的持水性最低，僅為2.10 g/g。而不同蛋白樣品的持油能力差異顯著，后脫酚處理的葵花蛋白質(zhì)DDM-1的持油性最低，為3.39 mL/g，未脫酚葵花蛋白SFP的持油性比DDM-1高70%，先脫酚葵花蛋白的持油性最高，比DDM-1高97%。

蛋白質(zhì)的持水性和溶解性密切相關(guān)，一般來(lái)說(shuō)，溶解性越好，蛋白質(zhì)的保水性就越差[20]。體系中油與蛋白相互作用的作用力主要是非極性脂肪族鏈和非極性區(qū)域間的作用，如非共價(jià)鍵、氫鍵和疏水作用力[21]。DDM-1的處理過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象改變程度最大，致使其持油能力減弱。DDM-2處理過(guò)程避免了綠原酸與蛋白質(zhì)的非共價(jià)結(jié)合，較好地保護(hù)了疏水性氨基酸，蛋白質(zhì)與小油滴之間的疏水作用力未被破壞，使DDM-2的持油能力提升。

3 結(jié)論

不同工藝脫除葵花蛋白中綠原酸對(duì)葵花蛋白功能性質(zhì)的影響顯著，脫除葵花蛋白的綠原酸可提升其營(yíng)養(yǎng)特性和功能特性。從酶的種類看，商品酶對(duì)葵花蛋白的脫酚作用顯著，此外，從酶的脫酚方式來(lái)看，提取蛋白前脫酚DDM-2的功能性優(yōu)于DDM-1，與SFP相比，脫酚葵花蛋白DDM-1和DDM-2的溶解性、乳化性、泡沫穩(wěn)定性顯著提升。先脫酚葵花蛋白DDM-2的溶解性顯著提升，pH為7時(shí)的溶解性最高?？梢缘贸鲈谔崛〉鞍浊懊摲涌梢燥@著提升葵花蛋白的綜合功能性質(zhì)，本研究結(jié)果有助于提升葵花蛋白在食品加工中的應(yīng)用價(jià)值。