唐遠(yuǎn)謀，孫勁松，龐紫琳，劉洋，潘攀，王新惠

(成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610100)

隨著人們生活節(jié)奏的加快以及冷鏈系統(tǒng)的完善，人們對(duì)冷鮮肉制品的需求將越來(lái)越大[1]。冷鮮牛肉及其調(diào)理肉制品因其豐富的營(yíng)養(yǎng)和鮮美的口感受到廣大消費(fèi)者的青睞，但在貯藏過(guò)程中牛肉極易滋生微生物，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)。因此，如何抑制微生物生長(zhǎng)、延長(zhǎng)冷鮮牛肉的貨架期是一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。

乳酸鈉是肉制品中常見(jiàn)的添加劑，作為調(diào)味劑和保鮮劑添加在預(yù)調(diào)理肉制品中[2]，能夠有效抑制冷鮮肉和肉糜在儲(chǔ)藏過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)貨架期。針對(duì)不同的肉制品，如冷鮮肉、冷凍肉、腌臘肉制品等，常將乳酸鈉與乳酸鏈球菌素(Nisin)、檸檬酸、山梨酸鉀、雙乙酸鈉等其他食品添加劑復(fù)合使用[3]，以達(dá)到調(diào)味、延長(zhǎng)貨架期等目的[4]。 乳酸鈉具有較好的抑菌能力，Grosulescu等研究表明[5]，乳酸鈉在低溫下對(duì)單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)具有較好的抑制效果。Masana等發(fā)現(xiàn)乳酸鈉結(jié)合高壓滅菌能夠有效抑制腌制牛肉中的大腸桿菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)以及其他腐敗菌，并且發(fā)現(xiàn)3%的乳酸鈉能有效降低大腸桿菌O157:H7的致病性[6]。

目前，16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)已經(jīng)在肉類的研究中得到廣泛應(yīng)用[7]，但大部分僅停留在對(duì)微生物相對(duì)豐度的探究上。而隨著測(cè)序和分析技術(shù)的發(fā)展，如今絕對(duì)豐度的分析技術(shù)較成熟[8]，如Mou等[9]通過(guò)16S rRNA測(cè)序技術(shù)分析了綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素對(duì)人體腸道微生物群落絕對(duì)豐度的影響。微生物絕對(duì)豐度可以更準(zhǔn)確地反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)，避免了相對(duì)豐度分析時(shí)由于微生物A的減少而造成微生物B豐度升高的現(xiàn)象。

本研究將牛肉用乳酸鈉的生理鹽水溶液處理后進(jìn)行4 ℃冷藏，用生理鹽水進(jìn)行相同處理作為對(duì)照，并將冷藏1～7 d的樣品取樣，采用16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，在相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度的層面分析乳酸鈉對(duì)牛肉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及演替規(guī)律的影響，為乳酸鈉在冷鮮牛肉保鮮中的應(yīng)用提供了理論支持。

1 材料和方法

1.1 樣品的前處理與取樣

實(shí)驗(yàn)選用市面上常見(jiàn)的西門塔爾牛肉，購(gòu)于成都市十陵鎮(zhèn)久貿(mào)綜合市場(chǎng)。選取背最長(zhǎng)肌肉，分割成50 g左右的小塊后用無(wú)菌生理鹽水洗凈血水，并用濃度為3 g/dL的無(wú)菌生理鹽水的乳酸鈉溶液做浸泡處理[10]，浸泡時(shí)間為5 min，用無(wú)菌生理鹽水浸泡相同時(shí)間作為對(duì)照組。用無(wú)菌塑封袋進(jìn)行裝袋，并迅速保存于4 ℃冰箱中冷藏，分別于第1天、第3天、第5天、第7天取樣。每組的每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)樣品作為重復(fù)，空白組和實(shí)驗(yàn)組分別編號(hào)為C和SL。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

Qiagen凝膠回收試劑盒、無(wú)水乙醇、液氮、氯化鈉等：成都市科隆化學(xué)品有限公司；TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒：美國(guó)Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備

瓊脂糖凝膠電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司；5810R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；AP-60-395LA型超低溫冰箱 杭州艾普儀器設(shè)備有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將牛肉樣品取樣后用液氮急速冷凍，并置于-80 ℃冰箱中保存，待測(cè)。采用CTAB法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳儀檢測(cè)DNA的純度和濃度[11]。采用16S V3-V4區(qū)通用引物(515F和806R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳儀檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用Qiagen公司提供的凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，使用NovaSeq 6000測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.5 冷藏期間牛肉的感官評(píng)價(jià)

根據(jù)GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范》以及GB/T 17238—2008《鮮、凍分割牛肉》的相關(guān)要求制定感官評(píng)價(jià)表，見(jiàn)表1[13]。并由10名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的感官評(píng)價(jià)員對(duì)冷藏期間的樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，樣品的每項(xiàng)指標(biāo)得分之和除以10，即得到該項(xiàng)指標(biāo)的得分，最后用5項(xiàng)指標(biāo)得分之和表示感官總得分。

表1 牛肉的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 The sensory evaluation standard of beef

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用uParse軟件對(duì)所有樣本的全部Effective Tags進(jìn)行聚類[14]，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，篩選出現(xiàn)頻率最高的OTUs序列作為代表序列，利用FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)方法將數(shù)據(jù)進(jìn)行校正[15]，得到每個(gè)樣品中的絕對(duì)定量值，更加準(zhǔn)確地表現(xiàn)樣品中微生物群落的組成。使用Mothur方法與SILVA132的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋分析，設(shè)定閾值為0.8～1[16]，使用R以及OriginPro 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏期間樣品感官得分

冷藏期間牛肉的感官得分情況見(jiàn)圖1。

圖1 冷藏期間感官得分變化曲線Fig.1 Change curve of sensory score during cold storage

由圖1可知，在儲(chǔ)藏的1～2 d，C組和SL組的得分值相近，第3天開(kāi)始，C組開(kāi)始低于SL組；第4天開(kāi)始，兩組的得分差值迅速增加。并且空白組牛肉煮沸后肉湯從第4天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的異味，而實(shí)驗(yàn)組依然具備牛肉特殊的香味。當(dāng)儲(chǔ)藏第7天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組得分依舊有(34.2±2.01)分，依舊保持較好的外觀，而空白組僅(20.9±1.19)分，說(shuō)明經(jīng)過(guò)乳酸鈉的處理，牛肉能夠獲得更長(zhǎng)的貨架期。

2.2 測(cè)序結(jié)果

圖2 樣品的OTU稀釋曲線Fig.2 OTU dilution curve of samples

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將有效序列以97%的一致性聚類，共得到4884個(gè)OTUs，然后進(jìn)行物種注釋，得到30個(gè)門，346個(gè)屬。并且由OTUs稀釋曲線(見(jiàn)圖2)可知，隨著測(cè)序量的增加，得到的OTU數(shù)量逐漸趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序深度足夠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。

2.3 Alpha多樣性分析

表2 牛肉樣品的Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes of beef samples

由表2可知8個(gè)樣品的Alpha多樣性指數(shù)。其中，Group代表組名，每個(gè)組的值由3個(gè)重復(fù)樣品取平均值得到，Shannon和Simpson指數(shù)為微生物多樣性指數(shù)，其數(shù)值越大表示微生物多樣性越高。Chao1和ACE指數(shù)為微生物豐度指數(shù)，其值越大說(shuō)明物種豐度越高。C組的微生物多樣性指數(shù)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，Shannon和Simpson指數(shù)在第7天分別達(dá)到最大值2.28±0.36和0.64±0.06。而SL組則在第5天達(dá)到最大值，并在第7天微生物多樣性有所減??；C組的細(xì)菌豐度在第1天最高，Chao1和ACE指數(shù)分別為288.36±30.07和306.10±20.06，而SL組的細(xì)菌豐度在第5天達(dá)到最高，Chao1和ACE指數(shù)分別為544.84±150.66和579.78±137.86，兩組樣品的細(xì)菌豐度在儲(chǔ)藏期間均呈現(xiàn)上下浮動(dòng)的變化趨勢(shì)。在儲(chǔ)藏初期，兩組的細(xì)菌群落多樣性和豐度值相近，而在儲(chǔ)藏末期(第7天)，空白組的多樣性指數(shù)大于實(shí)驗(yàn)組，豐度指數(shù)小于實(shí)驗(yàn)組。

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律分析

2.4.1 門水平

儲(chǔ)藏1～7 d牛肉中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上的變化見(jiàn)圖3，圖3中a表示相對(duì)豐度前十的菌門，圖3中b表示絕對(duì)豐度前十五的菌門，其橫坐標(biāo)為OTUs的豐度值。

圖3 門水平上牛肉樣品中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)Fig.3 The bacterial community structure of beef samples at the phylum level

由圖3可知，第1天的6個(gè)樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較相似，主要以Proteobacteria占主導(dǎo)，相對(duì)豐度達(dá)90%左右，其次是Firmicutes，相對(duì)豐度為1.06%～5.12%；第3天的C組3個(gè)樣品與第1天的相比變化較大，主導(dǎo)菌為Firmicutes，相對(duì)豐度為93.20%～96.17%。SL3與SL1的變化不大，主導(dǎo)菌依然為Proteobacteria，相對(duì)豐度為87.97%～99.08%；第5天C5和SL5的6個(gè)樣品中，相對(duì)豐度較高的分別為Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria。此外，在SL5.1中鑒定出Actinobacteria，其相對(duì)豐度為15.78%，絕對(duì)豐度為10220，但在SL5.2和SL5.3中其絕對(duì)豐度僅為20和278，說(shuō)明樣品SL5.1可能受到污染；第7天，C7中Bacteroidetes和Firmicutes的含量較多，平均豐度分別為38.87%和53.70%。SL7中依然為Firmicutes占據(jù)主導(dǎo)，相對(duì)豐度為94.88%～97.07%。

兩組樣品中細(xì)菌的演替規(guī)律為：空白組的優(yōu)勢(shì)菌從Proteobacteria演替為Firmicutes，最后再由Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria共同主導(dǎo)；而實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌由Proteobacteria演替為Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria主導(dǎo)，再到最后由Firmicutes作為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。與空白組相比，經(jīng)過(guò)乳酸鈉的處理會(huì)使Bacteroidetes的生長(zhǎng)受到抑制。

2.4.2 屬水平

屬水平上，對(duì)冷藏期間牛肉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步分析，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4，圖4中a表示相對(duì)豐度前十的菌屬，圖4中b表示絕對(duì)豐度前十五的菌屬。

圖4 屬水平上牛肉樣品中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu) Fig.4 The bacterial community structure of beef samples at the genus level

由圖4可知，第1天的6個(gè)樣品中優(yōu)勢(shì)菌均為Ralstoniaspp.；第3天時(shí)，C組中相對(duì)豐度最高的菌屬演替為L(zhǎng)actococcusspp.，相對(duì)豐度為78.23%～85.55%，絕對(duì)豐度值為43177～54437，其次為Weissellaspp.，相對(duì)豐度為7.46%～16.72%，絕對(duì)豐度為4355～9228。SL3的優(yōu)勢(shì)菌Ralstoniaspp.的相對(duì)豐度與SL1相近，平均相對(duì)豐度由SL1的93.83%變?yōu)镾L3的93.46%，平均絕對(duì)豐度由56387下降到52568。此外，SL3中Lactococcusspp.的含量也有明顯增加，平均相對(duì)豐度從SL1的0.01%增加到SL3的3.20%，平均絕對(duì)豐度由5增加至1579；第5天，C5演替成以Lactococcusspp.為主導(dǎo)，并且Myroidesspp.、Weissellaspp.、Kurthiaspp.、Paracoccusspp.等菌屬也占有較大的比重，其平均豐度依次為68.29%、9.83%、8.82%、2.77%、1.43%。SL5的主要菌屬為L(zhǎng)actobacillusspp.，豐度為45.85%～67.44%，其他菌屬豐度高低依次為Weissellaspp.、Bifidobacteriumspp.、Lactococcusspp.、Bacteroidesspp.，其平均豐度分別為18.07%、5.05%、4.21%、1.03%；第7天，C7的主要菌屬以及平均豐度分別為：Lactococcusspp. 43.16%，Myroidesspp. 37.76%，Serratiaspp. 4.80%，Lactobacillusspp. 3.87%，Weissellaspp. 2.97%；SL7的主要菌屬以及平均相對(duì)豐度為：Lactobacillusspp. 70.60%，Weissellaspp. 17.32%，Lactococcusspp. 4.88%，Myroidesspp. 1.33%。

其中Ralstoniaspp.是一種近幾年新發(fā)現(xiàn)的條件致病菌屬，常見(jiàn)于土壤或者供水系統(tǒng)中[17]，它以絕對(duì)的占比優(yōu)勢(shì)成為C1和SL1多種樣品中的優(yōu)勢(shì)菌，并且SL3的3個(gè)樣品中Ralstoniaspp.依然具有較高的占比，說(shuō)明乳酸鈉的處理可以使初始菌屬存活較長(zhǎng)時(shí)間。Lactobacillusspp.和Lactococcusspp.兩種菌屬分別含有能產(chǎn)生細(xì)菌素Nisin[18]和sakacin P[19]的Lactococcuslactis和Lactobacillussakei，其產(chǎn)生的細(xì)菌素均可以作為安全的食品防腐劑。由圖4中b可知，Lactobacillusspp.在SL5和SL7中含量較多，這可能是由于乳酸鈉的添加形成了適宜Lactobacillusspp.生存的條件，導(dǎo)致Lactobacillusspp.在第5天之前取代了Ralstoniaspp.的優(yōu)勢(shì)地位，成為了樣品中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。而Lactococcusspp.在C3、C5和C7中含量較多，尤其是C3樣品中，平均絕對(duì)豐度是SL3中的31倍。但隨著儲(chǔ)藏期的延長(zhǎng)，其豐度有所下降，由第3天的平均絕對(duì)豐度49186下降至第7天的平均絕對(duì)豐度27132，這可能與Lactococcusspp.對(duì)低溫不耐受有關(guān)。此外，從第3天開(kāi)始，在空白組樣品中檢測(cè)出了Myroidesspp.，第3，5，7天的平均絕對(duì)豐度分別為1584，5481和22552，呈“指數(shù)型”增長(zhǎng)，并且在C7樣品中成為含量第二的優(yōu)勢(shì)菌屬，這是一種可能引起菌血癥、腔內(nèi)感染或肺炎的條件致病菌[20-21]。此外，Weissellaspp.在SL組中后期(第3～7天)的樣品中也有較高的豐度，Weissellaspp.是一種乳酸菌，常與食品中的風(fēng)味物質(zhì)形成有密切的關(guān)系[22]。由屬水平的分析發(fā)現(xiàn)，僅在SL5.1含量較高的Actinobacteria可能是Bifidobacteriumspp.，這是一種人和動(dòng)物體內(nèi)常見(jiàn)的菌群，在食品中常作為益生菌[23-24]。

屬水平上，對(duì)儲(chǔ)藏期間牛肉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，空白組出現(xiàn)兩個(gè)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌屬，即Lactococcusspp.和Myroidesspp.。而實(shí)驗(yàn)組的Lactobacillusspp.是儲(chǔ)藏中后期(第5～7天)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌，SL5和SL7的平均絕對(duì)豐度分別為34338和45981，分別是第二優(yōu)勢(shì)菌Weissellaspp.的3.05倍和4.04倍。因此，經(jīng)乳酸鈉處理的冷鮮肉具有較長(zhǎng)的保質(zhì)期，可能主要與牛肉中高豐度的Lactobacillusspp.有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，探究乳酸鈉浸泡處理的牛肉在儲(chǔ)藏期間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律。通過(guò)Alpha多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在儲(chǔ)藏初期，兩組的細(xì)菌群落多樣性和豐度值相近，而在儲(chǔ)藏末期，經(jīng)過(guò)乳酸鈉浸泡處理的冷鮮牛肉的細(xì)菌多樣性指數(shù)更低，豐度指數(shù)更高。通過(guò)細(xì)菌群落演替規(guī)律的分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)乳酸鈉的處理，牛肉樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在第3天以后才發(fā)生較大變化，而空白組前3 d的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。通過(guò)群落演替規(guī)律的分析，發(fā)現(xiàn)乳酸鈉的處理對(duì)Lactococcusspp.、Myroidesspp.和Serratiaspp.等菌屬的生長(zhǎng)具有一定的抑制效果，而能夠提升Lactobacillusspp.和Weissellaspp.在儲(chǔ)藏中后期樣品中的豐度，這可能是由于乳酸鈉能夠?yàn)檫@兩種菌群的生長(zhǎng)提供有利的環(huán)境。通過(guò)對(duì)C和SL兩組空間距相等牛肉樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Lactobacillusspp.在儲(chǔ)藏的第5～7天豐度較高，其中Lactobacillussakei可以產(chǎn)生的細(xì)菌素sakacin P會(huì)進(jìn)一步抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，并且能夠直接作為肉類防腐劑。但Lactobacillusspp.在實(shí)驗(yàn)組中豐度達(dá)60.65%～77.80%，其中Lactobacillussakei具體占據(jù)多大的比例，是否能在保鮮過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，有待進(jìn)一步探究。