許花芬, 馮 瓊, 李春蕾

(海南省人民醫(yī)院 新生兒科, 海南 ?？? 570311)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是兒童時(shí)期常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其主要病理特點(diǎn)為慢性氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應(yīng)性等[1]。哮喘嚴(yán)重威脅患兒生活質(zhì)量及心理健康，給家庭及社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[2]。相關(guān)研究[3]顯示，微小RNA-30a(miRNA-30a)靶向自噬相關(guān)基因5(ATG5), 并通過抑制自噬減輕哮喘患者氣道纖維化。LOU L L等[4]研究表明, miRNA-192-5p通過靶向基質(zhì)金屬蛋白酶-16(MMP-16)和自噬相關(guān)基因7(ATG7)減輕哮喘患者氣道重塑，推測(cè)MMP-16、ATG5、ATG7可能在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前，有關(guān)MMP-16、ATG5、ATG7與哮喘病情程度及肺功能相關(guān)性的研究仍較少。本研究分析哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA與肺功能的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2020年1月—2021年3月住院的哮喘患兒80例作為觀察組，男42例，女38例，年齡4～13歲，平均(7.02±2.16)歲; 將急性發(fā)作期患兒根據(jù)病情程度分為輕度組46例和中重度組34例。選取同期本院體檢兒童80例作為對(duì)照組，男43例，女37例，年齡5～13歲，平均(7.14±2.09)歲。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 符合兒童支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)者[5]; ② 患兒無嚴(yán)重哭鬧現(xiàn)象，依從性良好，可配合完成本研究; ③ 患兒臨床資料齊全，對(duì)照組無近期感染疾病史、變態(tài)反應(yīng)性疾病史以及家族過敏性疾病，哮喘患兒均為新發(fā)或停止規(guī)范吸入糖皮質(zhì)激素超過3個(gè)月的復(fù)發(fā)哮喘; ④ 兒童監(jiān)護(hù)人自愿參加本研究，同時(shí)簽署知情同意書，本研究獲本院臨床倫理委員會(huì)審核通過。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 伴有先天性代謝性疾病、免疫系統(tǒng)疾病及感染性疾病者; ② 過敏性哮喘或因支氣管、肺發(fā)育不良等疾病而引起喘息、咳嗽、氣促者; ③ 伴有重要臟器功能障礙或惡性腫瘤者。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(貨號(hào)R1200-100)購自北京索萊寶科技有限公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)RE0510-100T)購自定州百克賽斯生物科技有限公司; SYBR Green Master Mix(貨號(hào)BYGL-GK10002)購自南京北魚生物科技有限公司; 肺功能檢測(cè)儀(型號(hào)HI-801)購自日本捷斯特公司; 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀(型號(hào)CFX96)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存: 抽取各組(觀察組患兒分別于急性發(fā)作期和臨床緩解期各采集1次血樣)空腹外周靜脈血樣置于離心管中，并加入同等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)充分混勻，稀釋后將其緩慢、貼壁加入盛有外周血淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，切忌破壞界面。將樣品放入離心機(jī)中, 3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min后可見離心管中出現(xiàn)明顯分層。收集乳白色外周血單個(gè)核細(xì)胞層到EP管, 2 000轉(zhuǎn)/min低溫離心5 min。棄上清，收集乳白色細(xì)胞后加入5倍體積的PBS, 1 000轉(zhuǎn)/min低溫離心10 min, 棄上清，重復(fù)2～3次, -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平檢測(cè): 采用qRT-PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平。采用RNA提取試劑盒提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，測(cè)定純度及濃度后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Genbank獲得基因號(hào)，引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物后委托上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系: cDNA(50 ng/μL)5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各2 μL, SYBR Green Master Mix 25 μL, ddH2O 16 μL。各樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用2-△△CT法計(jì)算外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA相對(duì)表達(dá)量,GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 肺功能指標(biāo)檢測(cè): 采用肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)各組(觀察組患兒分別于急性發(fā)作期和臨床緩解期各檢測(cè)1次)兒童肺功能指標(biāo)，包括第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%)、用力肺活量(FVC)、最大呼氣峰流速占預(yù)計(jì)值百分比(PEF%), 計(jì)算第1秒用力呼氣容積占用力肺活量的比率(FEV1/FVC), 操作步驟均嚴(yán)格按照儀器使用說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 觀察組與對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞

MMP-16mRNA、ATG5mRNA和

ATG7mRNA水平比較

觀察組急性發(fā)作期和臨床緩解期外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，急性發(fā)作期外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA和ATG7mRNA水平高于臨床緩解期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 觀察組與對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA和ATG7 mRNA水平比較

2.2 觀察組與對(duì)照組肺功能指標(biāo)比較

觀察組急性發(fā)作期和臨床緩解期FEV1%、FEV1/FVC和PEF%低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 觀察組組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，急性發(fā)作期FEV1%、FEV1/FVC和PEF%低于臨床緩解期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 觀察組與對(duì)照組肺功能指標(biāo)比較 %

2.3 急性發(fā)作期哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞

MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA

與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性

Pearson分析結(jié)果顯示，急性發(fā)作期哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA與ATG5mRNA、MMP-16mRNA與ATG7mRNA、ATG5mRNA與ATG7mRNA均呈顯著正相關(guān)(r=0.536、0.542、0.534,P<0.05)，且MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA與FEV1%、FEV1/FVC、PEF%均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見圖1、表4。

A: MMP-16 mRNA與ATG5 mRNA的相關(guān)性; B: MMP-16 mRNA與ATG7 mRNA的相關(guān)性; C: ATG5 mRNA與ATG7 mRNA的相關(guān)性。圖1 急性發(fā)作期哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA的相關(guān)性

表4 急性發(fā)作期哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 輕度組與中重度組外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA及肺功能指標(biāo)比較

與輕度組比較，中重度組外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平較高, FEV1%、FEV1/FVC、PEF%較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 輕度組與中重度組外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16 mRNA、ATG5 mRNA、ATG7 mRNA及肺功能指標(biāo)比較

3 討 論

哮喘是一種氣道上皮下基底膜增厚、水腫、黏液高分泌、氣道平滑肌收縮的可逆性肺部疾病[6]。多種細(xì)胞及組分參與的炎性反應(yīng)、氣道結(jié)構(gòu)重塑和氣道上皮細(xì)胞損傷在哮喘發(fā)病中起重要作用[7-8]。哮喘發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，任何單一途徑的治療手段都可能有局限性[9]。

MMP-16是一種分泌型基質(zhì)金屬蛋白酶的活化劑，其細(xì)胞外活性主要受組織金屬酶抑制因子的控制，可作為預(yù)測(cè)癌癥化療敏感性的生物標(biāo)志物[10]。MMP-16與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲有關(guān)[11]。本研究中，哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA水平顯著升高，且隨著急性發(fā)作期哮喘患兒病情由輕度發(fā)展為中重度，外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，結(jié)合LOU L L等[4]研究結(jié)論，推測(cè)MMP-16mRNA表達(dá)水平升高后，可能通過調(diào)控氣道上皮下基底膜增厚、膠原蛋白沉積而參與氣道結(jié)構(gòu)重塑，進(jìn)而影響哮喘的發(fā)生、發(fā)展。DUANX J等[12]研究結(jié)果表明, MMP-16與哮喘疾病中的炎癥反應(yīng)有關(guān)。推測(cè)本研究中MMP-16mRNA的高表達(dá)也可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)來加速哮喘疾病的發(fā)生發(fā)展。既往研究[13]證明，炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展可激活自噬，而自噬可反饋調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)及分泌，最終影響炎癥性疾病的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。

隨著對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制的不斷深入研究，學(xué)者[14]發(fā)現(xiàn)作為細(xì)胞死亡程序的自噬在哮喘疾病的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。ATG與自噬密切相關(guān)，且在慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[15]。目前研究較為廣泛的ATG包括ATG5、ATG7、ATG6等，其中ATG5、ATG7對(duì)自噬的發(fā)生起決定性作用[16]。本研究中，哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞ATG5mRNA、ATG7mRNA水平顯著升高，且其水平隨著急性發(fā)作期哮喘患兒病情加重而進(jìn)一步升高，結(jié)合LIB B等[3]研究結(jié)論，推測(cè)病理狀態(tài)下ATG5mRNA、ATG7mRNA表達(dá)水平上升，自噬水平上升，自噬降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨基酸為膠原蛋白沉積提供能量和合成原料，進(jìn)一步加重氣道纖維化和氣道重塑，加速哮喘病情進(jìn)展。

本研究結(jié)果還表明，急性發(fā)作期哮喘患兒MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平與肺功能指標(biāo)FEV1%、FEV1/FVC、PEF%均存在相關(guān)性，且隨著治療后臨床緩解期患兒肺功能的改善，MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平也隨之下降，此結(jié)果提示各指標(biāo)變化對(duì)評(píng)估哮喘治療效果有重要作用，臨床中可通過檢測(cè)各指標(biāo)水平變化，評(píng)估哮喘肺功能改善程度及治療效果，為制訂更有效的治療方法提供參考。本研究中，急性發(fā)作期哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA均呈顯著正相關(guān)。胡紅霞等[17]研究結(jié)果顯示，ATG5可通過調(diào)節(jié)MMP-9影響細(xì)胞增殖和侵襲，推測(cè)MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA在哮喘的發(fā)病中可能同樣存在調(diào)控機(jī)制，其中ATG5mRNA、ATG7mRNA可能通過調(diào)控MMP-16mRNA的表達(dá)水平而參與哮喘的發(fā)生發(fā)展，其具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞MMP-16mRNA、ATG5mRNA、ATG7mRNA水平升高，且均與肺功能指標(biāo)FEV1%、FEV1/FVC、PEF%呈顯著相關(guān)性。MMP-16、ATG5、ATG7可能作為新的治療靶點(diǎn)用于哮喘急性發(fā)作期的治療，為新靶點(diǎn)的進(jìn)一步探究提供了思路。