劉寶， 江滟， 萬珊， 曹慧軍， 張筑陽， 費櫻*

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004)

隨著易感人群(免疫力低下患者等)的增加,侵襲性真菌感染在醫(yī)院內(nèi)發(fā)生的比例逐年增加，病死率居高不下[1]。真菌按培養(yǎng)形態(tài)可分為霉菌、酵母樣菌及雙相型真菌，臨床上的致病真菌主要以酵母樣真菌最常見[2-5]。不同地區(qū)侵襲性酵母樣菌的分布亦有差異，貴州省尚無相關報道。因此，為了解本地區(qū)侵襲性酵母樣菌感染的現(xiàn)狀，為臨床無菌體液感染性疾病的診斷和治療提供依據(jù)，本研究對2016—2021年貴州省某三甲醫(yī)院分離的無菌體液侵襲性酵母菌數(shù)據(jù)進行分析，現(xiàn)匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1標本及質控菌株來源 收集2016—2021年貴州省某三甲醫(yī)院臨床無菌體液標本185 980份，其中血101 152份、骨髓1 353份、胸水5 589份、腹水 10 368份、腦脊液14 796份、引流液3 478份、尿液40 452份；近平滑假絲酵母菌ATCC22019來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2主要儀器與試劑 梅里?；|輔助激光解析電離飛行時間質譜(VITEK-MS，法國 BioMerieux公司)，BACTEC 9120 和BACTECTMFX 400全自動血培養(yǎng)儀及其配套血培養(yǎng)瓶(美國BD公司)；革蘭染液(珠海貝索生物技術有限公司)，哥倫比亞血平板、萬古巧克力平板及科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，沙堡弱培養(yǎng)基(sabouraud dextroseagar，SDA；英國Oxoid公司)，巰基乙酸酯培養(yǎng)基(重慶龐通醫(yī)療公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1病原菌株的分離培養(yǎng)與鑒定 無菌體液中血和骨髓標本按血培養(yǎng)送檢規(guī)范及要求采集注入需氧血培養(yǎng)瓶內(nèi)，于全自動血培養(yǎng)儀中培養(yǎng)；對儀器報警培養(yǎng)陽性的標本，完成涂片并轉種于哥倫比亞血平板、巧克力平板(無添加抗生素)及沙保弱培養(yǎng)基；其他標本采用巰基乙酸酯培養(yǎng)基増菌24 h后轉種于血平板和沙保弱培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～72 h；嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第4版)[6]分離菌種，分離的侵襲性酵母樣菌真菌采用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基、梅里埃API 20 CAUX鑒定系統(tǒng)以及基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術鑒定。

1.2.2體外藥物敏感性試驗 采用梅里埃公司的ATB-FUNGUS 3試驗試劑盒完成藥敏檢測，質控菌株選用近平滑假絲酵母菌ATCC22019。根據(jù)CLSI M27-A3和ATB FUNGUS 3說明書中的藥敏折點標準判讀結果，以敏感(susceptible，S)、中介(intermediate，I)、劑量依賴性敏感(susceptible-dose dependent，SDD)及耐藥(resistant，R)顯示。受限于試驗條件，無法完成絲狀真菌的鑒定及藥敏試驗。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 Whonet 5.6 軟件和Excel 2007軟件對試驗結果進行分析，計數(shù)資料以率(%)呈現(xiàn)。

2 結果

2.1 菌種、標本來源的檢出情況

185 980份臨床無菌體液標本共檢出侵襲性酵母樣菌2 122株，其中以白假絲酵母菌檢出最多(占比36.76%)，其次為光滑假絲酵母菌(13.90%)和熱帶假絲酵母菌(8.67%)，隱球菌屬中新生隱球菌復合體檢出最多(占85.7%)；2 122株侵襲性酵母菌中，50.61%(1 074/2 122)菌株分離自尿液，35.16%(746/2 122)分離自血液，6.88%(146/2 122)分離自腹水。見表1。

表1 2016—2021年貴州省某三甲醫(yī)院臨床無菌體液標本中侵襲性酵母樣菌的檢出情況[n(%)]Tab.1 Detection of invasive yeast in sterile body fluids from a Grade-A tertiary hospital in Guizhou from 2016 to 2021 [n(%)]

2.2 患者的性別、年齡及科室分布情況

檢出侵襲性酵母菌患者中男性占54.95%、女性占45.05%，年齡0～101歲、以15～65歲患者最多(占49.95%)、>65歲患者占47.03%、29 d～14歲患者占2.83%、≤28 d患者占0.19%；分離菌株主要來自住院病人1 958 例(92.27%)，門急診病人164例(7.73%)；住院病人來自重癥監(jiān)護室1 173例(59.91%)、內(nèi)科患者255例(13.02%)、外科患者208例(10.62%)及其他科室(包括感染疾病科、兒科、新生兒、婦產(chǎn)科病房等)患者322例(16.45%)。

2.3 體外藥敏試驗的耐藥情況

研究結果表明，兩性霉素 B和5-氟胞嘧啶對常見侵襲性酵母樣菌保持較高的抗菌活性、敏感性均>90%，熱帶假絲酵母菌對唑類藥物敏感率僅為50%左右，近平滑假絲酵母菌對抗真菌藥物普遍敏感，隱球菌屬除對伊曲康唑的敏感率較低(76.7%)、對其它藥物均100%敏感。見表2。

表2 2016—2021年貴州省某三甲醫(yī)院臨床無菌體液標本中檢出的侵襲性酵母樣菌的體外藥敏試驗結果Tab.2 Drug sensitivity test of invasive yeast in sterile body fluids from a Grade-A tertiary hospital in Guizhou from 2016 to 2021

3 討論

據(jù)中國侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(China hospital invasive fungal surveillance net，CHIF-NET)的報道，中國深部真菌感染中以念珠菌(假絲酵母菌)感染最多(占90.5%)，念珠菌感染中以白假絲酵母菌(34.6%)排首位[2]。本研究中，念珠菌占98%，白假絲酵母菌占比36.76%，與段思蒙等[3]報道一致。白假絲酵母菌引起的真菌感染占主要地位，這也許和白假絲酵母菌比其它假絲酵母菌更易粘附到上皮、內(nèi)皮及吞噬細胞表面，可分泌溶血磷脂酶和磷脂酶A保護不被外界侵犯，同時菌絲形成較多、較快有關[4-5]。但近年來念珠菌感染的種類和耐藥性出現(xiàn)明顯變化，特別是非白假絲酵母菌感染呈現(xiàn)的上升趨勢[2-3,7]，應引起重視。

2 122株侵襲性酵母菌中分離自尿液的菌株最多(50.61%)，可能與無菌體液標本類型分布有關，提醒臨床醫(yī)生應對尿路念珠菌感染引起重視。尿路念珠菌感染的危險因素主要包括糖尿病、留置導尿管、使用廣譜抗生素、尿路梗阻及進入重癥監(jiān)護病房等[8-9]，當有上述危險因素并存時，應充分考慮尿路念珠菌感染的可能性，及時送檢標本，并根據(jù)微生物結果合理應用真菌藥物。其次是分離自血液(35.16%)，可能與真菌菌血癥患者大多存在嚴重基礎疾病如實體惡性腫瘤、腦出血或嚴重顱腦損傷及其他因素有關[10]。

本研究分離的132株近平滑假絲酵母菌中96.21%均分離自血液，值得臨床一線的醫(yī)護人員關注,而近平滑假絲酵母菌引起的真菌血癥感染，據(jù)文獻報道常通過各類導管入血，與護理措施和醫(yī)院感染控制相關[11]。

從流行病學角度分析,男性占54.95%，女性占比45.05%；年齡范圍0～101歲,其中成人患者占49.95%，老年患者占47.03%，可見高齡患者更易受侵襲性真菌侵犯,這可能與高齡患者慢性病種類較多、基礎疾病并存、長期使用抗菌藥物及免疫力低下有關[12]。

分離菌株主要來自住院病人，占92.27%；主要原因在于當住院患者早期發(fā)生深部真菌感染時，常無明顯的臨床癥狀和表現(xiàn)，即便有輕微的臨床癥狀也易被原發(fā)疾病的癥狀掩蓋，導致臨床難以診斷，進而影響治療[13]。住院病人主要來自重癥監(jiān)護室，占59.91%，可能原因是重癥監(jiān)護室的患者長期臥床，基礎疾病情況復雜，免疫功能低下，再加上常需要使用大量抗菌藥物治療感染，引起體內(nèi)菌群失調(diào)；重癥患者常會留置中心靜脈插管，因其會破壞皮膚黏膜屏障防御功能的完整性，真菌易寄植在中心靜脈插管，進而形成靜脈導管相關性真菌敗血癥[14]。另外，外科患者檢出208例，占10.62%，易感因素包括留置導尿管、人工機械通氣、全胃腸外營養(yǎng)和使用多種(≥2)抗菌藥物等[15]。

本研究中兩性霉素B和5-氟胞嘧啶對常見侵襲性酵母菌保持較高的抗菌活性，敏感性均>90%，臨床療效好。但研究報道，5-氟胞嘧啶易在短時間內(nèi)產(chǎn)生耐藥且具有血液毒性[16]，而兩性霉素B因其具有蓄積性腎毒性，臨床上單獨應用治療真菌感染較少，故臨床常將二者聯(lián)合使用，可適度減少毒性大的抗菌藥物劑量，如聯(lián)合治療隱球菌腦膜炎時，可通過減少兩性霉素B的劑量進而減少毒性反應[17-19]。

本研究中白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌及隱球菌屬對氟康唑和伏立康唑保持高度敏感，敏感率>94%，但對伊曲康唑的敏感性低于氟康唑和伏立康唑，而伊曲康唑的藥敏結果僅供臨床參考，原因在于伊曲康唑僅適用于解釋治療黏膜念珠菌的感染，同時藥敏折點僅有口服制劑的判斷標準，尚未確立靜脈制劑的藥敏折點[20]。光滑假絲酵母菌唑類藥物耐藥的形成是多個因素相互作用的復雜過程，單一耐藥機制或單個耐藥因素都不能完全解釋光滑假絲酵母菌的耐藥現(xiàn)象[10]。

臨床對于侵襲性真菌病的診斷和治療取決于侵襲性真菌的精準鑒定與藥敏試驗結果，實驗室應使用多種方法(常規(guī)表型鑒定方法、分子生物學等)進行確認從而提高實驗室檢驗能力和水平。此外，傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法耗時較長，實驗室應多開展深部真菌感染診斷更高效更快捷的方法[如1,3-β-D葡聚糖檢測(fungus 1-3-β-D glucan assay，G試驗)、半乳糖甘露醇聚糖抗原檢測(galactomannan antigen test，GM試驗)等][21]，為臨床早期聯(lián)合診斷提供有利依據(jù)。

不同地區(qū)、不同的無菌體液標本類型，其侵襲性酵母樣真菌的分布和耐藥情況亦不相同[2-5,19-26]。侵襲性酵母樣真菌已經(jīng)成為臨床感染的重要病原菌，其引發(fā)的感染已表現(xiàn)出上升趨勢。臨床科室和微生物實驗室都應高度重視深部真菌病原學檢驗及其耐藥監(jiān)測工作，在易感群體中采取有效的院感防控措施，精準鑒別，早日診斷、合理用藥，有效遏制耐藥形勢。