丁艷平，張培怡，董曉慶，李昕妍，馬一凡

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

電離輻射(Ionizing radiation， IR)在醫(yī)學(xué)上常用于腫瘤和癌的放射治療[1]，其對(duì)人體損傷程度可因輻射劑量及機(jī)體輻射敏感度而異．對(duì)正常組織輻射毒性機(jī)制的評(píng)價(jià)表明，炎癥在早期和晚期IR的不良反應(yīng)中起著重要作用．近年來(lái)，有研究表明，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體的表達(dá)上調(diào)在輻射損傷中起關(guān)鍵作用[2]．NLRP3炎癥小體作為激活Caspase-1的多蛋白復(fù)合物，可導(dǎo)致白介素-18(IL-18)和白介素-1β(IL-1β)等促炎細(xì)胞因子成熟[3]．研究表明，NLRP3炎癥小體的上調(diào)對(duì)輻射損傷有很大影響，其中包括輻射引起的口腔粘膜炎[4-5]、皮膚反應(yīng)[6]、肺損傷[7-8]、腸道損傷[9]．前期的實(shí)驗(yàn)表明，輻射會(huì)對(duì)腎[10]和肺[11]的功能及組織學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)水平造成不同影響，但是輻射對(duì)肝臟的損傷及NLRP3炎癥小體在肝臟放射損傷中的作用鮮有報(bào)道.文中通過(guò)Co60γ輻射建立小鼠輻射模型，檢測(cè)輻射對(duì)小鼠肝臟形態(tài)、功能及NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的影響．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性昆明小鼠(20～25 g)購(gòu)于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(甘)2018-0002．飼養(yǎng)室內(nèi)溫度保持在23±2 ℃，明暗周期12 h，自由飲水和進(jìn)食．將小鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(Control組)和輻射組(IR組)，每組20只．IR組在蘭州維特輻照公司進(jìn)行8Gy的Co60γ射線全身一次性均勻輻射．

1.2 樣本采集

將每組10只小鼠進(jìn)行灌流固定，取肝臟做蘇木精-伊紀(jì)(HE)染色和免疫熒光染色；另外10只小鼠眼眶靜脈采血后斷頸處死，迅速在肝臟取2 mm3大小的組織固定于2.5%戊二醛中用于電鏡檢測(cè)，剩余的肝組織在-80 ℃保存用于免疫印跡(Western blotting)檢測(cè)．血液樣本以2 000 r·min-1離心10 min，取血清送檢，其中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平作為肝功能的指標(biāo)．電鏡樣本的制作、拍照和血清樣本的檢測(cè)均交由武漢賽維爾生物科技有限公司完成．

1.3 肝組織HE染色和免疫熒光染色觀察

HE染色：取上述固定的各組小鼠肝組織，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(8 μm)后用HE染色，在顯微鏡下進(jìn)行觀察及拍照．

免疫熒光染色：石蠟切片經(jīng)脫臘、修復(fù)、封閉后用NLRP3一抗(兔抗-NLRP3，博奧森)4 ℃孵育過(guò)夜，用熒光素標(biāo)記的二抗異硫氰酸熒光素(FITC)37 ℃孵育30 min后,再用4,6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)染液室溫孵育15 min，最后用甘油緩沖液封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照．

1.4 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

將-80 ℃凍存的肝臟組織按照提取總蛋白的方法提取腎總蛋白，用二辛酸(BCA)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量．取蛋白于10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上．5%脫脂奶粉封閉1 h，將一抗(NLRP3， Caspase-1,IL-1β)4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜5次，每次5 min；二抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST清洗5次，每次5 min，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)液放射自顯影．顯影結(jié)果用Image J進(jìn)行條帶分析，結(jié)果用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)校正．各抗體稀釋比均為1∶1000．

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

蛋白數(shù)據(jù)先用ImageJ進(jìn)行灰度值取值，收集的數(shù)據(jù)用SPSS17軟件進(jìn)行處理，單因素ANOVA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誤差以及顯著性分析，最后用Origin 7.5作圖．

2 結(jié)果

2.1 肝組織HE染色和透射電鏡觀察

從肝臟的HE染色可以看出(圖1)，肝細(xì)胞排列成索狀，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細(xì)胞索有分支，彼此吻合成網(wǎng)．相較于對(duì)照組，輻射組的肝臟表現(xiàn)出肝細(xì)胞索排列紊亂，肝竇明顯變寬且肝細(xì)胞形狀發(fā)生空泡變性，呈現(xiàn)病理特征．

注：箭頭指向肝竇；三角指向空泡變性

用透射電鏡觀察輻射對(duì)小鼠肝細(xì)胞的病理?yè)p傷的影響．如圖2所示，對(duì)照組正常肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為：細(xì)胞核圓潤(rùn)，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原顆粒分散在細(xì)胞質(zhì)中，肝細(xì)胞間可見(jiàn)膽管并且肝細(xì)胞間細(xì)胞邊界明顯．輻射組相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞核固縮，糖原顆粒的隨機(jī)散布變少，肝細(xì)胞邊緣消失，細(xì)胞質(zhì)呈海綿狀，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，膽管管腔內(nèi)可見(jiàn)電子致密物(黃色箭頭)．表明輻射可以引起肝臟組織超微結(jié)構(gòu)的損傷．

N：肝細(xì)胞核；cb：細(xì)胞邊界；箭頭所指為膽管

2.2 對(duì)肝功能生化指標(biāo)的檢測(cè)

ALT和AST是肝功能損傷檢測(cè)的重要指標(biāo)．ALT參與人體蛋白質(zhì)新陳代謝，可加快體內(nèi)氨基酸的轉(zhuǎn)移，主要存在于肝細(xì)胞的細(xì)胞漿；AST能促進(jìn)蛋白質(zhì)氨基轉(zhuǎn)化作用．如圖3所示，IR組小鼠血清ALT(圖3a)和AST(圖3b)明顯高于Control組(P<0.001)．說(shuō)明輻射會(huì)引起肝臟功能損傷，輻射后肝臟會(huì)發(fā)生代謝功能改變，輻射誘導(dǎo)肝細(xì)胞釋放化學(xué)物質(zhì)，隨后進(jìn)入血液循環(huán)．

與對(duì)照組相比， ***P<0.001

2.3 肝組織中NLRP3表達(dá)情況

NLRP3是NLRP3炎性小體的重要配件，在肝細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，免疫熒光法檢測(cè)其陽(yáng)性表達(dá)位于胞漿．如圖4所示，細(xì)胞質(zhì)中的NLRP3陽(yáng)性表達(dá)為綠色熒光，肝細(xì)胞的核進(jìn)行DAPI染色呈藍(lán)色熒光，將二者融合得到Merge圖像，檢測(cè)NLRP3炎性小體在肝細(xì)胞中的位置和表達(dá)情況．結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中NLRP3陽(yáng)性細(xì)胞很少，輻射組的陽(yáng)性表達(dá)對(duì)比對(duì)照組的NLRP3陽(yáng)性表達(dá)明顯升高，說(shuō)明輻射可以激活肝臟NLRP3炎性小體．

圖4 對(duì)照組和輻射組肝臟NLRP3(綠色)免疫熒光表達(dá)(400×)

2.4 肝組織中的NLRP3，IL-1β，Caspase-1的蛋白表達(dá)

為檢測(cè)輻射誘導(dǎo)激活NLRP3炎癥信號(hào)通路，測(cè)定了肝組織中的NLRP3，IL-1β，Caspase-1的蛋白表達(dá)變化．如圖5所示，與對(duì)照組相比，輻射處理后NLRP3，IL-1β，caspase-1蛋白表達(dá)量明顯呈上升趨勢(shì)，具有極顯著性差異(分別為P<0.01，P<0.001，P<0.001)．結(jié)果提示，輻射可以激活肝臟NLRP3炎性小體通路．

a為NLRP3，Caspase-1，IL-1β在肝組織的Weastern Blotting的結(jié)果； b，c，d分別為小鼠肝中NLRP3， Caspase-1，IL-1β蛋白的相對(duì)灰度值變化統(tǒng)計(jì)圖，以GAPDH為內(nèi)參(**P<0.01， ***P<0.001)

3 討論

研究表明,4.5 GHz手機(jī)輻射電磁場(chǎng)可使大鼠肝臟組織出現(xiàn)竇樣擴(kuò)張、局灶性濾過(guò)、枯否細(xì)胞減少、肝細(xì)胞脂肪變性等[12]．頻率為2.45 GHz的電磁場(chǎng)中大鼠肝臟組織會(huì)出現(xiàn)中度充血、肝竇擴(kuò)張、肝小葉內(nèi)小的炎性球囊炎，電鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞有不同大小和形狀的囊泡、脂滴和光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的增生[13]．本實(shí)驗(yàn)HE染色病理檢測(cè)結(jié)果表明，相較于對(duì)照組，輻射組的肝臟表現(xiàn)為肝細(xì)胞索排列紊亂、肝竇明顯變寬且肝細(xì)胞形狀發(fā)生氣球樣變；超微結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出核固縮、肝細(xì)胞邊緣消失、細(xì)胞質(zhì)呈海綿狀等變化，這與有關(guān)研究結(jié)論一致[14-15]，說(shuō)明Co60γ照射可對(duì)小鼠肝臟造成形態(tài)學(xué)損傷．在暴露于電磁場(chǎng)的母鼠所生的仔鼠肝臟輻射模型中，ALT和AST水平明顯升高[16]．ALT與AST為臨床肝功能檢測(cè)指標(biāo)，其含量增高常常與肝損傷程度成正比．Eassawy等研究表明，過(guò)量使用APAP或γ射線治療大鼠會(huì)引起肝毒性，導(dǎo)致肝酶活性(ALT，AST,堿性磷酸酶，谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶，乳酸脫氫酶和蘋(píng)果酸脫氫酶)顯著增加[17]．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，輻射組血清中ALT，AST水平較對(duì)照組極顯著升高，這與Abou-Zeid等的研究結(jié)果一致[18]，表明Co60γ照射可對(duì)肝功能造成損傷．

炎癥小體既能識(shí)別病原相關(guān)分子模式，又能識(shí)別宿主來(lái)源的危險(xiǎn)信號(hào)分子，所以通常被認(rèn)為是一種大型的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)平臺(tái)，其中包含胞質(zhì)模式識(shí)別受體，尤其是核苷酸結(jié)合的寡聚化域樣受體(NLR)或黑色素瘤中缺失的一種2型受體(AIM2)[19]．在NLR炎性小體復(fù)合物中，NLRP3炎性小體的作用最為突出，NLRP3炎性小體可以調(diào)控兩種促炎白細(xì)胞介素-1家族細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的激活，IL-18和IL-1β的積累通過(guò)募集嗜中性粒細(xì)胞和加速肝臟病理而充當(dāng)促炎介質(zhì)[20-21]．NLRP3炎癥小體的激活和組裝機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，目前普遍認(rèn)為NLRP3炎癥小體有3種激活模式：第1種激活模式認(rèn)為ATP作為NLRP3激動(dòng)劑，使細(xì)胞外的NLRP3激動(dòng)劑進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與NLRP3的形成；第2種激活模式認(rèn)為顆粒結(jié)構(gòu)或晶體結(jié)構(gòu)，包括石棉、尿酸鈉、硅、淀粉樣蛋白可作為激動(dòng)劑，吞噬細(xì)胞吞噬這些激動(dòng)劑導(dǎo)致溶酶體損傷，進(jìn)而導(dǎo)致溶酶體內(nèi)容物的胞質(zhì)釋放，通過(guò)組織蛋白酶依賴的NLRP3配體過(guò)程；第3種激活模式中，所有的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)都會(huì)觸發(fā)活性氧(ROS)的產(chǎn)生．硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)是NLRP3的配體，且對(duì)ROS敏感．在正常生理?xiàng)l件下，氧化還原酶硫氧還蛋白(TRX)與TXNIP結(jié)合，并抑制其活性；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS濃度增加時(shí)，該復(fù)合物解離，TXNIP與NLRP3(主要是亮氨酸富集的重復(fù)區(qū)LRRs結(jié)構(gòu)域)結(jié)合進(jìn)而觸發(fā)NLRP3炎癥小體的形成[2]．在NLRP3與肝臟相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝炎(NASH)患者中，NLRP3和IL-1β水平與肝纖維化呈正相關(guān)，而且NASH的發(fā)展與肝細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體的激活和Kupffer細(xì)胞內(nèi)Caspase-1的激活有關(guān)[22-23]，Casp1基因敲除小鼠和Kupffer細(xì)胞衰竭的野生型小鼠表現(xiàn)出較輕的飲食誘導(dǎo)的脂肪性肝炎[24-25]；在不同小鼠食源性脂肪肝模型中，NLRP3和成熟IL-1β水平升高也與肝纖維化呈正相關(guān)[26]．此外，Nlrp3基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的肝損傷和纖維化保護(hù)作用，而三苯氧胺誘導(dǎo)的Nlrp3敲除小鼠表現(xiàn)為肝損傷和纖維化的加速[27-28]．還有研究表明，藥物抑制劑BAY 11-7082抑制NLRP3激活降低了Caspase-1以及IL-1β生產(chǎn)，從而減少和改善食源性肝病[29]；番茄紅素通過(guò)促進(jìn)Nrf2/HO-1通路的激活，進(jìn)一步抑制NLRP3炎癥體，減輕肝臟損傷[30]．

研究表明，機(jī)體中的水大約占了80%以上，而輻射損傷主要來(lái)自于水的輻射分解，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，因而ROS是放射后正常組織損傷的主要來(lái)源[31]．線粒體障礙、mtDNA和mtROS的釋放是NLRP3炎性小體激活的重要觸發(fā)因素，NLRP3激活因子誘導(dǎo)NLRP3進(jìn)行自身寡聚化，招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)，后者組裝成絲狀結(jié)構(gòu)招募并使pro-Caspase-1自身剪切活化，活化的Caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，使之成熟并引起下一步炎癥反應(yīng)．本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，輻射后，肝臟內(nèi)NLRP3，IL-1β，Caspase-1蛋白表達(dá)量明顯呈上升趨勢(shì)，結(jié)合已有文獻(xiàn)可以推測(cè)，當(dāng)機(jī)體暴露在輻射下時(shí)，受損的線粒體會(huì)釋放ROS，激活NLRP3炎性小體通路，進(jìn)而激活Caspase-1，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β，并在體內(nèi)聚集從而引起肝功能損傷.因而，可以NLRP3為作用靶點(diǎn)，通過(guò)抑制NLRP3炎性小體的激活，減輕輻射誘導(dǎo)的肝損傷．