譚 強，李 俊，薄翠梅，喬文杰

(南京工業(yè)大學(xué)電氣工程與控制科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211816)

為了建立低成本高效率的發(fā)酵體系，連續(xù)操作在大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵過程中占主導(dǎo)地位，這在很大程度上依賴于微生物反應(yīng)的實時控制以實現(xiàn)最佳的傳輸速率[1－3]。因此，在線監(jiān)控技術(shù)是通過接收基本參數(shù)的動態(tài)波動來指導(dǎo)操作的關(guān)鍵。當(dāng)前，已經(jīng)有一些參數(shù)可以在線檢測發(fā)酵反應(yīng)器中的狀態(tài)，例如溫度，pH 值，壓力和溶解氧濃度[4－6]。然而，對于發(fā)酵中反應(yīng)動力學(xué)相關(guān)聯(lián)的常見底物如葡萄糖等的檢測，卻很少有相關(guān)的檢測儀器研發(fā)[7－8]。

近幾十年來，電化學(xué)酶傳感器在生物傳感中的應(yīng)用已被廣泛研究并取得了重大進(jìn)展[9－10]。

本文基于自主制備的具有納米立方晶體的普魯士藍(lán)(PB)三電極酶傳感器芯片[11－13]，設(shè)計了一種新型的葡萄糖分析儀，可實現(xiàn)在2 g/L～160 g/L 的超寬范圍內(nèi)的葡萄糖檢測，充分滿足實際發(fā)酵的檢測需求。

1 分析儀整體結(jié)構(gòu)設(shè)計

為了滿足儀器功能需求，基于微型電極芯片及其產(chǎn)生電化學(xué)信號的特征，對分析儀進(jìn)行上下位機設(shè)計。分析儀的總體設(shè)計如圖1 所示。選用了昆侖通態(tài)的MCGS 嵌入式觸摸屏作為上位機用于實現(xiàn)人機交互功能，具有用戶登錄、參數(shù)配置、曲線顯示、數(shù)據(jù)存儲等功能。下位機主要由電機驅(qū)動模塊和信號采集模塊組成。電機驅(qū)動模塊采用THB6128 作為驅(qū)動芯片控制步進(jìn)電機，用于實現(xiàn)檢測池的進(jìn)出液清洗功能和檢測池磁力攪拌功能。以LMP91000 為核心構(gòu)建信號采集模塊，完成了對酶傳感器芯片產(chǎn)生的微弱信號的I/V 轉(zhuǎn)換、放大和濾波的功能。

圖1 分析儀總體設(shè)計

2 硬件設(shè)計

分析儀采用STM32F407ZET6 作為主控制器，該控制器廣泛應(yīng)用于濃度檢測的儀器研發(fā)，擁有較高的運行速度，同時滿足低功耗和數(shù)據(jù)實時處理以及豐富的接口等功能。硬件系統(tǒng)包括電源模塊、電機驅(qū)動模塊、信號采集模塊、RS485 通信模塊和MCGS 上位機模塊組成。分析儀硬件功能框圖如圖2 所示。

圖2 分析儀硬件功能框圖

2.1 電源電路

電源系統(tǒng)的穩(wěn)定對整個系統(tǒng)的性能有重要作用，電源電路設(shè)計的好壞將決定整個分析儀能否長期穩(wěn)定運行。本系統(tǒng)電源先采用邁斯弗特MT220PD 的EMI 濾波器濾除外來干擾信號。通過DC－DC 降壓芯片MP2359 將24 V 降為5 V 電壓，處理壓差較大的降壓電路。MP2359 的開關(guān)頻率可以達(dá)到1.4 MHz，頻率較高，對電源電路的電感設(shè)計要求相對較低，性價比高。最后采用LDO 芯片AMS1117＿3.3 將電壓降為3.3 V。電源電路如圖3 所示。

圖3 電源電路

2.2 信號采集電路

本設(shè)計使用電化學(xué)模擬前端芯片LMP91000 采集電化學(xué)酶傳感器產(chǎn)生的微弱電流信號。電化學(xué)酶傳感器的三電極分別為工作電極(Working Electrode，WE)、參比電極(Reference Electrode，RE)、對電極(Counter Electrode，CE)，三電極的體系中，參比電極提供一個基準(zhǔn)電壓。工作電極在外加激勵信號下促使待測溶液產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)并測量該電極上形成的電流。對電極則與工作電極組成回路。待測溶液受到電壓信號的激勵將產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，并形成微弱的電流，該電流信號與被測物質(zhì)濃度有關(guān)，從而可算出被測物的濃度。

LMP91000 的簡化電路原理圖如圖4 所示，LMP91000 內(nèi)部的控制放大器A1，構(gòu)成了恒電位電路，誤差信號通過放大后反饋到傳感器的對電極。工作電極和參比電極之間的阻抗變化，都會引起對電極電壓的變化，從而使參比電極和工作電極之間的電壓保持恒定。接在工作電極上的跨阻放大器TIA 的輸出電壓正比于傳感器的工作電流，同時工作電極通過跨阻放大器接于虛地。VOUT輸出電壓信號經(jīng)過低通濾波后供控制器AD 采集。

圖4 LMP91000 簡化應(yīng)用原理圖

LMP91000 的工作電壓范圍為2.7 V 至5.25 V，參比電極偏置電流900 pA。控制器可通過I2C 接口編程配置參考電壓百分比和內(nèi)部增益電阻，I2C 接口是兩線制，分別為時鐘線SCL 和數(shù)據(jù)線SDA，MENB 為模塊使能，低電平有效。信號采集電路如圖5 所示。

圖5 信號采集電路

2.3 電機驅(qū)動電路

電化學(xué)傳感芯片的三個電極浸入有磷酸鹽緩沖液(PBS)的檢測池中，形成了一個穩(wěn)定的三電極恒電位體系。當(dāng)將檢測的葡萄糖溶液注入檢測池中，需要快速將PBS 和葡萄糖溶液進(jìn)行充分混合以使生物傳感芯片檢測到正確的葡萄糖濃度。分析儀采用磁力攪拌電機帶動檢測池內(nèi)攪拌子轉(zhuǎn)動的方式使溶液充分混合。同時檢測結(jié)束以后通過進(jìn)出液電機進(jìn)行檢測池清洗。

本設(shè)計采用步進(jìn)電機完成儀器需求，選定了THB6128 作為步進(jìn)電機驅(qū)動芯片，該芯片采用雙全橋MOSFET 驅(qū)動，具有多種細(xì)分方式、最多可達(dá)128細(xì)分。同時可以選擇快衰、慢衰和混合式衰減三種衰減方式。

電機驅(qū)動電路如圖6 所示。經(jīng)過實驗調(diào)試，選擇電機運行平穩(wěn)，噪音低、震動小的混合式衰減模式，同時選擇細(xì)分方式為8 細(xì)分。

圖6 電機驅(qū)動電路

3 軟件設(shè)計

分析儀系統(tǒng)軟件工作過程大致為:分析儀上電進(jìn)行系統(tǒng)初始化后，程序一直循環(huán)判斷是否接收到正確指令，若沒有，則繼續(xù)判斷；若是，則進(jìn)行指令解析，若解析不成功，則這串?dāng)?shù)據(jù)丟棄，重新判斷是否接收到正確指令；若解析成功，則根據(jù)功能碼選擇執(zhí)行相應(yīng)的模塊，執(zhí)行完后反饋狀態(tài)給上位機，然后等待接收下一串指令。軟件主程序流程圖如圖7 所示。

圖7 軟件主程序流程圖

3.1 上位機設(shè)計

上位機選用了昆侖通態(tài)的MCGS 嵌入式觸摸屏，擁有串口和TCP/IP 通信方式，本設(shè)計采用RS485 通信完成上下位機通信。主要開展檢測與控制方案設(shè)計，并設(shè)計了易用、人性化的人機交互界面，實現(xiàn)對葡萄糖穩(wěn)定的檢測。

3.2 檢測系統(tǒng)設(shè)計

分析儀信號采集芯片LMP91000 輸出電壓信號，供主控制器AD 采集。AD 進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換的數(shù)字量ADV 與VOUT的關(guān)系式為:

式中:VAD是AD 的基準(zhǔn)電壓，本系統(tǒng)為3.3 V，N為AD 的精度，本系統(tǒng)采用12 位AD，因此N＝12。

電化學(xué)傳感器芯片的靈敏度將隨著時間降低，并且響應(yīng)電流將降低。這要求系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)并建立濃度響應(yīng)方程以消除誤差。葡萄糖濃度與電化學(xué)酶生物傳感器的線性檢測范圍內(nèi)的響應(yīng)電流(或電壓)成比例。因此，可以使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液來校準(zhǔn)該電化學(xué)酶生物傳感器，這可以通過以下濃度響應(yīng)方程式來解釋:

式中:ADV0為葡萄糖濃度為0 時浸入PBS 中的AD值，ADV1為已知濃度的葡萄糖溶液注射到PBS 中的AD 值，C1為該標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度值，y為測量的未知濃度葡萄糖溶液注射到PBS 中的AD 值，x為測量的葡萄糖溶液濃度。

3.3 軟件濾波

為了濾除隨機信號的干擾，在均值濾波的基礎(chǔ)上加入了一階慣性濾波。作為一種動態(tài)數(shù)字濾波算法，該算法將本次采樣值與上次濾波輸出值進(jìn)行加權(quán)，得到本次有效值。此方法輸出對輸入有反饋作用:

式中:α表示濾波系數(shù)；X(n)表示本次采樣值；Y(n－1)表示上次濾波輸出值；Y(n－1)表示本次濾波輸出值。

考慮到濾波算法可能會導(dǎo)致小數(shù)舍棄，從而導(dǎo)致誤差，所以這里將α擴大K倍，不作浮點處理。除法也是會占用很多CPU 資源，可以把K定為2 的冪次方，除法就可以輕松轉(zhuǎn)成移位運算。改進(jìn)后的算法為:

設(shè)置ADC 采樣周期為10 ms，將一次檢測過程中的采集的AD 值轉(zhuǎn)換為對應(yīng)電壓值。使用一階慣性濾波進(jìn)行仿真，設(shè)置K為256，分別測試α為64、16 和8 時的濾波效果。如圖8 所示，為了兼顧濾波和數(shù)據(jù)的實時性，分析儀最終選用α為16，K為256作為濾波參數(shù)。

圖8 一階慣性濾波

4 實驗及分析

4.1 寬范圍檢測精度測試與分析

使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液在0.5 g/L 至200 g/L 范圍內(nèi)測試分析儀的檢測精度，如圖9 所示。實驗表明，分析儀在2 g/L 至160 g/L 檢測誤差低于2%，而目前發(fā)酵過程中的檢測需求基本在10 g/L 至100 g/L 之間，分析儀充分滿足了發(fā)酵檢測的儀器需求。

圖9 寬范圍葡萄糖精度測試

本文的分析儀與國內(nèi)外主流分析儀器對比如表1 所示?？梢钥闯霰痉治鰞x具有更寬的檢測范圍，更加適用于實際微生物發(fā)酵體系中的葡萄糖檢測。同時本分析儀由于檢測范圍可以滿足發(fā)酵中葡萄糖檢測要求，不需要進(jìn)行稀釋等樣品預(yù)處理，大大減少了檢測所需時間。

4.2 分析儀性能測試

為探究葡萄糖分析儀在低濃度下的性能，設(shè)計實驗計算其檢出限，由以下公式給出:

式中:DL為分析儀檢出限，k為一定置信水平確定的系數(shù)，一般取3，Sb為某一濃度被測樣品多次測量讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，C為被測樣品的濃度，X為被測樣品多次讀數(shù)的均值。

取1 g/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，每次定標(biāo)測試3 次，每隔5 min 重新定標(biāo)，持續(xù)測試12 次，得到36 組讀數(shù)，計算讀數(shù)得到檢出限結(jié)果為，DL＝0.21 g/L。

使用同一片酶傳感器芯片，使用分析儀每隔5 d對同一濃度的葡萄糖樣品多次檢測，結(jié)果如圖10 所示，60 d 后檢測精度仍保持在96.5%，表明該葡萄糖分析儀檢測性能長期穩(wěn)定。

圖10 葡萄糖分析儀長期檢測

使用10 片獨立的酶傳感器芯片，在室溫下對20 g/L 的葡萄糖樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖11 所示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.094 9%，表明該葡萄糖分析儀擁有優(yōu)越的重現(xiàn)性。

圖11 葡萄糖分析儀的重現(xiàn)性測試

使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液測試分析儀性能，結(jié)果如圖12 所示。測試結(jié)果表明，在2 g/L～150 g/L 的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為:y＝1.008 4x－0.258 0，(y表示葡萄糖檢測濃度，x表示葡萄糖理論濃度)。

圖12 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液測試

4.3 實際發(fā)酵體系測試

分別采用高效液相色譜儀(HPLC)和半分析儀檢測并跟蹤槐糖脂發(fā)酵液中的葡萄糖濃度變化。如圖13 所示，分析儀與色譜法(GB/T 30986－2014)的誤差在2%以內(nèi)，充分證明分析儀可以滿足實際發(fā)酵過程需求。

圖13 槐糖脂發(fā)酵液中葡萄糖濃度測試

5 結(jié)論

本文基于電化學(xué)酶傳感器芯片設(shè)計并提出了一種葡萄糖分析儀。本文給出了分析儀的軟硬件設(shè)計方案，通過精密的硬件電路和軟件算法實現(xiàn)了高精度、寬范圍的葡萄糖濃度檢測。最后通過實驗驗證了分析儀在2 g/L 至160 g/L 的寬范圍內(nèi)具有超高的檢測精度，可用于實際發(fā)酵過程中的葡萄糖檢測。