劉粲迪 陳 波 尹芳平 曾 輝

(1. 化學生物學及中藥分析教育部重點實驗室，湖南 長沙 410081；2. 植化單體開發(fā)與利用湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410081；3. 湖南師范大學，湖南 長沙 410081；4. 長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410016；5. 國家酒類產品質量檢驗檢測中心〔湖南〕，湖南 長沙 410016)

糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛和2-乙酰呋喃均為糠醛類化合物，屬于具有特殊風味的物質，廣泛存在于各類食品當中[1]。糠醛類物質的生成途徑主要有兩條：① 葡萄糖、果糖在酸性條件下脫水生成5-羥甲基糠醛，其經過水解生成各糠醛類物質，即糖的熱降解反應；② 氨基化合物與羰基化合物之間發(fā)生的非酶促反應(美拉德反應)，即還原糖的羰基和氨基酸中的自由基縮合生成席夫堿，后經重排生成Amadori產物，再生成5-羥甲基糠醛，后轉化為糠醛類物質[2-3]。5-羥甲基糠醛有一定神經毒性，經呼吸道或皮膚途徑可被人體吸收，對呼吸道、皮膚、黏膜等具有刺激性，對人體內臟會產生損害，過量攝入甚至可能致癌變[4]。

茶葉，由茶樹的葉或芽加工而成，富含糖類、黃酮類、氨基酸等多種化學成分[5-6]，部分化學成分使得茶葉具有延緩衰老、抗氧化、降血脂等保健作用[7-9]。茶葉品種繁多，分類方法也很多，如按照發(fā)酵程度不同可以分為非發(fā)酵茶、部分發(fā)酵茶、完全發(fā)酵茶和后發(fā)酵茶，分類區(qū)別在于其有著不同的加工方法，而熱處理是茶葉加工中必不可少的環(huán)節(jié)之一，因此伴隨著不同程度的美拉德反應發(fā)生，能給茶葉帶來獨特的香氣和滋味，生成糠醛類物質；茶葉中含有的糖類成分較多[10]，在生產與貯藏環(huán)節(jié)中發(fā)生糖的熱降解反應也可能產生糠醛類物質。目前僅有GH/T 18796—2012《蜂蜜》規(guī)定蜂蜜中5-羥甲基糠醛的限量為40 mg/kg，其他產品包括茶葉對糠醛類物質均無限量要求[11]，對茶葉中糠醛類物質的已有研究也較少，鑒于糠醛類物質對人體的毒性作用及其在茶葉中的存在情況，研究建立一種能快速準確地測定茶葉中糠醛類物質的分析方法十分必要。

糠醛類物質的檢測方法主要有高效液相色譜法[12]、氣相色譜法[13]、氣相色譜—質譜法[3]和高效液相色譜—串聯質譜法[14]。由于糠醛類物質檢測波長較小，茶葉基質中有較多物質在低波長下有吸收，采用HPLC法時基線干擾較大；GC的靈敏度較低，特異性不高，難以滿足茶葉中的糠醛類物質檢測要求；部分糠醛物質極性較低，在HPLC-MS/MS法常用的ESI源下較難離子化，需采用靈敏度較高、特異性強的GC-MS/MS法進行檢測。由于茶葉基質較復雜，前處理方法選擇很關鍵。茶葉基質常用的前處理方法有固相萃取法[15]、液液萃取法[16]、基質分散萃取法[17]等，這些方法通常需要進行多次凈化處理，操作較為繁瑣、耗時且成本較為高昂。QuEChERs法是結合了固相萃取及基質固相分散的一種新型前處理方法，該法通常使用乙腈或酸化乙腈作為溶劑進行提取，加入除水試劑(無水硫酸鎂等)進行除水，再用一定量的N-丙基乙二胺、石墨化炭黑和十八烷基硅烷等將提取液進一步凈化，除去提取液中的共萃基質如糖類、色素、蛋白質等，減少基質效應的作用[18]。研究擬根據糠醛類物質的理化性質，以乙腈提取茶葉樣品，使用十八烷基硅烷及石墨化炭黑進行QuEChERs法凈化后，采用同位素內標-GC-MS/MS法對茶葉中的糠醛類物質進行分析檢測，建立一種測定茶葉中糠醛類物質的分析方法，以期為茶葉中糠醛類物質含量測定及質量監(jiān)控提供方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

糠醛、2-乙酰呋喃：純度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

糠醛-D4：純度≥99.8%，北京振翔科技有限公司；

5-甲基糠醛：純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

5-羥甲基糠醛：純度≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

石墨化炭黑(Carb)、十八烷基硅烷(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)：上海迪馬科技有限公司；

無水硫酸鎂：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

乙腈、甲醇：色譜級，德國默克公司；

茶葉樣品：共52種，生產日期大多數在2020年9月，按茶葉品種分類有綠茶、紅茶、黃茶、白茶、烏龍茶、黑茶6種，涵蓋了不發(fā)酵茶、部分發(fā)酵茶、完全發(fā)酵茶和后發(fā)酵茶，網購。

1.1.2 儀器與設備

氣相色譜—串聯質譜聯用儀：GCMS-TQ8050NX型，日本島津公司；

圓周振蕩器：IKA MS3型，德國艾卡公司；

超純水儀：Milli-Q型，德國默克密理博公司；

超聲波清洗器：AS3120型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

十萬分之一天平：X205DU型，梅特勒—托利多國際貿易有限公司；

振蕩器：EDAA-HM-01型，上海安譜實驗科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 用分析天平分別準確稱取5-羥甲基糠醛、糠醛、5-甲基糠醛、2-乙酰呋喃各20.00 mg于20 mL容量瓶中，用甲醇定容，分別得到1 000 μg/mL的標準品儲備溶液，于-20 ℃冰箱保存。用移液管分別移取400 μL上述標準溶液至20 mL容量瓶，以乙腈定容，配制得到質量濃度為20 μg/mL的中間混合標準儲備溶液。用分析天平準確稱取糠醛-D415.00 mg于20 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到質量濃度為750 μg/mL的標準儲備溶液，于-20 ℃冰箱保存。用移液管移取200 μL上述溶液至20 mL容量瓶，用乙腈(色譜級)定容，得到質量濃度為7.5 μg/mL的中間標準儲備溶液。

將中間混合標準儲備溶液用乙腈進行稀釋，配制成1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00，200.00 μg/L的混合標準系列溶液，每個梯度濃度含有12 μg/L的糠醛-D4溶液作為內標。

將中間混合標準儲備溶液用處理后的茶葉樣品溶液進行稀釋(樣品處理方法見1.2.2)，配制成1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00，200.00 μg/L的基質配標系列溶液。

1.2.2 樣品前處理 將所有茶葉樣品用粉碎機粉碎后，過篩，稱取2 g樣品粉末于50 mL離心管內，加入40 μL 7.5 mg/mL糠醛-D4溶液，加入25 mL乙腈，于搖床上2 500 r/min 震蕩3 min，于超聲波清洗器中500 W功率超聲30 min，靜置1 min后取上清液1 mL至10 mL 塑料離心管中(管內裝有50 mg C18，20 mg Carb)，渦旋2 min后，10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機相濾膜后，待測。

1.2.3 GC-MS/MS分析

(1) 氣相條件：色譜柱為Shimadzu SH-RTX-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱；載氣He(99.999%)，碰撞氣Ar；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；線速度控制，柱流量1.00 mL/min。程序升溫程序：初始柱溫箱溫度50 ℃，保持2 min，以15 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。

(2) 質譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，檢測器電壓1.4 kV，溶劑延遲時間3.5 min；多反應檢測模式(MRM)。取2 μg/mL 混合標準溶液1.0 μL注入氣相色譜—串聯質譜儀進行分析，得到目標物質譜圖。進行MRM參數自動優(yōu)化，得到目標分析物選擇的母離子、子離子、碰撞能量及對應的保留時間。

位于郝關與同口之間，口門長500m。閘基高程2～8.5m主要為第②層壤土、第②2層砂壤土。壤土具有中等壓縮性，微弱透水性，強度較高，構成地基主要持力層；高程2m以下為第③壤土，含大量腐殖質和貝殼、螺殼碎屑，局部呈淤泥質，工程性質相對較差。

2 結果與討論

2.1 試驗條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理條件的優(yōu)化 茶葉的基質非常復雜，含有色素、礦物質、糖類物質等。QuEChERs法是最常用的凈化手段之一[19]，選用合適的吸附鹽配比能有效降低茶葉中的雜質干擾。該法常用的吸附鹽有十八烷基硅烷(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(Carb)和無水硫酸鎂。C18屬于非極性吸附劑，可以吸附極性化合物中的非極性化合物，如一些長鏈的脂肪類化合物；PSA有一定的極性相互作用和陰離子交換作用，可以去除非極性化合物中的極性化合物，如一些脂肪酸、有機酸類；Carb主要用來除去待測樣品中的色素；無水硫酸鎂主要用來除去樣品基質中的水分。以不同配比的C18+PSA組合萃取鹽對100 μg/mL混合標準溶液進行處理后進樣分析，對比未經過處理的100 μg/mL混合標準溶液，以期考察各萃取鹽對目標物是否有吸附，其回收率見表1。

由表1可知，PSA對糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛有較高的吸附，導致回收率偏低，而C18對目標物均無吸附，各目標物的回收率接近100%，故選擇50 mg C18作為QuEChERs吸附鹽之一，設計C18及Carb的配比組合，按同樣方法進行試驗，結果見表2。

表1 C18與PSA配比對4種糠醛類物質回收率的影響Table 1 Recovery results of four furfurals under different ratios of C18 and PSA %

由表2可知，隨著Carb用量增加，目標物的回收率逐漸降低，尤其是對5-羥甲基糠醛的回收率影響較大，當采用50 mg C18+30 mg Carb時，其回收率僅為73.29%。

表2 C18與Carb配比對4種糠醛類物質回收率的影響Table 2 Recovery results of four furfurals under C18 and different amounts of Carb %

但是Carb萃取鹽有良好的除色素能力，綜合考慮回收率和除雜能力，選擇50 mg C18+20 mg Carb的組合萃取鹽。

此外，為考察無水硫酸鎂對目標物回收率的影響，在實際茶葉樣品中加入50 μg/mL混合標準溶液，后經過QuEChERs處理后進行分析。結果表明，無水硫酸鎂添加與否并不影響目標物的回收率。為簡化試驗步驟和節(jié)約成本，選擇50 mg C18+20 mg Carb作為QuEChERs用萃取鹽。

2.1.2 氣相色譜柱的選擇 分別選擇了SH-I-5SiL、SH-Rtx-wax、InertCap 1701MS 3種不同極性的色譜柱進行對比。結果表明，SH-I-5SiL、InertCap 1701MS色譜柱在相同的氣相條件下，5種目標物的保留時間較短，可以在一定程度上減少分析時間，但由于5-羥甲基糠醛的極性較大，在這兩款色譜柱上拖尾較嚴重，無法準確定量。而采用SH-Rtx-wax柱進行分析時，5-羥甲基糠醛色譜峰形尖銳，拖尾因子更接近于1(見表3)，其余4種目標物色譜峰形均較好。因此，選擇SH-Rtx-wax柱來分離分析糠醛類物質，5種物質在SH-Rtx-wax柱上的MRM色譜圖見圖1。

圖1 5種物質在Wax柱上的TIC圖Figure 1 TIC diagram on wax column of 5 substances

表3 3種氣相色譜柱的柱性能表(5-羥甲基糠醛)Table 3 Column performance three gas chromatographic columns (5-hydroxymethylfurfural)

2.1.3 GC-MS/MS條件的優(yōu)化 通過進單一標準品確定糠醛、糠醛-D4、5-甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-羥甲基糠醛的質譜圖及出峰順序。根據質譜圖的相對豐度大小，選取目標化合物的母離子，取2 μg/mL混合標準溶液1.0 μL 注入氣相色譜—串聯質譜儀進行分析掃描，并以5 V 為間隔，在5～45 V的范圍內優(yōu)化碰撞能量，得到最佳的離子對作為定量離子對，優(yōu)化后的MRM參數見表4。5種物質的質譜圖見圖2～圖6。

圖2 糠醛的質譜圖Figure 2 Mass spectrum of furfural

圖3 糠醛-D4的質譜圖Figure 3 Mass spectrum of furfural-D4

圖4 2-乙酰呋喃的質譜圖Figure 4 Mass spectrum of 2-acetylfuran

圖5 5-甲基糠醛的質譜圖Figure 5 Mass spectrum of 5-methylfurfural

圖6 5-羥甲基糠醛的質譜圖Figure 6 Mass spectrum of 5-hydroxymethyl furfural

表4 5種目標物的MRM參數Table 4 MRM parameters of 5 targets

2.2 基質效應的考察

基質效應普遍存在于化學分析中，忽略基質效應的影響可能會導致樣品測定得到的含量水平與真實值存在很大的偏差。常規(guī)的基質效應消除方法有兩種：① 通過配制基質匹配線性標準溶液來對目標物進行定量；② 通過加入已知量的標準品至樣品提取液中，利用待測目標物和標準品響應的比值進行定量[20]11-12?；|效應的計算公式如下：

(1)

M——基質效應的大?。?/p>

KM——基質配標標準曲線方程的斜率；

KS——溶劑配標標準曲線方程的斜率。

當M的絕對值為0%～25%時，說明待測目標物在樣品中有弱基質效應，當M的絕對值為25%～50%時，說明待測目標物具有中等基質效應，當M的絕對值大于50%時，說明待測目標物的基質效應比較顯著[20]9-10。通過建立基質匹配標準曲線方程、標準溶液線性標準方程，計算M來評估4種糠醛類物質在茶葉基質中的基質效應，結果表明，糠醛、2-乙酰呋喃、5-羥甲基糠醛在茶葉溶液中具有弱基質效應，5-甲基糠醛在茶葉溶液中有較強的基質效應。采用基質匹配標準溶液操作相對較復雜，為了得到可靠的結果，采用糠醛-D4作為內標物，使用內標法進行定量。

2.3 檢測限和定量限

將5 μg/L混合標準溶液逐級稀釋，取稀釋后的溶液注入氣相色譜—串聯質譜儀進行檢測，以信噪比(S/N)≥3為檢出限，信噪比(S/N)≥10為定量限，得出方法的檢出限為1 μg/kg (n=3)，定量限為4.125 μg/kg (n=3)。

2.4 標準曲線及線性范圍

配制1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00，200.00 μg/L系列質量濃度的糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛混合標準溶液(每個質量濃度點含有12 μg/L的糠醛-D4作為內標)進行測定，以質量濃度比(目標物/內標)為橫坐標，以峰面積比(目標物/內標)為縱坐標繪制標準工作曲線，4種目標物及內標物的總離子流圖見圖1。4種糠醛類物質的線性回歸方程及相關系數見表5。

表5 4種糠醛類物質的線性范圍、線性回歸方程及相關系數Table 5 Linear range,linear regression equation and correlation coefficient of four furfural compounds

2.5 回收率與精密度

稱取21份茶葉樣品，其中18份分別添加低、中、高3個濃度的標準溶液，另外3份樣品不添加標準溶液，按試驗方法處理后同時測定糠醛類物質的含量，結果見表6。由表6可知，測得回收率范圍在89.10%～113.02%，相對標準偏差在10%以內，方法的準確度與精密度符合檢測要求[21]。

表6 4種糠醛類物質低、中、高3水平加標回收率及RSDTable 6 Recoveries and RSD of four furfurals at low,medium and high levels (n=6)

以高水平加標樣品溶液為考察對象，在進行加標處理后的0，2，4，8，12，24 h分別進樣，考察方法的日內精密度，連續(xù)3 d進樣考察日間精密度，結果見表7。結果表明，方法的日內精密度和日間精密度均小于12%，符合檢測的要求。

表7 4種糠醛類物質的日內精密度和日間精密度Table 7 Diurnal and diurnal precision of four furfural comounds %

2.6 實際樣品的測定

采用試驗建立的QuEChERs-同位素內標—氣相色譜—串聯質譜法對收集到的52種茶葉樣品進行分析，結果表明，大部分茶葉樣品中均檢出糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛。大部分茶葉中糠醛類物質含量小于0.10 mg/kg，少部分茶葉的糠醛類物質含量分布在0.10～1.25 mg/kg，5-羥甲基糠醛含量在糠醛類物質中相對較高，部分含量超過了1.25 mg/kg，最高的檢出值達到了6.44 mg/kg，為一種烏龍茶。結果表明，糠醛類物質在茶葉中可檢出，可能存在一定的安全隱患。

表8 茶葉樣品中4種糠醛類物質的檢出量分布范圍Table 8 Detection amount and distribution range of four furfurals in tea samples

3 結論

通過對質譜參數、氣相色譜條件、前處理方法的優(yōu)化，建立了一種QuEChERs-同位素內標-GC-MS/MS法檢測茶葉中的糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛4種糠醛類物質的分析方法。方法在1.25～200.00 μg/L的質量濃度范圍內均呈良好的線性關系(R2≥0.999 0)；該方法加標樣品的回收率為89.10%～113.02%，準確度高。采用該方法對收集的茶葉樣品進行測定，大部分茶葉樣品中均檢出糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛4種糠醛類物質，其中5-羥甲基糠醛的含量相對較高，最高的檢出值達到了6.44 mg/kg，可能存在一定的安全風險，應引起人們的關注。