李海山，謝文平，周麗麗，沈國林，宋乃寧，陳會明

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院化學(xué)品安全研究所，北京 100176）

代謝綜合征是導(dǎo)致糖尿病、心腦血管疾病的危險因素，而糖尿病、心腦血管疾病是社會關(guān)注度高、威脅人類健康的重要疾病。國際糖尿病聯(lián)盟預(yù)測2045年世界上約有6.93億糖尿病患者［1］。組成型雄烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）在外源化學(xué)物代謝、能量代謝、內(nèi)分泌激素代謝等過程中發(fā)揮重要作用，是機體對外源性化學(xué)物暴露的感受器［2-3］。外源性化學(xué)物通過對CAR活化特性的激活/拮抗，干擾機體對環(huán)境暴露的其他外源化學(xué)物代謝過程、內(nèi)源物質(zhì)的代謝過程、能量代謝的穩(wěn)態(tài)，進而導(dǎo)致代謝紊亂和毒物-毒物相互作用。在已知的人類核受體超家族中，CAR 對化學(xué)物的應(yīng)答存在顯著的物種差異［4］，給動物實驗測試數(shù)據(jù)外推到人帶來挑戰(zhàn)和不確定性?；贑AR 在代謝干擾研究領(lǐng)域的重要性和物種差異特性，構(gòu)建表達人源化CAR 的動物模型具有重要意義。本研究通過基因編輯技術(shù)分別構(gòu)建CAR基因敲除小鼠模型和表達人源CAR全序列轉(zhuǎn)基因小鼠模型，雜交得到不表達小鼠自身CAR、僅表達人源CAR的小鼠模型，并對其表達水平、剪接變異體、物種特異性化學(xué)物應(yīng)答等特征開展鑒定和有效性評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 野生型C57BL 小鼠，8 周齡，雌性10只用于繁育，雄性20只用于繁育和實驗，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)許可證號SCXK［京］2021-0006）。動物常規(guī)喂養(yǎng)于獨立通風籠具，自由飲水；光照12 h，黑暗12 h，溫度21～26 ℃，日溫差不超過4 ℃，相對濕度40%～70%。CAR基因敲除小鼠模型由賽業(yè)（廣州）生物技術(shù)有限公司按設(shè)計方案實施，表達人源CAR全序列轉(zhuǎn)基因小鼠模型由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所按設(shè)計方案實施。獲得的陽性首建鼠在本課題組實驗室繁育、雜交和鑒定。

1.2 主要儀器及試劑 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司），超速低溫離心機（德國Sigma 公司），超低溫冰箱（日本Sanyo 公司），核酸分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

6-（4-氯苯基）咪唑并［2，1-b］［1，3］噻唑-5-甲醛-O- （3，4-二氯苯基） 肟（CITCO，CAS號：338404-52-7）、1，4-雙-［2-（3，5，二氯吡啶氧基）］苯（TCPOBOP，CAS號：76150-91-9）、橄欖油（美國Sigma 公司），Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR預(yù)混試劑盒（日本Takara公司），組織裂解液（北京維通達生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1CAR基因敲除小鼠模型的構(gòu)建 按照轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease，TALEN）方法構(gòu)建。剪取4周齡鼠尾尖于組織裂解液中。擴增CAR-KO上游引物：5′-TAACCCACAGAAGAAGGCTATGCCC-3′，CAR-KO 下游引物：5′-CATACCAGTCTTTAATCGGAGACCGG-3′，野生型小鼠擴增片段長度為370 bp，單向測序引物：5′-GGTCTGACTTACCGAGCGAGCAC-3′。

1.3.2 表達人源CAR全序列轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建 按照細菌人工染色體大片段序列轉(zhuǎn)基因方法構(gòu)建。細菌人工染色體克隆RP11-297K8 含人源CAR全長序列，長度173 000 bp。剪取4 周齡鼠尾尖于組織裂解液中。擴增閱讀框前區(qū)（Up）上游引物：5′-CCAGGAAGTCAGCAGAAGAGG-3′，Up下游引物：5′-GGAAGAGAAGAAGGGTGGGA C-3′，產(chǎn)物長度435 bp；閱讀框區(qū)（CAR）上游引物：5′-CAGCGCATTAAAGTGGTAGCC-3′，CAR下游引物：5′-GCCTAGGTGACAGAGCAAGAAC-3′，產(chǎn)物長度301 bp；閱讀框后區(qū)（Down）上游引 物：5′-CCACGCCCAGACTGACTTATTAC-3′，Down 下 游 引 物：5′-GGAGAATCGCTTGAACCAGG-3′，產(chǎn)物長度314 bp。

1.3.3 肝、腸組織CAR基因表達水平和肝組織人源CAR剪接變異體豐度 采用熒光定量PCR 法。取8周齡雄性野生型、CAR人源化小鼠各3只，二氧化碳麻醉處理后，摘取肝、腸組織，剪取來源于3個人體的人肝組織塊（該數(shù)據(jù)為第一作者在美國從事博士后研究期間在馬里蘭大學(xué)藥學(xué)院使用實驗室保存的人肝組織塊總RNA 測試），按照Trizol試劑盒的操作要求提取總RNA，采用分光光度計在260 nm 和280 nm 波長處測定其光密度值，驗證總RNA的濃度與純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將樣本中的mRNA轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）。應(yīng)用實時定量PCR 儀，測定各樣本等質(zhì)量總RNA的mRNA的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）值。小鼠CAR上 游 引 物： 5′- CCCTGACAGACCCGGAGTTA-3′，小鼠CAR下游引物：5′-GCCGAGACTGTTGTTCCATAAT-3′；人源CAR上游引物：5′-GAGCTGAGGAACTGTGTGGTA-3′，人源CAR下游 引 物：5′-CTTTTGCTGACTGTTCTCCTGAA-3′；人源CAR剪接變異體SV02（擴增0、2 型共用）上游引物：5′-AGATGGAGCCCGTGTGGG-3′；SV13（擴增1、3型共用）上游引物：5′-GAAGATGGAGCCCGTGTATCTC-3′；SV4（擴增4 型專用）上游引物：5′-AGATGGAGCCCGTGACCG-3′；SV01（擴增0、1 型共用）下游引物：5′-GGTAACTCCAGGTCGGTCAGG-3′；SV23 （擴 增2、3 型共用）下游引物：5′-AACTCCAGGTCGGTCTGTAAGAT-3′；SV4（擴增4型專用）下游引物：5′-TGCTGGCCCTTGATGTAGCT-3′。

1.3.4 物種特異性激活劑應(yīng)答反應(yīng) 通過比較給予激活劑后肝組織CAR典型靶基因細胞色素P450（cytochrome P450，CYP） 2B和3A相對表達水平。8周齡雄性野生型、CAR基因敲除小鼠、人源化CAR小鼠各9只，分為對照、TCPOBOP、CITCO組，每組3只。對照組腹腔注射橄欖油10 ml/kg體重，連續(xù)3 d，于末次注射24 h后二氧化碳麻醉處死小鼠，摘取肝組織；TCPOBOP用橄欖油配制為0.3 mg/ml 溶液，單次腹腔注射3 mg/kg 體重，注射72 h 后取小鼠肝組織；CITCO 用橄欖油配制為2 mg/ml溶液，腹腔注射20 mg/kg體重，連續(xù)3 d，于末次注射24 h 后取小鼠肝組織。CYP2B上游引物：5′-TCCTGACCAGTTCCTGGATG-3′，CYP2B下 游引 物：5′-CTGGAGGATGGACGTGAAGAA-3′，擴增產(chǎn)物長度162 bp；CYP3A上游引物：5′-GTCAAACGCCTCTCCTTGCTG-3′，CYP3A下 游引物：5′-GGCTTGCCTTTCTTTGCCTTC-3′，擴增產(chǎn)物長度277 bp；內(nèi)參照基因β-actin上游引物：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，β-actin下游引物：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′，擴增產(chǎn)物長度181 bp。以目的基因與內(nèi)參照基因計算目的基因相對表達水平，相對表達量=2-△△Ct。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CAR基因敲除小鼠鑒定結(jié)果 經(jīng)測序鑒定，其CAR外顯子區(qū)缺失10 bp 堿基序列（GATATCAACA），見圖1加框部分。

圖1 CAR基因敲除小鼠測序

2.2 人源CAR轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定結(jié)果 經(jīng)特異性引物擴增片段鑒定，人源CAR轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中擴增出人源CAR基因片段，細菌人工染色體中CAR序列、上游、下游片段，典型鑒定結(jié)果見圖2。

圖2 人源CAR轉(zhuǎn)基因小鼠特異片段擴增鑒定

2.3 野生型、CAR基因敲除、CAR人源化小鼠肝、腸組織CAR基因表達水平CAR基因敲除小鼠肝、腸組織不表達任何CAR；野生型小鼠肝組織鼠源CAR表達水平為（24.1±1.2），與CAR人源化小鼠人源CAR的表達水平（23.8±1.4）接近；野生型小鼠腸組織的鼠源CAR表達水平為（25.6±1.5），而CAR人源化小鼠人源CAR表達水平為（30.6±2.1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4CAR人源化小鼠肝組織CAR剪接變異體表達豐度 對人源5 種主要CAR 剪接變異體（SV0-SV4）的肝表達豐度與人肝組織豐度相比較，結(jié)果顯示二者此5 種主要CAR 剪接變異體肝組織表達豐度非常接近。見圖3。

圖3 CAR人源化小鼠肝組織與人肝組織主要CAR剪接變異體豐度

2.5 物種特異性激活劑應(yīng)答 野生型、CAR基因敲除、CAR人源化小鼠肝組織CAR 兩種典型靶基因（CYP2B、CYP3A）在給予物種特異性激活劑CITCO（人源CAR 激活）、TCPOBOP（鼠源CAR激活）與相應(yīng)溶劑對照組相對表達水平，野生型小鼠給予TCPOBOP后肝組織2種靶基因表達水平顯著誘導(dǎo)，此種誘導(dǎo)效應(yīng)在CAR基因敲除小鼠完全消失；CAR人源化小鼠僅對人特異性激活劑CITCO 產(chǎn)生應(yīng)答，肝組織細胞色素P450 2B、3A表達顯著升高，見表1。

表1 小鼠物種特異性激活劑應(yīng)答（n=3）

3 討論

本研究構(gòu)建了CAR基因敲除小鼠和人源CAR轉(zhuǎn)基因小鼠，雜交獲得了CAR人源化小鼠。構(gòu)建的CAR人源化小鼠主要優(yōu)點：轉(zhuǎn)入基因片段包含CAR基因全序列及上下游調(diào)控序列，表達水平與鼠CAR相當（生理水平表達）；肝組織表達人CAR主要剪接變異體，其表達豐度與人肝組織相當［5］；主要臟器CAR表達模式與人相當，不同于小鼠CAR臟器分布（人CAR優(yōu)勢表達于肝臟，小鼠CAR優(yōu)勢表達于肝臟和小腸）［6］。

在已知的人類48種核受體中，CAR配體結(jié)合域基因序列在人與常用實驗動物大鼠、小鼠之間差異最大［4］，因此對外源化學(xué)物的應(yīng)答表現(xiàn)出顯著的物種特異性，常被用作物種特異性的工具化學(xué)物CITCO特異性激活人源CAR，對大鼠、小鼠CAR均無明顯作用［7］；反之，TCPOBOP則特異性激活鼠源CAR，對人源CAR無明顯作用［8］。本研究建立的CAR 人源化小鼠表現(xiàn)出期望的表型。目前國際上高通量篩選平臺對數(shù)萬種化學(xué)物樣本庫進行了CAR 活性的體外篩選［9］，但由于化學(xué)物在體內(nèi)經(jīng)過吸收、分布、代謝、排泄復(fù)雜過程，尤其是經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化作用生成一系列的代謝物，亟待開發(fā)有效的體內(nèi)模型進行驗證?；瘜W(xué)物安全性評價動物實驗最常使用的嚙齒類動物是大鼠，機制研究使用小鼠也較普遍，由于化學(xué)物對CAR 活性調(diào)節(jié)的物種差異，很可能過高估計或過低估計化學(xué)物的毒理學(xué)效應(yīng)，尤其代謝干擾效應(yīng)介導(dǎo)的有害結(jié)局。應(yīng)用本研究構(gòu)建的CAR 人源化小鼠有助于對關(guān)注的化學(xué)物體外篩查結(jié)果進行體內(nèi)驗證，為風險評估過程中物種差異的不確定度評價提供科學(xué)依據(jù)。

機體代謝穩(wěn)態(tài)主要通過一類稱為外源物核受體或代謝核受體的轉(zhuǎn)錄因子超家族而發(fā)揮作用，CAR是其中重要的成員，與孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptors，PPARs）、芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）等共同構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，2007年美國國家研究委員會（NRC）將PXR/CAR/PPAR/AhR 途徑列為體外測試毒性途徑之一［10］。近年來毒理學(xué)界有害結(jié)局路徑（Adverse outcome pathway，AOP）概念及框架方興未艾，CAR 在促癌、膽汁淤積等AOP中發(fā)揮重要作用，受到廣泛重視［11］。由于這些調(diào)節(jié)子呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，尤其PXR與CAR作用和激活劑之間更是密切關(guān)聯(lián)，本課題組對PXR 也開展了基因編輯模式動物的工作，將產(chǎn)生PXR/CAR人源化小鼠，提供深入研究的有力工具。