劉黎明 戴玉豪 吳文潔 劉陳 李韶菁

摘要 目的：基于線粒體呼吸功能，研究芪參顆粒對缺血性中風相關線粒體能量代謝障礙保護作用。方法：選用PC12神經細胞復制缺氧缺糖損傷模型，采用細胞能量代謝分析儀（Seahorse XFe 96）考察芪參顆粒及藥效成分對糖氧剝奪細胞呼吸功能的保護作用。復制大鼠大腦中動脈栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）模型，采用Clark氧電極法檢測芪參顆粒對MCAO大鼠腦線粒體三態(tài)呼吸速率、四態(tài)呼吸速率、磷氧比、呼吸控制率、氧化磷酸化率等呼吸功能相關指標。蛋白質印跡法（Western Blotting）檢測腦線粒體功能相關解偶聯蛋白（UCP）-1、UCP-2的表達水平變化。結果：芪參顆粒及其主要藥效成分可提升細胞線粒體有氧呼吸水平，改善缺血性中風大鼠腦線粒體呼吸功能;與模型組比較，芪參顆粒觀察組的腦組織中UCP-1、UCP-2表達明顯下降（P<0.01）。結論：芪參顆粒能夠顯著提高缺氧后神經細胞線粒體能量代謝水平，降低缺血性腦卒中大鼠腦線粒體呼吸功能損傷，其調節(jié)作用可能與UCP密切相關。

關鍵詞 芪參顆粒;PC12細胞;糖氧剝奪;腦卒中;能量代謝;線粒體呼吸速率;解偶聯蛋白;腦心同治

Protective Effect of Qishen Granules on Mitochondria Against Ischemic Stroke

LIU Liming1，DAI Yuhao1，WU Wenjie2，LIU Chen1，LI Shaojing1

（1 Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100010，China; 2 Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230000，China）

Abstract Objective：To investigate the protective effect of Qishen Granules on mitochondrial energy metabolism disorders caused by ischemic stroke based on mitochondrial respiratory function.Methods：PC12 nerve cells were selected to replicate the oxygen-glucose deprivation（OGD） model.The cell energy metabolism analyzer（Seahorse XFe96） was used to investigate the protective effect of Qishen Granules and their medicinal ingredients on the respiratory function of OGD cells.The middle cerebral artery occlusion（MCAO） model was induced in rats.Clark oxygen electrode was used to detect state 3 respiration rate，state 4 respiration rate，P/O ratio，respiratory control rate，oxidative phosphorylation rate，and other indicators related to the respiration function of brain mitochondria extracted from MCAO rats treated by Qishen Granules.Western blot was used to detect changes in the expression of uncoupling protein（UCP）-1 and UCP-2 which was closely associated with brain mitochondrial function.Results：Qishen Granules and their main medicinal components could increase the levels of aerobic respiration of mitochondria and improve the respiratory function of brain mitochondria in rats with ischemic stroke.Compared with the model group，the protein expression of UCP-1 and UCP-2 in the Qishen Granules group decreased（P<0.01）.Conclusion：Qishen Granules can significantly increase the level of mitochondrial energy metabolism of nerve cells after hypoxia，reduce the damage of brain mitochondrial respiratory function in rats with ischemic stroke，and the regulatory effect may be closely related to UCP.

Keywords Qishen Granules; PC12 cells; Oxygen-glucose deprivation; Stroke; Energy metabolism; Mitochondrial respiration rate; Uncoupling protein; Brain and heart treatment

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.013

芪參顆粒是基于慢性心力衰竭臨床研究，以真武湯和四妙勇安湯為基礎化裁而得，主治氣虛血瘀所致的慢性心力衰竭證[1]?；凇疤?、毒、瘀”的病因病機，芪參顆粒以益氣溫陽、清熱解毒、活血化瘀作為治療理念，對心肌纖維化及心肌梗死后心力衰竭有著良好的治療效果[2]。而這一治則也契合中醫(yī)對中風“毒損腦絡”病機的治療策略，且芪參顆粒的抗氧化、抗炎、調節(jié)細胞凋亡等諸多藥理作用也與中風分子保護機制密切相關[3-9]。既往研究主要集中在芪參顆粒的心血管保護作用研究，而針對腦病治療，如其對缺血性中風保護作用尚無相關報道。

細胞能量代謝障礙是缺血性中風早期病理的標志性事件，而線粒體作為細胞生物能量生成和轉換的主要場所，在中風發(fā)病過程中起著關鍵性作用，因此對細胞線粒體結構和功能的保護在缺血性中風治療中意義重大[10-11]。現有研究發(fā)現解偶聯蛋白（Uncoupling Protein，UCP）可以調節(jié)線粒體呼吸[12]，可能通過介導線粒體功能從而影響腦缺血疾病的進程，但其與腦缺血疾病之間的關系尚不明確。本實驗從線粒體呼吸的角度，在細胞和動物水平考察芪參顆粒對缺血性中風線粒體能量代謝障礙的干預作用及其與UCP相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與動物 PC12細胞購自國家生物醫(yī)學實驗細胞資源庫（BMCR），貨號：SCSP-517。健康Sprague Dawley（SD）大鼠（SPF/VAF級），7周齡，體質量250～260 g，雄性，共44只。購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SYXK-（京）2019-0010。置于溫度（25±2）℃飼養(yǎng)室，動物均自由飲水進食，濕度40%～70%，明暗交替12 h/12 h。本文所涉及動物實驗經中國中醫(yī)科學院中藥研究所動物福利倫理委員會批準通過（倫理審批號：2021B193）。

1.1.2 藥物 芪參顆粒由黃芪、丹參、金銀花、玄參、附子、甘草組成，由北京中醫(yī)藥大學中藥學院制備并提供。北京中醫(yī)藥大學肖紅斌課題組通過建立“血漿、心臟靶器官-芪參顆?！狈聪蛲诰蚣夹g，鑒定出芪參顆粒中參與調節(jié)心臟、血管功能的主要藥效成分為：甘草酸、綠原酸、丹酚酸B、丹參酮ⅡA和黃芪甲苷等。甘草酸（北京索萊寶科技有限公司，批號：1021E021）;綠原酸（北京索萊寶科技有限公司，批號：1022L021）;丹參酮ⅡA（北京索萊寶科技有限公司，批號：1022F021）;丹酚酸B（北京索萊寶科技有限公司，批號：1021J021）;黃芪甲苷Ⅳ（上海源葉生物科技有限公司，批號：17J11Q15731）;銀杏葉提取物（EGb761）（德國威瑪舒培博士藥廠，批號：4250213）。全部實驗用藥物均用純水配制。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清（Hyclone 公司，美國，貨號：SH3040602）;DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國，貨號：C11995）;0.25%胰蛋白酶（Invitrogen公司，美國，貨號：25200056）;青-鏈霉素雙抗溶液（Invitrogen公司，美國，貨號：15140122）;L-谷氨酸鈉（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G8010-100）;L-蘋果酸（北京索萊寶科技有限公司，貨號：L8090-25）;廣譜蛋白Marker（北京索萊寶科技有限公司，貨號：PR1920-50）;MTT（北京博奧拓達科技有限公司，貨號：Top0190）;磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）（碧云天生物技術公司，貨號：C0221A）;Tris-HCl（碧云天生物技術公司，貨號：ST774）;乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid，EDTA）（碧云天生物技術公司，批號：ST1303）;BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術公司，批號：P0012），RIPA裂解液（碧云天生物技術公司，批號：P0013C）;SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）凝膠快速配制試劑盒（碧云天生物技術公司，貨號：P0012AC）;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）（碧云天生物技術公司，貨號：P0015L）;ADP-Na（Sigma公司，美國，貨號：1897）;牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）（北京索萊寶科技有限公司，貨號：A8010）;無水乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）（Sigma公司，美國，貨號：E5134）;葡萄糖（Sigma公司，美國，貨號：Y0001745）;丙酮酸鈉（Sigma公司，美國，貨號：P2256）;二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美國，貨號：D2650）;水合氯醛（中國國藥集團，貨號：HCYH210415）;蔗糖（中國國藥集團，貨號：10021418）;磷酸二氫鉀（中國國藥集團，貨號：10017608）;氯化鉀（中國國藥集團，貨號：10016308）;氯化鈉（中國國藥集團，貨號：10019308）;無水氯化鈣（中國國藥集團，貨號：C1016）;無水硫酸鎂（中國國藥集團，貨號：33337）;磷酸氫二鈉（中國國藥集團，貨號：20040617）;碳酸氫鈉（中國國藥集團，貨號：10018960）;HEPES（Amresco公司，美國，貨號：H8090-25）;谷氨酰胺（Amresco公司，美國，貨號：G8230-25）;Seahorse XF細胞線粒體壓力測定試劑盒（Agilent公司，美國，貨號：103015-100）;Seahorse XF Base Medium培養(yǎng)基（Agilent公司，美國，貨號：102353-100）;校準液（Agilent公司，美國，批號：28318001）;兔抗-UCP1（博士德生物工程有限公司，貨號：M00255）;兔抗-UCP2（博士德生物工程有限公司，貨號：A02256-1）;山羊抗兔IgG/辣根酶標記抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZB-2301）;聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美國，貨號：C3117）。酶標儀（Tecan公司，瑞士，型號：SUNRISE）;Seahorse能量代謝分析儀（Agilent公司，美國，型號：Seahorse XFe96）;782 Oxygen System（Strathkelvin公司，英國，型號：2479）;臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀儀器有限公司，型號：H-1850R）;萬級天平（上海精密科學儀器有限公司，型號：FA2204B）;實驗室pH計[奧豪斯儀器（上海）有限公司，型號：STARTER2100];數顯恒溫攪拌恒溫水箱（常州國華電器有限公司，型號：HH-60）。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 缺氧缺糖液：稱取氯化鈉0.68 g、氯化鉀0.04 g、無水氯化鈣0.02 g、無水硫酸鎂0.01 g、磷酸氫二鈉0.03 g，碳酸氫鈉0.22 g，HEPES 0.48 g，加入100 mL雙蒸水充分溶解，經0.22 μm濾膜過濾，4 ℃儲存[13];以上樣品檢測液：取100 mL XF Base Medium，加入0.18 g葡萄糖，0.055 g丙酮酸鈉，0.029 2 g谷氨酰胺充分溶解，37 ℃水浴鍋預熱，用0.1 mol/L NaOH溶液調pH=7.4，經0.22 μm濾膜過濾，4 ℃儲存;線粒體分離試劑：稱取蔗糖42.787 g、Na2EDTA 0.84 g、BSA 0.5 g，量取Tris-HCl（1 mol/L）5 mL充分溶解于500 mL雙蒸水，調pH=7.4，4 ℃儲存;線粒體呼吸緩沖液：稱取蔗糖7.702 g、KH2PO4 0.068 g、KCl 0.074 6 g、EDTA 0.005 8 g、BSA 0.01 g，量取Tris-HCl（1 mol/L）1 mL充分溶解于100 mL雙蒸水，調pH=7.4，分裝后-20 ℃儲存;ComplexⅠ底物：配制L-谷氨酸鈉10 mol/L，L-蘋果酸5 mol/L，分裝后-20 ℃儲存，工作液稀釋5倍即L-谷氨酸鈉2 mol/L，L-蘋果酸1 mol/L;ADP-Na2：配制ADP-Na2 0.25 mol/L，分裝后-20 ℃儲存，工作液稀釋5倍即ADP-Na2 0.05 mol/L。

1.2.2 細胞線粒體壓力測試 研究芪參顆粒及其藥效成分甘草酸、綠原酸、丹酚酸、丹參酮ⅡA、黃芪甲苷Ⅳ對糖氧剝奪PC12的線粒體保護作用，實驗分組如下：對照組，甘草酸組（100 μmol/L）、綠原酸組（100 μmol/L）、丹酚酸B組（100 μmol/L）、丹參酮ⅡA組（100 μmol/L）、黃芪甲苷Ⅳ組（100 μmol/L），芪參顆粒中劑量組（50 μg/mL）、芪參顆粒高劑量組（100 μg/mL），設置6復孔，各組藥均用DMSO配制母液后，用缺糖缺氧液稀釋至工作濃度。取生長良好的PC12細胞，消化計數，調整濃度為1.125×105個/mL，接種在XF 96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔9 000個細胞（體積為80 μL）。室溫靜置60 min后，將細胞移入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h。向探針板各孔中加入200 μL水化液，將探針浸潤在水化液中，置于37 ℃、無CO2搖床中水化過夜。次日，取出細胞培養(yǎng)板，更換缺糖缺氧液并按照分組給藥，放置在缺氧小室中，通入95% N2、5% CO2的混合氣體，待30 min后氣體飽和，放置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。缺氧6 h后，吸除缺氧液更換上樣檢測液，置細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。取出探針板，按照試劑盒說明書配制線粒體呼吸鏈試劑Oligomycin、FCCP、AntimycinA/Rotenone，并依次注入探針板的A、B、C加藥倉中，更換校準液入機校準20 min。校準完成后將底板換成細胞培養(yǎng)板上機檢測，由探針實時測量的微孔內的氧氣消耗速率（Oxygen Consumption Rate，OCR），可根據公式計算線粒體有氧呼吸相關參數。在測定曲線中，非線粒體呼吸=加入AntimycinA/Rotenone后的OCR值;ATP合成值=加入Oligomycin前后OCR的差值;基礎呼吸值=加入Oligomycin前的OCR值-非線粒體呼吸;最大呼吸值=加入FCCP后的OCR值-非線粒體呼吸;備用呼吸值=最大呼吸值-基礎呼吸值;質子漏=基礎呼吸值-ATP合成值。根據公式計算各組細胞在缺氧條件下的有氧呼吸參數：質子漏、基礎呼吸、最大呼吸、ATP合成、備用呼吸。

1.2.3 大鼠分組與模型制備 將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、陽性藥組（銀杏葉提取物，4 mg/kg）、芪參顆粒高、中、低（7.46、3.73、1.87 g/kg）劑量組，每組6只。各組術前15 min灌胃給藥，假手術組和模型組給予等量生理鹽水。腹腔注射10%水合氯醛（400 mg/kg）對大鼠進行麻醉后。參照Longa EZ建立的大鼠MCAO方法，對模型組及給藥組大鼠進行MCAO模型復制，假手術組不插線栓，僅行術前麻醉以及血管分離、暴露。將大鼠仰臥固定，75%乙醇消毒頸部皮膚，于正中切口，鈍性分離肌肉和筋膜并暴露右側頸總動脈，在頸總動脈的近心端結扎，沿頸總動脈繼續(xù)向遠心端分至分叉處，剝離頸外和頸內動脈，夾閉頸總動脈的遠心端，在頸總動脈距分叉處1.5 cm剪一小口，將制備好的線栓從剪口處插入，并沿頸總動脈插入頸內動脈。當進入頸內動脈的線栓長2 cm時，結扎頸總動脈以固定線栓，縫合皮膚。整個手術過程室溫保持在（22±2）℃。

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 神經功能學評分 術后12 h，參照Bederson等[14]的5級評分法（0～4分），對各組大鼠進行神經功能學評分，分數越高，說明大鼠神經行為損傷越嚴重。1）行為完全正常者，記0分;2）提起鼠尾離開地面，手術對側前肢內旋、內收者，記1分;3）大鼠置于地面，用手擠壓前肢兩側，手術對側抗力下降者，記2分;4）大鼠置于地面，觀察其行走，圍繞手術對側轉圈者，記3分;5）大鼠損傷極其嚴重，無法自主活動者，記4分。

1.2.4.2 離體線粒體制備及蛋白標定 神經行為學評分后，速取大腦，在冰臺上去除小腦和嗅球，切開左右腦，取缺血側腦剪成3 mm小塊，加入冰冷的線粒體分離試劑，冰浴緩慢勻漿10次，進行梯度離心：1）600×g，4 ℃離心3 min，取上清液;2）1 000×g，4 ℃離心5 min，取上清液;3）10 000×g，4 ℃離心8 min，棄上清液保留沉淀;4）重懸沉淀，10 000×g，4 ℃離心8 min，棄上清液，用分離試劑重懸沉淀，得粗制線粒體。采用BCA蛋白定量試劑盒對粗制線粒體進行蛋白定量。按BCA試劑：Cu試劑=50∶1的比例配制BCA工作液，充分混勻。取粗制線粒體懸液40 μL于96孔板中，用PBS倍比稀釋6個梯度，取最后4個梯度加入工作液，做3個平行。取10 μL BSA標準品（5 mg/mL）用PBS稀釋至62.5 μL，使終濃度為0.8 mg/mL。將BSA標準品以0、2、4、6、8、12、16、20 μL加到96孔板的標準蛋白孔中，加PBS補足至20 μL，做3個平行。向每孔中加200 μL工作液，將96孔板放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min，取出冷卻到室溫，用酶標儀測定吸光度，檢測波長為562 nm。將測得的吸光度繪制標準曲線，計算待測蛋白的含量，根據稀釋梯度折回到線粒體蛋白的原始濃度。根據實驗需要將線粒體蛋白統(tǒng)一標定到10 mg/mL，用于后續(xù)實驗。

1.2.4.3 離體線粒體呼吸速率測定 Clark氧電極法測定腦組織離體線粒體的呼吸速率[15]。采用782 Oxygen System，分別校準“100%氧”“0%氧”電極，校準電極后向反應池中加入線粒體呼吸緩沖液。待電極穩(wěn)定后加入各組標定的線粒體50 μL，依次加入L-谷氨酸5 μL、L-蘋果酸5 μL以及ADP-Na2 5 μL，使總反應體積為1 mL，觀察并記錄氧耗曲線。根據曲線斜率測量線粒體三態(tài)呼吸速率（State3 Respiration Rate，V3）、線粒體四態(tài)呼吸率（State4 Respiration Rate，V4）及線粒體氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation，ADP/O），按照如下公式計算呼吸控制速率（Respiration Control Rate，RCR）和氧化磷酸化速率（Oxidative Phosphorylation Rate，OPR）值：RCR=V3/V4，OPR=V3×ADP/O（nmol ATP/min/mg Protein）。

1.2.4.4 蛋白質印跡法（Western Blotting）檢測腦組織中UCP-1、UCP-2表達水平 提取大鼠腦組織總蛋白。大鼠MCAO術后12 h，速取大腦組織，除去血管和腦膜用冰冷的PBS清洗2遍，稱重、于冰臺上剪碎至3 mm，用玻璃勻漿器冰浴勻漿，按質量∶體積=1∶5的比例加入預冷的裂解緩沖液，置于冰上裂解30 min，將裂解完的組織進行12 000×g，4 ℃離心20 min，收集上清液，置于-80 ℃冰箱儲存。采用SDS-PAGE凝膠電泳法進行蛋白分離。按試劑盒說明書配制分離膠（10%）和積層膠（4%）。分別裝灌分離膠（10%）和積層膠，插入梳子。將待測樣品置于100 ℃水浴鍋煮沸、變性8 min，變性完成后進行12 000×g，4 ℃離心10 min，離心后取出待測樣品，用BCA蛋白定量試劑盒對樣品蛋白定量，將待測樣品蛋白的濃度調節(jié)一致。上樣蛋白Marker及待測樣品，每孔上樣量為40 μg蛋白。電泳。將目的蛋白電轉至PVDF膜后，用3%脫脂牛奶封閉1 h，TBST緩沖液洗膜3次，加入一抗（UCP-1，1∶1 000稀釋;UCP-2，1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標記二抗，常溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次后，采用ECL法顯色，β-actin（1∶5 000稀釋）為內參，采用Image Pro軟件測定各電泳條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數據以平均值±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析進行組間差異分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞線粒體壓力測試 芪參顆粒組及甘草酸、綠原酸、丹酚酸B、黃芪甲苷組，細胞基礎呼吸值均高于對照組，且芪參顆粒100 μg/mL組更顯著，明顯提高細胞的基礎呼吸速率。注入FCCP后，甘草酸、綠原酸、黃芪甲苷組相較于對照組最大呼吸值提高，且綠原酸組更顯著。芪參顆粒組及甘草酸、綠原酸、黃芪甲苷組的ATP合成效率均高于模型組，其中芪參顆粒100 μg/mL組更顯著。相較于模型組，5個藥效成分組均提高了質子漏水平，且丹酚酸B組和丹參酮ⅡA組更顯著。見表1。芪參顆粒及主要藥效成分作用于PC12細胞的呼吸曲線見圖1。

2.2 神經功能學評分 大鼠行MCAO手術12 h后，與假手術組比較，模型組神經行為學評分差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表示MCAO手術復制成功且對大鼠神經損傷明顯;與模型組比較，陽性藥組及芪參顆粒高、中、低劑量組的神經行為學評分均明顯偏低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖2。

2.3 芪參顆粒對腦缺血大鼠線粒體呼吸的作用?? 在ADP/O的檢測中，陽性藥組明顯高于模型組（P<0.01）;芪參顆粒高、中劑量組均明顯高于模型組（P<0.01），低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義;在RCR的檢測中，陽性藥組明顯高于模型組（P<0.01）;芪參顆粒高劑量組高于模型組（P<0.05），芪參顆粒中、低劑量組相較于模型組差異無統(tǒng)計學意義;在OPR的檢測中，陽性藥組明顯高于模型組（P<0.01）;芪參顆粒高、中、低劑量組明顯高于模型組（P<0.05）;在V3的檢測中，陽性藥組以及芪參顆粒的高、中、低劑量組均明顯高于模型組（P<0.01）;在V4的檢測中，陽性藥組明顯高于模型組（P<0.01）;芪參顆粒高、中、低劑量組均明顯高于模型組（P<0.01）。見圖3。

2.4 Western Blotting檢測線粒體功能相關UCP-1和UCP-2的表達 UCP-1在模型組大鼠腦組織中高度表達（P<0.01）。與模型組比較，芪參顆粒高、中劑量組和陽性藥組表達量下降幅度明顯（P<0.05）。見圖4。UCP-2在模型組大鼠腦組織中高度表達（P<0.01）;與模型組比較，陽性藥組與芪參顆粒高劑量組UCP-2表達明顯下降（P<0.01），芪參顆粒中、低劑量組均無明顯下降。實驗發(fā)現，SD大鼠行MCAO手術后，腦組織中UCP-1和UCP-2的表達明顯增加。而給予芪參顆粒治療后，UCP-1和UCP-2表達明顯下降。見圖5。

3 討論

Seahorse生物能量代謝分析儀作為目前生物體能量代謝的金標準，具有傳統(tǒng)方法不可比的高通量、多指標同時精確定量的優(yōu)勢，適合用于中藥復方多組分體系研究。本研究采用Seahorse能量代謝分析儀建立了細胞水平線粒體能量代謝檢測方法，結果證明芪參顆粒及其主要藥效成分可明顯提升PC12神經細胞在缺氧條件下的線粒體氧化磷酸化水平，提高細胞基礎呼吸值、最大呼吸能力、質子漏以及ATP生成量，提示芪參顆粒及藥效成分可能通過改善線粒體呼吸功能，調節(jié)細胞能量代謝，進而發(fā)揮抗缺氧的細胞保護作用。實驗中發(fā)現芪參顆粒及其主要藥效成分對線粒體氧化磷酸化的多種指標表現不同程度的改善作用，為后續(xù)多成分協(xié)同作用研究提供了基礎。

本研究采用MCAO大鼠模型，研究芪參顆粒對腦缺血大鼠腦組織線粒體呼吸作用以及呼吸功能相關UCP-1、UCP-2表達的影響。實驗發(fā)現，相較于模型組，芪參顆粒高、中、低劑量組均可提高大鼠腦線粒體的三態(tài)、四態(tài)呼吸速率，而芪參顆粒高、中劑量組可提高氧化磷酸化效率，增加單位時間線粒體蛋白合成ATP的效率。提示芪參顆粒可能通過改善線粒體呼吸功能從而對腦缺血大鼠發(fā)揮神經保護作用。有研究表明UCP在腦缺血中表達，并可能在線粒體能量代謝中發(fā)揮重要作用，UCP的過表達可以增加ATP的含量和ATP/ADP比例[16-17]。本實驗發(fā)現，大鼠行MCAO手術后，腦組織中UCP-1和UCP-2表達明顯增加?？赡苁窃谀X缺血急性期，由于UCP的過表達而導致的能量增加對早期細胞應對損傷是很有必要的保護手段[18]，以緩解缺血急性期缺血缺氧造成的嚴重能量供應不足，與模型組比較，芪參顆粒各給藥組UCP-1的表達量均有明顯下降，而對于UCP-2，芪參顆粒高劑量組和陽性對照藥組的UCP-2的表達顯著性下降，芪參顆粒中、低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。這提示芪參顆?？赡芡ㄟ^調節(jié)UCP的表達來發(fā)揮線粒體呼吸保護作用，而對于UCP相關信號通路的干預作用，仍需要進一步研究。

心腦血管病是一類嚴重威脅人類健康的疾病，具有高病死率、高致殘率特征。中藥復方因其多組分、多靶點特點用于防治心腦血管疾病具有優(yōu)勢，與中醫(yī)認為“心腦互為體用，共主神明”[19]，“腦心同治”的整體治療理念相契合?，F代研究也認為心腦血管雖分屬于不同器官系統(tǒng)，但其存在相同的病理基礎，于心則為冠心病，于腦則發(fā)中風，且高血壓、心律失常、心力衰竭、冠心病等心臟病變均可影響腦血管，誘發(fā)腦血管疾病并相互影響[20-21]，甚至有心源性腦缺血的說法[22]。前期研究表明芪參顆粒對心力衰竭具良好療效，而本研究表明芪參顆?？赡芡ㄟ^改善線粒體能量代謝障礙而發(fā)揮抗缺血性中風保護作用，這一特點符合中醫(yī)的“腦心同治”理論。靶向線粒體作為治療缺血性中風的一種有前途的策略，中藥干預線粒體能量代謝研究，可為中藥新藥研發(fā)提供新思路。

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（2021-10-27收稿 本文編輯：王明）