席玉婕 高錦成 郭非非 楊洪軍

摘要 目的：基于藥物干擾疾病網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性的方法來預(yù)測(cè)和血明目片潛在的適應(yīng)證。方法：使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）等數(shù)據(jù)庫(kù)搜集和血明目片中的活性成分，利用BATMAN-TCM預(yù)測(cè)成分的潛在靶點(diǎn);通過DisGeNET和HPO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取相應(yīng)的疾病蛋白靶標(biāo)，基于靶點(diǎn)移除前后整體網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鞯淖兓u(píng)價(jià)藥物靶點(diǎn)對(duì)于網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性的影響，實(shí)現(xiàn)和血明目片干預(yù)不同疾病藥效的預(yù)測(cè)。通過建立“中藥成分-藥物靶點(diǎn)-疾病蛋白”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，從中篩選出潛在藥物作用靶點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行富集分析，考察和血明目片干預(yù)疾病可能的生物學(xué)過程和信號(hào)通路，最終從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的角度初步對(duì)藥效進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：搜集整理后得到和血明目片所含化學(xué)成分946個(gè)，預(yù)測(cè)高可信度靶點(diǎn)761個(gè)。通過考察藥物擾動(dòng)疾病網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性，發(fā)現(xiàn)和血明目片對(duì)翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜新生血管化的疾病網(wǎng)絡(luò)有較強(qiáng)的擾動(dòng)作用。通過構(gòu)建和血明目片干預(yù)不同疾病的“中藥成分-藥物靶點(diǎn)-疾病蛋白”異質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，獲得相應(yīng)的潛在藥物作用靶點(diǎn)，多項(xiàng)富集分析結(jié)果顯示和血明目片可能通過干預(yù)血管新生、白細(xì)胞遷移、脂多糖（LPS）應(yīng)答、核因子κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡通路、氧化應(yīng)激通路等過程來發(fā)揮作用。以上4種疾病潛在作用通路與和血明目片的潛在作用通路具有一致性，且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)很好地證明了和血明目片對(duì)于治療視網(wǎng)膜損傷具有一定的藥效。結(jié)論：和血明目片具有“多組成、多靶標(biāo)、多通路”的特點(diǎn)，對(duì)翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜新生血管化等4種適應(yīng)證存在潛在的治療作用。

關(guān)鍵詞 和血明目片;網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性;富集分析;潛在適應(yīng)證

Prediction of Potential Indications of Hexuemingmu Tablets Based on Network Robustness

XI Yujie1，2，GAO Jincheng3，GUO Feifei1，YANG Hongjun2，4

（1 Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China; 3 Shaanxi Provincial Hospital of Chinese Medicine，Xi′an 710003，China; 4 Experimental Research Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：To predict the potential indications of Hexuemingmu tablets（HXMM tablets） based on the method of medicinal interfering on the network robustness of disease.Methods：The active components of HXMM tablets were collected by Traditional Chinese Medicine Integrated Database（TCMID） and Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），and the potential targets of components were predicted by Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM）.The corresponding protein targets of diseases were obtained from DisGeNET and Human Phenotype Ontology（HPO） databases.The effects of medicine targets on the network robustness were evaluated based on the changes of topological characteristics of the whole network after targets were removed，and the pharmacological effect of HXMM tablets interfering on different diseases were predicted.The correlation network of “Chinese medicine chemical component-medicine target-disease protein” was established，and the potential medicine action targets were screened out to conduct enrichment analysis.The possible biological processes and signal pathways of HXMM tablets interfering on diseases were investigated，and the pharmacological effect was eventually verified by in vitro cell experiments.Results：A total of 946 chemical components of HXMM tablets were obtained and 761 highly credible targets were predicted after collection.By investigating the medicinal interference on the network robustness of disease，this study found that HXMM tablets had a strong interfering effect on the disease networks of the four indications（pterygium，keratitis，ocular hypertension，and corneal neovascularization）.The potential medicine active targets were obtained from the heterogeneous network of “Chinese medicine chemical component-medicine target-disease protein” of different diseases intervened by HXMM tablets.The results of multiple enrichment analyses showed that HXMM tablets may play a role by interfering on angiogenesis，leukocyte traffic，lipopolysaccharide（LPS） response，nuclear factor kappa B（NF-κB） transcriptional regulation，apoptosis pathway，oxidative stress pathway，and so on.The potential action pathways of the four indications and HXMM tablets were consistent.Conclusion：HXMM tablet has potential pharmacological effects on treating the four indications（pterygium，keratitis，ocular hypertension，and corneal neovascularization） with “multi-composition，multi-target，and multi-pathway” characteristics.

Keywords Hexuemingmu tablets; Network robustness; Enrichment analysis; Potential indications

中圖分類號(hào)：R285;R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.004

和血明目片由蒲黃、丹參、地黃、墨旱蓮、菊花、黃芩（炭）、決明子、車前子、茺蔚子、女貞子、夏枯草、龍膽、郁金、木賊、赤芍、牡丹皮、山楂、當(dāng)歸、川芎共計(jì)19味藥組成。全方根據(jù)四物湯和二至丸加減[1-2]，其中君藥生地黃、當(dāng)歸、赤芍、川芎補(bǔ)散結(jié)合，發(fā)揮活血化瘀、補(bǔ)血之功，補(bǔ)而不滯，行而不破，藥專力宏，墨旱蓮、女貞子以滋補(bǔ)肝腎，生精止血為主，為平補(bǔ)虛之良劑;臣藥中蒲黃、牡丹皮、丹參、茺蔚子既涼血止血又化瘀利水，和血效佳，山楂、郁金偏于行氣導(dǎo)滯，可消積散瘀;黃芩、菊花、龍膽、夏枯草、木賊為佐藥，上能疏散風(fēng)熱清利頭目，下可清熱燥濕瀉肝膽火;使藥決明子、車前子協(xié)同發(fā)揮清肝明目、利水通便之效。因此和血明目片具有涼血止血、滋陰化瘀、養(yǎng)肝明目的功效，用于陰虛肝旺，熱傷絡(luò)脈所引起的眼底出血[3]。

和血明目片目前收錄在2020版《中華人民共和國(guó)藥典》中，在年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等疾病中得到廣泛應(yīng)用[4-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該藥在早期止血，中后期促進(jìn)瘀血吸收，改善微循環(huán)，擴(kuò)張血管、抗血栓形成等方面療效較好[7-8]。基于本課題組開發(fā)的藥效預(yù)測(cè)平臺(tái)調(diào)研翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜新生血管化、角膜不透明、錐形桿狀肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、結(jié)膜炎、瞼板腺炎、干燥性角膜結(jié)膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎等相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)和血明目片干預(yù)翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜新生血管化的擾動(dòng)評(píng)分大于零，提示和血明目片可能對(duì)于以上4種適應(yīng)證具有潛在治療作用。

1 資料與方法

1.1 和血明目潛在藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）和中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID）等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取和血明目片中蒲黃、丹參、地黃、墨旱蓮、菊花、黃芩（炭）、決明子、車前子、茺蔚子、女貞子、夏枯草、龍膽、郁金、木賊、赤芍、牡丹皮、山楂、當(dāng)歸、川芎等中藥的化學(xué)成分信息[9-10]，通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)[11]（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）獲得藥物成分可能發(fā)生相互作用的靶標(biāo)蛋白，并選擇其中高可信度（打分值大于30）的蛋白作為藥物的潛在靶點(diǎn)。

1.2 疾病數(shù)據(jù)的搜集 翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜新生血管化、角膜不透明、錐形桿狀肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、結(jié)膜炎、瞼板腺炎、干燥性角膜結(jié)膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎等10種疾病靶標(biāo)均來源于Human Phenotype Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//humanphenotype-ontology.github.io/）和DisGeNET（http：//www.disgenet.org）數(shù)據(jù)庫(kù)[12-13]。

1.3 靶標(biāo)的功能富集分析 藥物、疾病的靶標(biāo)功能分析中涉及的基因本體（Gene Ontology，GO）功能條目的富集分析是由Metascape軟件來實(shí)現(xiàn)的[14]，具體的原理是基于超幾何分布設(shè)計(jì)的算法，而多重檢驗(yàn)校正則使用Benjamini-Hochberg校正方法。

1.4 基于網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性的藥物干預(yù)疾病能力預(yù)測(cè)

1.4.1 眼科疾病網(wǎng)絡(luò)的模 疾病網(wǎng)絡(luò)由疾病相關(guān)的基因之間的相互作用組成。采用來自于STRING[15]（version 10）數(shù)據(jù)庫(kù)的置信度大于0.4的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（下載于2020年1月26日）。利用Cytoscape（version 3.4.0）對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化[16]，計(jì)算藥物干預(yù)前后反映網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性的拓?fù)涮卣?，包括整體網(wǎng)絡(luò)的平均最短路徑、平均連接度、連接度中心性和緊密度中心性[17]。

1.4.2 藥物干預(yù)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性的評(píng)價(jià)方法 藥物干預(yù)前后疾病網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鞯淖兓痆18]，即藥物對(duì)疾病的擾動(dòng)作用，可以通過在疾病網(wǎng)絡(luò)中刪除藥物靶點(diǎn)來表示。經(jīng)過R的iGraph包[19]進(jìn)行計(jì)算后，平均最短路徑、網(wǎng)絡(luò)平均連接度、網(wǎng)絡(luò)連接度中心性和網(wǎng)絡(luò)緊密度中心性等4個(gè)指標(biāo)可用來作為評(píng)價(jià)干預(yù)前后疾病網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)健性。其中，網(wǎng)絡(luò)的平均連接度是網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)連接度的平均值;網(wǎng)絡(luò)的連接度中心性為網(wǎng)絡(luò)中的所有節(jié)點(diǎn)的連接度計(jì)算而來;網(wǎng)絡(luò)的緊密度中心性也是由網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)的緊密度計(jì)算得出，以上3個(gè)數(shù)值大小均與網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性正相關(guān)，數(shù)值越大網(wǎng)絡(luò)越穩(wěn)定，藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)作用相對(duì)越弱。而平均最短路徑代表網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中所有最短路徑長(zhǎng)度的平均值，數(shù)值越小網(wǎng)絡(luò)越穩(wěn)定，正擾動(dòng)率說明藥物對(duì)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性破壞能力強(qiáng)。根據(jù)以上指標(biāo)相互作用關(guān)系，擾動(dòng)率計(jì)算公式可表示為：校正前擾動(dòng)率=（藥物干預(yù)后拓?fù)涮卣髦?藥物干預(yù)前拓?fù)涮卣髦担?藥物干預(yù)前拓?fù)涮卣髦?。而該擾動(dòng)率通過零分布（Null distribution）校正后才可用于不同藥物的擾動(dòng)率比較，校正方法見1.4.3部分。藥物擾動(dòng)總分計(jì)算公式如下，公式中的擾動(dòng)率均利用Null distribution校正：擾動(dòng)總分=校正后的平均最短路徑擾動(dòng)率-校正后平均連接度擾動(dòng)率-校正后連接度中心性擾動(dòng)率-校正后緊密度中心性擾動(dòng)率。

1.4.3 利用藥物干預(yù)隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)的Null distribution作為總體分布校正藥物對(duì)于真實(shí)網(wǎng)絡(luò)的擾動(dòng)率 由于藥物作用靶點(diǎn)大多屬于總體分布未知的小樣本數(shù)據(jù)，因此在進(jìn)行顯著性考察時(shí)常使用置換檢驗(yàn)（Permutation test）。疾病網(wǎng)絡(luò)零分布（Null distribution）的實(shí)質(zhì)是在保留真實(shí)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)和邊數(shù)后生成隨機(jī)的網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣髦?。隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的Null distribution可作為基準(zhǔn)，與真實(shí)疾病網(wǎng)絡(luò)的藥物作用進(jìn)行比較，考察在相同的藥物擾動(dòng)后，其擾動(dòng)率的總體分布以及真實(shí)網(wǎng)絡(luò)和隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)之間的網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性是否存在顯著差異。通過與100個(gè)隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的Null distribution比較，真實(shí)網(wǎng)絡(luò)的擾動(dòng)率能比較客觀地評(píng)價(jià)藥物在實(shí)際疾病網(wǎng)絡(luò)中引起顯著影響的干擾程度。此外，利用藥物在真實(shí)網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng)率在Null distribution中對(duì)應(yīng)的Z-score可用于評(píng)價(jià)校正后的網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性的擾動(dòng)率。Z-score越大，表明藥物干預(yù)后網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性越差，藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的影響越大。

1.5 “中藥成分-藥物靶點(diǎn)-疾病蛋白”異質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性原理，將前期預(yù)測(cè)到的潛在藥物靶點(diǎn)及疾病數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥藥效預(yù)測(cè)平臺(tái)開展相關(guān)研究[10]，得到相應(yīng)的擾動(dòng)總分及“中藥成分-藥物靶點(diǎn)-疾病蛋白”的異質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)了中藥成分與疾病之間以及疾病蛋白與藥物靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，為中藥干預(yù)疾病的機(jī)制探索提供線索。該網(wǎng)絡(luò)包含了3種類型的節(jié)點(diǎn)，不同類型的結(jié)果分別使用不同的顏色和形狀來表示。其中粉色三角形表示中藥組成成分，藍(lán)色菱形表示藥物的潛在靶標(biāo)，紫色圓形表示與適應(yīng)證相關(guān)的疾病蛋白。網(wǎng)絡(luò)還包含了2種聯(lián)系（邊），分別為化合物與靶標(biāo)的聯(lián)系（通過BATMAN-TCM來預(yù)測(cè)，打分大于30）、藥物靶點(diǎn)與疾病蛋白的PPI關(guān)系（來源于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中打分大于0.4的PPI）。為了考察和血明目片干預(yù)潛在適應(yīng)證可能參與的生物學(xué)過程，通過計(jì)算紅色矩形中藥物作用的潛在靶標(biāo)（疾病蛋白與藥物靶點(diǎn)的交集）的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦?，篩選連接度（Degree）大于中位數(shù)的值進(jìn)行GO生物學(xué)富集分析。

1.6 和血明目片干預(yù)潛在適應(yīng)證的作用特點(diǎn)探索? 根據(jù)上述和血明目片干預(yù)潛在適應(yīng)證的疾病蛋白富集分析結(jié)果，整理顯著性排名前5位的生物學(xué)過程。進(jìn)行和血明目片作用于適應(yīng)證的環(huán)節(jié)探索?；谇捌陬A(yù)測(cè)的潛在適應(yīng)證藥物的潛在作用靶標(biāo)，通過計(jì)算其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦?，篩選大于二倍Degree的靶標(biāo)，認(rèn)為可能是疾病核心作用靶標(biāo)。將所有潛在適應(yīng)證的疾病核心作用靶標(biāo)取交集，并進(jìn)行作用特點(diǎn)探索。

1.7 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 細(xì)胞 人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞ARPE-19（ATCC，美國(guó)，批號(hào)：20210603），培養(yǎng)條件為1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）和1%青霉素-鏈霉素（Penicillin-Streptomycin，PS），二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（溫度：37 ℃，濕度：100%，5% CO2和95% O2）。

1.7.2 藥物 和血明目片藥粉（西安碑林藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20210428）。

1.7.3 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號(hào)：11875093）、胎牛血清（貨號(hào)：1600044）、青-鏈霉素混合液（貨號(hào)：15070063）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液（貨號(hào)：25200072）、磷酸鹽緩沖液（貨號(hào)：10010023）以上均購(gòu)美國(guó)GIBCO公司;細(xì)胞凍存液（蘇州新賽美生物科技有限公司，貨號(hào)：C40100），CCK-8檢測(cè)試劑盒（Dojindo公司，日本，貨號(hào)：CK04），貝伐單抗（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號(hào)：B303060），氯化鈉（NaCl，北京化工廠，批號(hào)：20160223），氯化鉀（KCl，批號(hào)：20130612）、碳酸氫鈉（NaHCO3，批號(hào)：20150326）、磷酸二氫鈉（NaHPO3，批號(hào)：20090727）、氯化鎂（MgCl2，批號(hào)：F20080103）、氯化鈣（CaCl2，批號(hào)：F20090602）、葡萄糖（C6H12O6，批號(hào)：20150303）、以上均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。CO2培養(yǎng)箱（SANYO公司，日本，型號(hào)：MCO-18AIC），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠，型號(hào)：SW-CF-2FD），倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號(hào)：CKX41），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)，型號(hào)：MμltiskanTM FC），-86 ℃超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司，型號(hào)：DW-86L728），離體腸灌流系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司，型號(hào)：ALC-M），電子天平（METTLER TOLEDO公司，瑞士，型號(hào)：ME54），臺(tái)式循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，型號(hào)：SHB-Ⅲ），96孔板（型號(hào)：3599）、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶（型號(hào)：430639）以上購(gòu)于美國(guó)Corning公司。

1.7.4 含藥腸吸收液的制備

1.7.4.1 臺(tái)式緩沖液的配制 NaCl 8.0 g，NaHCO3 1.0 g，KCl 0.28 g，MgCl20.1 g，NaH2PO4 0.05 g溶于500 mL蒸餾水中，密閉冷藏;CaCl2 0.2 g溶于500 mL蒸餾水中密閉冷藏;使用將前二者均勻攪拌，最后加入葡萄糖1.0 g混合即可。

1.7.4.2 含藥腸吸收液的制備 將實(shí)驗(yàn)前禁食12 h的大鼠稱重后，斷頸椎處死，沿腹中線和腹白線分別剪開皮膚與肌肉。迅速取出小腸，自胃幽門以下10 cm開始向下為空腸段，自胃幽門以下10 cm開始向下量取14 cm為腸段1;間隔10 cm量取14 cm為腸段2;再間隔10 cm量取14 cm為腸段3;從回盲瓣以上5 cm開始向上取14 cm為腸段4。將剪下的腸管放入0 ℃臺(tái)氏液中沖洗至無腸內(nèi)容物為止。將自制硅膠套管軟端插入腸管用絲線結(jié)扎，小心將腸道翻轉(zhuǎn)。用0 ℃臺(tái)氏液沖洗內(nèi)表面，將另一端用絲線結(jié)扎成囊狀。麥?zhǔn)显」苤蓄A(yù)先加入含藥供試藥液25 mL，通入混合氣體（95% O2，5% CO2），保持37 ℃恒溫。在腸管中注入臺(tái)氏液2 mL，放入麥?zhǔn)显」苤校?20 min后收取樣品。樣品放入干凈的離心管中，于-80 ℃密封直立保存，待用[20]。

1.7.5 方法

1.7.5.1 分組與模型制備 取人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞正常復(fù)蘇，使用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2，95%O2條件下進(jìn)行正常培養(yǎng)。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組、貝伐單抗-陽性藥組（1 mg/mL）、和血明目腸吸收液低濃度組（600 μg/mL）、中濃度組（300 μg/mL）、低濃度組（150 μg/mL）。待ARPE-19細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，傾倒原培養(yǎng)液，改用無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h，不同濃度過氧化氫（80、100、150、200、300 μmol/L）處理2 h后終止培養(yǎng)，每孔小心加入10 μL CCK-8溶液，盡量避免氣泡的產(chǎn)生，放入培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1～4 h，酶標(biāo)儀于450 nm下測(cè)量孔板的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為細(xì)胞成活率=（A觀察組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

1.7.5.2 給藥方法 常規(guī)培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，待ARPE-19細(xì)胞密度達(dá)到對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期時(shí)配制成混懸液，接種在96孔板，接種密度為2×104個(gè)細(xì)胞/孔。過夜培養(yǎng)細(xì)胞后進(jìn)行饑餓處理12 h，正常組與模型組加入無血清培養(yǎng)基，給藥組加入高中低不同濃度的和血明目腸吸收液，作用細(xì)胞24 h，隨后造模2 h，最后使用CCK-8法測(cè)定其細(xì)胞成活率。

1.7.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 和血明目片潛在藥物靶點(diǎn)及潛在機(jī)制分析?? 基于上述方法得到和血明目片所含化學(xué)成分226個(gè)，高可信度靶標(biāo)854個(gè)。富集分析結(jié)果表明和血明目片的潛在靶標(biāo)富集的GO生物學(xué)功能條目包括血液循環(huán)（Blood Circulation）、脂質(zhì)生物合成（Lipid Biosynthetic Process）、氧化應(yīng)激（Response to Oxidative Stress，Reactive Oxygen Species Metabolic Process）、血管收縮（Positive Regulation of Vasoconstriction）等。見圖1。

圖1 藥物潛在作用靶標(biāo)GO功能富集分析氣泡圖? 注：橫坐標(biāo)代表Enrichment，縱坐標(biāo)代表-Log（q-value），節(jié)點(diǎn)大小與之匹配的靶標(biāo)的數(shù)目有關(guān)

2.2 和血明目片干預(yù)疾病網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性分析 按照擾動(dòng)總分對(duì)搜集獲得的9類適應(yīng)證由大至小進(jìn)行排序。結(jié)果顯示，和血明目片干預(yù)9個(gè)潛在適應(yīng)證后，擾動(dòng)總分大于0的共有4個(gè)，分別為翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥和角膜新生血管化，擾動(dòng)總分小于0的共有5個(gè)。見表2。

2.3 和血明目片干預(yù)翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜血管新生化的機(jī)制預(yù)測(cè) 和血明目片干預(yù)翼狀胬肉的“中藥成分-藥物靶點(diǎn)-疾病蛋白”異質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，包含了221個(gè)和血明目片的組成化合物、64個(gè)和血明目片的潛在靶標(biāo)以及122個(gè)與藥物關(guān)聯(lián)的疾病蛋白。其中，節(jié)點(diǎn)的Degree值排名前列的關(guān)鍵靶點(diǎn)有TP53、AKT1、EGFR、EGF、FN1等。見圖2A。和血明目片干預(yù)角膜炎的“中藥成分-藥物靶標(biāo)-疾病蛋白”異質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，包含了216個(gè)和血明目片的組成化合物、41個(gè)和血明目片的潛在靶標(biāo)以及95個(gè)與藥物關(guān)聯(lián)的疾病蛋白。其中，節(jié)點(diǎn)的Degree值排名前列的關(guān)鍵靶點(diǎn)有IL-10、IL-6、APOE及CAT等。見圖2B。和血明目片干預(yù)高眼壓癥的“中藥成分-藥物靶標(biāo)-疾病蛋白”異質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，包含了236個(gè)和血明目片的組成化合物、33個(gè)和血明目片的潛在靶標(biāo)以及47個(gè)與藥物關(guān)聯(lián)的疾病蛋白。其中，節(jié)點(diǎn)的Degree值排名前列的關(guān)鍵靶點(diǎn)有NR3C1、FAS、JUN、SHH及IL-1β等。見圖2C。和血明目片干預(yù)角膜新生血管化的“中藥成分-藥物靶標(biāo)-疾病蛋白”異質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，包含了189個(gè)和血明目片的組成化合物、32個(gè)和血明目片的潛在靶標(biāo)以及59個(gè)與藥物關(guān)聯(lián)的疾病蛋白。其中，節(jié)點(diǎn)的Degree值排名前列的關(guān)鍵靶點(diǎn)有CTNNB1、FGF2、IL-6、APOE及AKT1等。見圖2D。

和血明目片干預(yù)翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜血管新生化等適應(yīng)證中與藥物作用相關(guān)的疾病靶標(biāo)功能富集分析。其中，和血明目片干預(yù)翼狀胬肉顯著富集排名前5的生物學(xué)過程分別為血管新生（Blood Vessel Development，Angiogenesis）、細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix）、氧化損傷（Response to Wounding，Response to Oxygen Levels）、細(xì)胞增殖（Muscle Cell Proliferation）及轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)節(jié)（Positive Regulation of Transferase activity）等。見圖3A。和血明目片干預(yù)角膜炎中位居前列顯著富集的生物學(xué)過程分別為炎癥反應(yīng)（Inflammation Response）、脂多糖反應(yīng)（Response to Lipopolysaccharide）、白細(xì)胞遷移（Leukocyte Migration）、核因子κB轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)（Positive Regulation of NF-kappa B Transcription Factor Activity）及MAPK級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)（Positive Regulation of MAPK Cascade）等。見圖3B。和血明目片干預(yù)高眼壓癥中位居前列顯著富集的生物學(xué)過程分別為凋亡信號(hào)通路（Apoptotic Signaling Pathway）、MAPK級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)（Positive regulation of MAPK Cascade）、上皮細(xì)胞增殖（Epithlial Cell Proliferation）、血管新生（Blood Vessel Development）及細(xì)胞損傷（Response to Wounding）等。見圖3C。和血明目片干預(yù)角膜新生血管化中位居前列顯著富集的生物學(xué)過程分別為血管新生（Blood Vessel Development，Vasculature Development）、細(xì)胞遷移（Positive Regulation of Cell Migration）、炎癥反應(yīng)（Inflammation Response）、上皮細(xì)胞增殖（Epithlial Cell Proliferation）及MAPK級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)（Regulation of MAPK Cascade）等。見圖3D。

2.4 和血明目干預(yù)4個(gè)潛在適應(yīng)證靶點(diǎn)作用特點(diǎn)? 血管新生和細(xì)胞增殖可能是和血明目片作用于翼狀胬肉，高眼壓癥和角膜血管新生化共有的2個(gè)環(huán)節(jié);MAPK級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)可能是角膜炎，高眼壓癥和角膜血管新生化的共有環(huán)節(jié);炎癥反應(yīng)可能是角膜炎和角膜血管新生化的共有環(huán)節(jié)。見表3。通過篩選疾病核心作用靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦?，得到治療翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜新生血管化疾病核心作用靶點(diǎn)分別為64、41、33、32個(gè)。見圖4。其中出現(xiàn)次數(shù)最多的共同核心靶點(diǎn)有MMP9、CXCR4、IL6和IL1B。翼狀胬肉與高眼壓癥的共有靶點(diǎn)有TP53、JUN，角膜炎和高眼壓癥共有靶點(diǎn)有核因子κB1，高眼壓癥與角膜血管新生化共有靶點(diǎn)有ALB，角膜炎與角膜血管新生化特異性共有靶標(biāo)有4個(gè)，分別是APOE、CCL2、IKBKB、TSPO。

2.5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.5.1 過氧化氫誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷 與正常組比較，過氧化氫濃度在150～300 μmol/L范圍內(nèi)的細(xì)胞成活率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇接近半數(shù)抑制濃度的200 μmol/L的過氧化氫進(jìn)行造模。見表4。

2.5.2 和血明目方對(duì)ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用?? 相較于模型組，預(yù)防給藥24 h后，濃度為600 μg/mL的和血明目方高劑量組的細(xì)胞活力較為顯著（P<0.01），300 μg/mL的和血明目中劑量組和1 mg/mL的貝伐單抗陽性藥的細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖5。

3 討論

作為中華民族的文明瑰寶，中醫(yī)藥以其獨(dú)有的自身優(yōu)勢(shì)保持著強(qiáng)大的生命力，然而隨著現(xiàn)代科學(xué)飛速發(fā)展，國(guó)民健康意識(shí)的不斷提高，中藥的活性成分辨識(shí)、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、作用機(jī)制科學(xué)闡釋等復(fù)雜體系解析已成為當(dāng)代重大前沿科學(xué)問題。本研究通過構(gòu)建“中藥成分-藥物靶點(diǎn)-疾病蛋白”的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，考察和血明目片對(duì)于多種眼科疾病網(wǎng)絡(luò)的擾動(dòng)作用，預(yù)測(cè)和血明目片潛在的適應(yīng)證，為中藥復(fù)雜機(jī)制闡釋提供了一定線索。

根據(jù)和血明目片潛在藥物靶點(diǎn)富集分析結(jié)果顯示，其生物學(xué)功能主要與血液循環(huán)、氧化應(yīng)激應(yīng)答、血管收縮等調(diào)控密切相關(guān)，這與和血明目片臨床應(yīng)用一致，說明該藥可能通過調(diào)控血液循環(huán)或氧化應(yīng)激等生物過程來干預(yù)眼科相關(guān)疾病?；谥兴幩幮ьA(yù)測(cè)平臺(tái)分析結(jié)果推測(cè)和血明目片對(duì)于翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜新生血管化等4種疾病存在一定干預(yù)作用。表皮生長(zhǎng)因子受體在抗血管生成、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡方面已取得公認(rèn)的療效[21]，提示這些蛋白可能是HXMM治療翼狀胬肉的重要效應(yīng)蛋白。研究表明翼狀胬肉的形成受環(huán)境因素的影響，同時(shí)與細(xì)胞凋亡、血管新生、基質(zhì)金屬蛋白酶以及病毒感染有關(guān)[22]。因此和血明目可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激等過程來影響細(xì)胞凋亡，同時(shí)也通過調(diào)控血管形成來干預(yù)疾病的發(fā)生。和血明目片還可能通過干預(yù)炎癥反應(yīng)白細(xì)胞遷移、脂多糖（LPS）應(yīng)答、核因子κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能來發(fā)揮作用。前人研究證實(shí)角膜炎的發(fā)生主要與免疫炎癥，細(xì)菌感染相關(guān)結(jié)論一致，由此預(yù)測(cè)和血明目可能通過調(diào)控免疫炎癥等過程來干預(yù)角膜炎的發(fā)生[23]。研究表明高眼壓癥的發(fā)病因素與全身系統(tǒng)相關(guān)，主要涉及糖尿病、高血壓，以及阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征等[24]。因此，和血明目片可能通過調(diào)控以上環(huán)節(jié)來干預(yù)高眼壓癥發(fā)生。在不同的疾病中，導(dǎo)致角膜新生血管形成的主要因素不同，例如角膜移植中的宿主免疫反應(yīng)、角膜緣干細(xì)胞缺乏中干細(xì)胞的維持和分化、接觸鏡相關(guān)眼病中的缺氧、單純皰疹角膜炎中的病毒感染[25]。因此，和血明目可能通過調(diào)控血管新生、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及凋亡等過程來干預(yù)疾病的發(fā)生。本研究得到4個(gè)共同核心靶點(diǎn)基質(zhì)金屬蛋白酶P9、趨化因子CXC亞家族受體4、白細(xì)胞介素6和白細(xì)胞介素-1β，這些靶點(diǎn)通常參與炎癥反應(yīng)、趨化因子表達(dá)等環(huán)節(jié)，提示和血明目可能主要通過改善炎癥反應(yīng)治療其潛在適應(yīng)證;翼狀胬肉與高眼壓癥的共有靶點(diǎn)有腫瘤蛋白53、Jun，這些靶點(diǎn)的相關(guān)通路常與凋亡相關(guān)[26-27];角膜炎和高眼壓癥共有靶點(diǎn)有核因子κB1，提示這2種疾病的特異性環(huán)節(jié)可能與免疫調(diào)節(jié)介導(dǎo)的核因子κB信號(hào)通路密切相關(guān)[28];而白蛋白作為高眼壓癥與角膜血管新生化共有靶標(biāo)與凝血功能異常以及體液免疫密切相關(guān)[29-30];角膜炎與角膜血管新生化特異性共有靶標(biāo)有4個(gè)，分別是載脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）、C-C基序趨化因子配體2（C-C Motif Chemokine Ligand2，CCL2）、核因子κB激酶亞基B抑制劑（Inhibitor of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit B，IKKbeta）、轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白（Translocator Protein，TSPO），主要參與脂質(zhì)代謝、免疫應(yīng)答等[31-32]。而在得到和血明目干預(yù)4種適應(yīng)證的特異性靶標(biāo)后，通過文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)。翼狀胬肉代表性環(huán)節(jié)集中在血管新生、凋亡（表皮生長(zhǎng)因子受體、FOS、JUN）[33];角膜炎則為炎癥反應(yīng)為主（IL10、胰島素樣生長(zhǎng)因子、TAT）[34];干預(yù)高眼壓癥以凝血、氧化應(yīng)激為主要特點(diǎn)（載脂蛋白1、C3、超氧化物歧化酶1、β型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1）[35];角膜血管新生化以血管新生為藥效環(huán)節(jié)代表（血管緊張肽原、血纖蛋白溶解酶原、過氧化物酶體增殖物激活受體）[36-37]。以上結(jié)果進(jìn)一步表明和血明目片可能針對(duì)血管新生、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等環(huán)節(jié)進(jìn)行潛在適應(yīng)證的干預(yù)。

中醫(yī)學(xué)中認(rèn)為翼狀胬肉多因心肺二經(jīng)風(fēng)熱壅盛導(dǎo)致虛火上炎、氣滯血瘀[38-39]，和血明目片可以清熱瀉火、理氣活血為主發(fā)揮藥效;角膜炎大多屬于外感風(fēng)熱或熱毒上攻[40-41]，和血明目片可通過祛風(fēng)解表、清肝瀉火進(jìn)行治療;高眼壓癥常與心火旺盛、肝腎陰虛導(dǎo)致的機(jī)體失調(diào)密切相關(guān)[24，42]，臨床可利用和血明目片活血化瘀、清肝明目及滋補(bǔ)肝腎等功效進(jìn)行治療;角膜血管新生化則屬于“血翳包睛”等范疇[43-44]，系體內(nèi)臟腑熱毒壅盛，瘀血凝結(jié)所致，因此和血明目可以瀉火解毒、活血破瘀、滋補(bǔ)肝腎等為用藥依據(jù)。此外，和血明目片針對(duì)陰虛肝旺，熱傷絡(luò)脈等證型所引起的眼部病變的療效已經(jīng)得到臨床證實(shí)，與翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜新生血管化的治則存在一定的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步提示和血明目片對(duì)于上述適應(yīng)證的潛在治療作用。本研究雖然不能直接確定其潛在適應(yīng)證，但為前期臨床探索指明了方向，提供了線索，在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上初步說明和血明目方對(duì)于視網(wǎng)膜損傷具有一定的保護(hù)作用，一定程度上快速確定實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的范圍，減少實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的工作量，節(jié)約時(shí)間和成本。后期計(jì)劃圍繞其潛在適應(yīng)證的作用機(jī)制對(duì)其中的具體作用環(huán)節(jié)進(jìn)行精細(xì)化分析，尋找臨床中具有相似作用機(jī)制的西藥進(jìn)行比較，針對(duì)疾病共有環(huán)節(jié)及特殊環(huán)節(jié)的作用靶標(biāo)進(jìn)行相關(guān)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其中和血明目片干預(yù)4種適應(yīng)證的共有環(huán)節(jié)為炎癥反應(yīng)，可以重點(diǎn)關(guān)注其相關(guān)指標(biāo)白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子等指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，而翼狀胬肉、高眼壓癥、角膜血管新生化的特有環(huán)節(jié)為氧化應(yīng)激，則可以通過檢測(cè)超氧化物歧化酶、活性氧等金指標(biāo)進(jìn)行藥效驗(yàn)證。

綜上所述，基于整合藥物和靶標(biāo)預(yù)測(cè)的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)和血明目片對(duì)于翼狀胬肉、角膜炎、高眼壓癥、角膜新生血管化等疾病有較強(qiáng)的干預(yù)作用。隨后通過文獻(xiàn)考察相關(guān)適應(yīng)證的生物學(xué)過程及通路進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)論。通過開發(fā)的藥物對(duì)于網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)健性擾動(dòng)的評(píng)價(jià)算法，進(jìn)行藥物潛在適應(yīng)證的預(yù)測(cè)，為藥物的二次開發(fā)和精準(zhǔn)定位提供了思路，更為中藥復(fù)雜機(jī)制解析提供參考，希望未來可以應(yīng)用在更多中藥復(fù)方的研究當(dāng)中。

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（2022-03-10收稿 本文編輯：王明）