蔣姣姣, 丁芝祥, 邱梅園, 黃嵐珍

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科(廣西桂林 541001)；2桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心(廣西桂林 541001)

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreo-retinopathy，PVR)是以視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在視網(wǎng)膜表面、視網(wǎng)膜下和玻璃體腔內(nèi)發(fā)生遷移增殖，增殖膜發(fā)展、收縮產(chǎn)生視網(wǎng)膜固定皺褶造成牽拉性視網(wǎng)膜脫離為特征的一種嚴(yán)重眼病[1-2]。RPE細(xì)胞既是PVR病變中主要的移行、分裂、增殖細(xì)胞，也是PVR膜中主要的細(xì)胞成分[3]。目前，手術(shù)仍是治療PVR的標(biāo)準(zhǔn)方法，但手術(shù)只能清除病變的增生組織，并不能預(yù)防和阻止細(xì)胞的增生和遷移，因而PVR復(fù)發(fā)率較高，故目前傾向于手術(shù)聯(lián)合眼內(nèi)用藥[4]?，F(xiàn)階段研究用于PVR防治的藥物主要是有抗炎藥、抗腫瘤藥、抗生長(zhǎng)因子藥物等[5]。抗腫瘤藥物特殊的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、抗代謝、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等功能使其早用于眼科疾病，如絲裂霉素、5-氟尿嘧啶可明顯抑制青光眼濾過(guò)手術(shù)[6-7]后瘢痕形成，可有效減少翼狀胬肉手術(shù)[8]的復(fù)發(fā)；新型抗腫瘤類(lèi)藥物如貝伐單抗、阿柏西普等在眼部新生血管類(lèi)疾病如角膜新生血管、新生血管性青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、息肉狀脈絡(luò)膜血管病變等疾病中[9-10]得到了很好的應(yīng)用。而多西他賽(DTX)作為一種以微管為靶點(diǎn)的高效低毒的新型抗腫瘤藥物，具有較高的抗腫瘤活性、抗腫瘤血管形成和誘導(dǎo)凋亡作用[11]。目前廣泛應(yīng)用于臨床多種腫瘤的治療，而在眼科領(lǐng)域應(yīng)用較少，2019年12月至2020年7月我們通過(guò)體外培養(yǎng)的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用DTX特有的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，研究其對(duì)RPE細(xì)胞的增殖抑制作用及其機(jī)制，為研究和治療PVR提供一定的臨床理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和主要試劑 DTX注射液(江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司，劑量為0.5 mL：20 mg/支)；人RPE-19細(xì)胞株(桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)；DMEM培養(yǎng)基、2.5 g/L胰蛋白酶、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶和碘化丙啶(PI)(美國(guó)Sigma公司)。

1.1.2 主要儀器 Thermo細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Electron Corporation)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、倒置相差顯微鏡(日本Olympus/Leica公司)、FACSAriaⅢ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制 hRPE細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d用胰蛋白酶消化傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為2×104·L-1，將細(xì)胞接種于96孔板中。設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和DTX組(分別為10、20、40、80 μg/mL)，空白對(duì)照組加入200 μL不含細(xì)胞培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組和DTX組分別加入100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)細(xì)胞至貼壁后，去上清液后陰性對(duì)照組加入200 μL DMEM培養(yǎng)基，DTX組分別加入不同濃度(10、20、40、80 μg/mL)DTX 200 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。藥物作用結(jié)束后吸出上清液，每孔加入90 μL 培養(yǎng)液和10 μL MTT，培養(yǎng)4 h后，離心去上清液，加入DMSO 100 μL/孔，振蕩至結(jié)晶完全溶解，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。細(xì)胞增殖抑制率=(陰性對(duì)照組A值-DTX組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)組組A值)×100%。

1.2.3 凋亡細(xì)胞的觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按每孔1×105個(gè)接種于6孔板上，標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置不同濃度DTX組和空白對(duì)照組，待細(xì)胞融合至60%后分別加入不同濃度(20、40、80 μg/mL)DTX和相同體積DMEM為空白細(xì)胞對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)作用48 h后，吸除6孔板上清，PBS洗滌2次，每孔加入37%甲醇，20 min固定，吸除后PBS洗滌1次，再加入DAPI染色5 min，抗淬滅熒光封片液固定蓋玻片移入Olympus熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以10×106·L-1濃度接種于直徑為10 cm培養(yǎng)皿中，因MTT法中10 μg/mL DTX對(duì)hRPE細(xì)胞抑制率較小，細(xì)胞貼壁后DTX組加入DTX(20、40、80 μg/mL)200 μL，陰性對(duì)照組加入200 μL DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。24、48 h后分別用胰蛋白酶消化離心后收集細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌后70%冷乙醇固定過(guò)夜。次日去除冷乙醇，PBS緩沖液洗滌后加入0.1 mg/mL RNA酶37℃水浴30 min，加入25 μg/mL PI染色30 min后置于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢查分析細(xì)胞周期分布，數(shù)據(jù)采用流式細(xì)胞儀自帶軟件分析G1/G0期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。

2 結(jié)果

2.1 DTX對(duì)hRPE細(xì)胞增殖的抑制 MTT結(jié)果顯示，隨著DTX濃度的增加，DTX對(duì)hRPE細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)，相同時(shí)間點(diǎn)20 μg/mL與10 μg/mL DTX間、40 μg/mL與20 μg/mL DTX間、80 μg/mL與40 μg/mL DTX間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而隨著DTX作用于hRPE細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)其抑制作用稍增強(qiáng)，40 μg/mL、80 μg/mL DTX作用hRPE 72 h與48 h比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余濃度不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)DTX濃度為80 μg/mL作用于hRPE細(xì)胞48 h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制達(dá)93%，隨著藥物濃度的增加，DTX能明顯抑制hRPE細(xì)胞的增殖，其抑制作用呈濃度依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間hRPE細(xì)胞增殖抑制率

2.2 hRPE凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取不同濃度DTX作用于hRPE細(xì)胞48 h，染色后置于熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞中細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密濃染的顆粒狀或條索狀熒光的凋亡細(xì)胞，隨著濃度的增加，細(xì)胞數(shù)明顯減少，凋亡細(xì)胞數(shù)增加，見(jiàn)圖1。

注：A:20 μg/mL; B:40 μg/mL; C:80 μg/mL;白色箭頭示：凋亡細(xì)胞

2.3 DTX對(duì)hRPE細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，加入DTX的hRPE細(xì)胞各周期比例發(fā)生改變，培養(yǎng)24、48 h的hRPE細(xì)胞中G0/G1期、S期細(xì)胞比例減少，G2/M期細(xì)胞增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=223.04，P<0.01；F=724.93,P<0.01)；隨著濃度增加，G2/M期細(xì)胞增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)；當(dāng)DTX濃度為80 μg/mL作用hRPE 48 h時(shí)細(xì)胞明顯阻滯于G2/M期，見(jiàn)表2～3、圖2。

注：A:正常細(xì)胞周期曲線; B: 20 μg/mL DTX作用48 h細(xì)胞周期曲線; C:40 μg/mL DTX作用48 h細(xì)胞周期曲線; D:80 μg/mL DTX作用48 h細(xì)胞周期曲線

表2 DTX作用24 h與對(duì)照組各期細(xì)胞構(gòu)成比較

表3 DTX作用48 h與對(duì)照組各期細(xì)胞構(gòu)成比較

3 討論

DTX的前體是從歐洲漿果紫杉的針葉中提取，經(jīng)半合成而獲得的紫杉醇衍生物，屬于細(xì)胞周期特異性藥, 可通過(guò)促進(jìn)微管雙聚體裝配成微管，同時(shí)防止去多聚化過(guò)程而使微管穩(wěn)定，從而抑制細(xì)胞有絲分裂和增殖[12]。近年來(lái)許多研究證明,DTX可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，正是由于這種誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡的能力, 使DTX具有特殊的臨床療效。在眼科領(lǐng)域，有學(xué)者[13-14]利用DTX抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖的作用，在白內(nèi)障摘除術(shù)后晶狀體囊袋空腔內(nèi)植入DTX聚合物緩釋劑，可很好防治后發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生，該制劑可持續(xù)釋藥1個(gè)月以上。黃金榮等[15]用DTX滴眼液滴用堿燒傷的兔眼，可有效抑制角膜新生血管的增殖，并可減少角膜組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，對(duì)眼部新生血管性疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。而DTX在眼底PVR的研究方面尚未開(kāi)展。PVR是眼內(nèi)RPE細(xì)胞、Müller細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等增殖、遷移的病理改變過(guò)程，RPE細(xì)胞被認(rèn)為在PVR過(guò)程中發(fā)揮核心作用[4]，所以我們利用hRPE細(xì)胞為材料，研究DTX對(duì)hRPE細(xì)胞增殖的抑制和對(duì)細(xì)胞周期的影響，為PVR治療提供新的用藥途徑。

本研究通過(guò)不同濃度的DTX作用于體外培養(yǎng)的hRPE細(xì)胞，結(jié)果表明當(dāng)DTX濃度大于20 μg/mL時(shí)，可抑制hRPE細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈濃度依賴(lài)性；20 μg/mL DTX作用hRPE 48 h后觀察可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，并隨著濃度增加細(xì)胞數(shù)明顯減少、凋亡細(xì)胞增多。流式細(xì)胞術(shù)顯示，加入DTX的hRPE細(xì)胞G0/G1期、S期細(xì)胞比例減少、G2/M期細(xì)胞增加，說(shuō)明DTX將hRPE細(xì)胞阻滯于G2/M期，即該藥可調(diào)控細(xì)胞有絲分裂誘導(dǎo)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。隨著藥物濃度逐漸增加，G2/M期細(xì)胞增加不明顯，可能與隨著濃度增加DTX抑制hRPE細(xì)胞增殖同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡且存在細(xì)胞毒性相關(guān)。有研究[16]表明，DTX在作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，低劑量時(shí)抑制細(xì)胞遷移、較高劑量時(shí)抑制細(xì)胞增殖、高劑量時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞毒性促進(jìn)細(xì)胞凋亡，DTX是否亦存在低劑量抑制hRPE細(xì)胞遷移有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證，這對(duì)DTX在眼內(nèi)通過(guò)抑制RPE細(xì)胞的遷移而防治PVR發(fā)生有重要意義，同時(shí)這對(duì)于我們探討最合適濃度DTX抑制RPE細(xì)胞增殖、遷移同時(shí)具有最小細(xì)胞毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

抗腫瘤藥物的毒性作用抑制了其在體內(nèi)的應(yīng)用，為了增加和延長(zhǎng)療效、減少眼內(nèi)毒性，用于眼部的抗腫瘤藥物被制成各種緩釋試劑，一部分藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，一部分也已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但仍需要更深入的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐，也需要多學(xué)科包括藥物、化學(xué)、材料、眼科的交叉合作，開(kāi)發(fā)出新的安全有效的眼內(nèi)給藥體系。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：蔣姣姣直接參與醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，采集數(shù)據(jù)，分析解釋數(shù)據(jù)，起草論文，獲取研究經(jīng)費(fèi)；丁芝祥直接參與醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并指導(dǎo)；邱梅園直接參與醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并指導(dǎo)；黃嵐珍直接參與醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，采集數(shù)據(jù)，分析解釋數(shù)據(jù)并指導(dǎo)。