閆紅印, 楊柳, 張克正

平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院普外一區(qū)(河南平頂山 461700)

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，臨床上主要采用化療來控制病情，然而胰腺癌細(xì)胞對化療藥物耐藥則是影響患者預(yù)后不良的主要原因之一[1-2]。因此，探究胰腺癌的耐藥機(jī)制，有助于提高癌細(xì)胞對藥物的敏感性，對改善患者預(yù)后具有重要意義。微小RNA-103(microRNA-103，miR-103)在多種腫瘤中均有表達(dá)，不僅參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，也與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)[3-4]。研究表明[5]，miR-103可靶向負(fù)調(diào)控caveolin-1表達(dá)，增加SGC7901/ADR細(xì)胞對多柔比星敏感性，從而逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥。泛素特異性蛋白酶10(ubiquitin-specific protease 10，USP10)參與細(xì)胞中多種生命活動的調(diào)節(jié)，與腫瘤的發(fā)生和耐藥性有關(guān)。研究表明，降低USP10的表達(dá)可能通過下調(diào)P21蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)變參與胰腺癌細(xì)胞的吉西他濱耐藥[6-7]。但miR-103、USP10對胰腺癌順鉑(DDP)的耐藥性尚未可知，因此，我們于2020年3月至2021年3月開展實驗，探索miR-103對人胰腺癌細(xì)胞(PANC-1)DDP耐藥作用及機(jī)制，以期為臨床探索克服胰腺癌對DDP耐藥性的有效途徑提供依據(jù)。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)(202012-05)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人胰腺癌細(xì)胞(PANC-1)、人正常胰腺上皮細(xì)胞株hTERT-HPNE購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DDP購自山東齊魯制藥有限公司；si-miR-103和si-NC由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計與合成；miR-103、USP10、U6、GAPDH引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成；Lipofectamine 2000試劑盒購自大連Takara公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；CCK-8試劑盒、Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人MRP、Yes相關(guān)蛋白(YAP)、包含WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白1(TAZ)、β-actin單克隆抗體購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 胰腺癌DDP耐藥細(xì)胞株P(guān)ANC-1/DDP的建立 采用高濃度間歇誘導(dǎo)法建立PANC-1/DDP，采用5 μg/mL DDP與PANC-1細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)48 h后，換成不含藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞對數(shù)生長期后，進(jìn)行2次傳代培養(yǎng)，再采用5 μg/mL DDP培養(yǎng)，直至PANC-1細(xì)胞可以在5 μg/mL DDP藥物濃度中穩(wěn)定生長并傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實驗分為3組，將耐藥細(xì)胞PANC-1/DDP分別轉(zhuǎn)染miR-103干擾RNA(si-miR-103)和陰性對照(negative control，si-NC)，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將si-miR-103和si-NC轉(zhuǎn)染PANC-1/DDP細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行陽性克隆篩選。

1.2.3 si-miR-103轉(zhuǎn)染后PANC-1/DDP細(xì)胞對DDP的半抑制濃度 收集對照組、si-miR-103組和si-NC組對數(shù)生長期PANC-1/DDP細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106·mL-1，按照每孔200 μL接種至96孔板中，每孔加入DDP，使其終濃度為0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL，同時設(shè)置DMSO對照孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，CCK-8法測定450 nm處吸光度值，根據(jù)A值計算各藥物的半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)。

1.2.4 實時熒光定量PCR(real-time quantification PCR，RT-qPCR)實驗檢測miR-103、USP10相對表達(dá)量 采用RT-qPCR檢測各組細(xì)胞中miR-103、USP10、MDR1相對表達(dá)量，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書，提取1.2.2各組細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別以U6、GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分別計算各RNA相對表達(dá)量。miR-103、USP10、U6、GADPH引物序列見表1。

表1 miR-103、USP10、MDR1、U6、GAPDH各引物序列

1.2.5 細(xì)胞增殖實驗 轉(zhuǎn)染si-NC、si-miR-103后的PANC-1/DDP細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，經(jīng)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，以每孔1×106·mL-1濃度接種于96孔板，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)2.5 h后，計算細(xì)胞存活率(%)=(OD實驗組/OD空白對照組)×100%。

1.2.6 細(xì)胞凋亡實驗 將轉(zhuǎn)染si-NC、si-miR-103后的PANC-1/DDP細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，加入 5 μL Annexin V-FITC 混勻，4℃避光孵育10 min，再加 5 μL PI 染液，室溫避光孵育 10 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 免疫印跡法(Western blot，WB)檢測多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-related proteins,MRP)、YAP、TAZ水平蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗MRP、YAP、TAZ和β-actin(1∶1 000)，4℃孵化過夜，TBST洗滌3次，再加入HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000)，室溫孵育1.5 h，使用ECL試劑顯色，以β-actin為內(nèi)參，各條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測實驗 根據(jù)MiRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測，miR-103與USP10有靶標(biāo)位點，根據(jù)miR-103結(jié)合USP10 3′UTR序列區(qū)域，構(gòu)建野生型USP10-3′UTR-WT和突變型USP10-3′UTR-MUT質(zhì)粒，PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，均與si-miR-103、si-NC共轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞24 h，分為USP10-3′UTR-WT+si-NC組、USP10-3′UTR-WT+si-miR-103組、USP10-3′UTR-MUT+si-miR-103組和USP10-3′UTR-MUT+si-NC組，根據(jù)說明書制備細(xì)胞提取物，測量各組熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 PANC-1、PANC-1/DDP細(xì)胞miR-103、USP10表達(dá)水平 與hTERT-HPNE細(xì)胞比較，PANC-1與耐藥細(xì)胞PANC-1/DDP中miR-103表達(dá)水平顯著升高，USP10表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與PANC-1比較，耐藥細(xì)胞PANC-1/DDP中miR-103表達(dá)水平顯著升高，USP10表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 PANC-1、PANC-1/DDP細(xì)胞miR-103、USP10表達(dá)情況

2.2 si-miR-103轉(zhuǎn)染后PANC-1/DDP細(xì)胞對DDP的IC50與對照組和si-NC組比較，si-miR-103組PANC-1/DDP細(xì)胞IC50值顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 si-miR-103轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞IC50比較

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miR-103、USP10表達(dá)水平情況 與對照組和si-NC組比較，si-miR-103組miR-103表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，USP10表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組細(xì)胞miR-103、USP10表達(dá)情況

2.4 si-miR-103轉(zhuǎn)染對PANC-1/DDP細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與對照組和si-NC組比較，si-miR-103組PANC-1/DDP細(xì)胞增殖活性下降、凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表5、圖1。

圖1 si-miR-103轉(zhuǎn)染后PANC-1/DDP細(xì)胞凋亡

表5 si-miR-103轉(zhuǎn)染對PANC-1/DDP細(xì)胞凋亡的影響

2.5 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證miR-103與USP10靶向關(guān)系 經(jīng)MiRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，miR-103與USP10 3′UTR區(qū)有結(jié)合位點，見圖2。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與USP10-3′UTR-WT+si-NC組比較，USP10-3′UTR-WT+si-miR-103組熒光素酶活性降低(P<0.05)。見表6、圖2。

圖2 miR-103與USP10結(jié)合位點預(yù)測結(jié)合

表6 各組PANC-1細(xì)胞雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

2.6 si-miR-103轉(zhuǎn)染對PANC-1/DDP細(xì)胞MRP、YAP、TAZ蛋白表達(dá)的影響 與對照組和si-NC組比較，si-miR-103組MRP、YAP、TAZ蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖3、表7。

注：A：對照組；B：si-NC組；C：si-miR-103組

表7 各組細(xì)胞YAP、TAZ蛋白表達(dá)情況

2.7 敲減USP10對PANC-1/DDP細(xì)胞增殖及YAP、TAZ蛋白表達(dá)的影響 與si-NC組比較，敲減USP10后，si-USP10組細(xì)胞增殖活性顯著增高，YAP、TAZ蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，同時敲減USP10與抑制miR-103表達(dá)后，si-USP10組與si-NC組細(xì)胞增殖活性與YAP、TAZ蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表8、圖4。

表8 各組細(xì)胞增殖活性及YAP、TAZ蛋白表達(dá)情況

注：A：si-NC組；B：si-USP10組；C：si-USP10+miR-103抑制組；D：miR-103抑制組

3 討論

胰腺癌是診斷和治療都很困難的惡性腫瘤，胰腺癌治療主要以化療為主，目前胰腺癌的化療藥物主要有DDP、吉西他濱、卡培他濱、5-氟尿嘧啶、紫杉醇類等。DDP是治療胰腺癌的一線藥物，然而對DDP耐藥是導(dǎo)致胰腺癌化療失敗的主要原因[8-9]。

多項研究表明[10-11]，有多種miRNA在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與耐藥中發(fā)揮調(diào)控作用。何平等[12]研究表明，miR-429在胰腺癌卡培他濱耐藥細(xì)胞株中高表達(dá)，敲低miR-429可通過靶向上調(diào)PTEN并阻斷PI3K/AKT信號通路，進(jìn)而顯著抑制PANC-1/CAP細(xì)胞增殖活力，從而下調(diào)PANC-1/CAP細(xì)胞對卡培他濱的耐藥性。本研究結(jié)果顯示，在PANC-1及耐藥細(xì)胞PANC-1/DDP中miR-103表達(dá)水平顯著升高，且PANC-1/DDP細(xì)胞中表達(dá)水平高于PANC-1細(xì)胞，提示miR-103與PANC-1細(xì)胞耐藥有關(guān)。然而其具體耐藥機(jī)制尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)敲低miR-103表達(dá)，PANC-1/DDP 細(xì)胞IC50與MDR1顯著低于si-NC組，且細(xì)胞增殖活性降低，凋亡率增加，表明干擾miR-103表達(dá)后，PANC-1細(xì)胞對DDP的敏感性增加。有研究表明[13]，miR-103可通過調(diào)控下游基因的表達(dá)，可增加胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR對阿霉素的敏感性。孫紅文等[14]研究表明，miR-103在肺癌達(dá)沙替尼(DASA)耐藥組織和A549/DASA耐藥細(xì)胞中均高表達(dá)，敲低miR-103表達(dá)，可通過影響其靶向位點PTEN表達(dá)并激活PI3K/AKT信號通路逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對DASA的耐藥。

研究表明USP10在結(jié)腸癌、胃癌中均呈低表達(dá)，與腫瘤耐藥有一定相關(guān)性，USP10 可以通過穩(wěn)定p53來抑制癌細(xì)胞的增殖，在缺乏野生型p53的非小細(xì)胞肺癌中USP10增加提細(xì)胞對DDP的耐藥性[15]。研究表明[16]，USP10可能通過p53依賴途徑參與P21聚集，從而誘發(fā)胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥。有研究表明[17]，miR-103與USP10存在靶向關(guān)系，本研究經(jīng)MiRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測，miR-103與USP10 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點，且雙熒光素酶基因檢測報告顯示，證實miR-103與USP10存在靶向關(guān)系，與Xu等[17]的研究結(jié)果一致，表明miR-103通過靶向調(diào)控USP10表達(dá)，參與PANC-1/DDP的耐藥性。

YAP、TAZ為Hippo 信號通路的關(guān)鍵下游分子，Hippo通路在調(diào)控腫瘤發(fā)生中起著重要作用，YAP、TAZ為同源蛋白質(zhì)，在乳腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)YAP可抑制喉癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)展，可以減弱喉癌細(xì)胞遷移、侵襲能力[18]。YAP、TAZ也與腫瘤耐藥性相關(guān)[19]，占婷等[20]研究表明胰腺癌細(xì)胞中YAP、TAZ蛋白表達(dá)升高，且與胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥有關(guān)，干擾YAP、TAZ表達(dá)后，癌細(xì)胞對吉西他濱的IC50明顯降低。本研究結(jié)果顯示，si-miR-103轉(zhuǎn)染后PANC-1/DDP 細(xì)胞YAP、TAZ表達(dá)水平降低，提示敲除miR-103表達(dá)，可抑制細(xì)胞YAP、TAZ表達(dá)及減少細(xì)胞耐藥性。

另外，本研究試圖進(jìn)一步明確miR-103通過靶向調(diào)控USP10對胰腺癌PANC-1/DDP細(xì)胞DDP耐藥性的作用機(jī)制。本研究敲低USP10后，PANC-1/DDP細(xì)胞YAP、TAZ蛋白表達(dá)顯著降低，表明USP10可影響YAP、TAZ蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞增殖活性顯著增高，表明敲低USP10可促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時敲低USP10與抑制miR-103表達(dá)后，si-USP10組與si-NC組細(xì)胞增殖活性與YAP、TAZ蛋白表達(dá)差異不顯著，證實沉默miR-10通過靶向上調(diào)USP10表達(dá)抑制YAP/TAZ表達(dá)，逆轉(zhuǎn)PANC-1/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性。

綜上所述，干擾miR-103表達(dá)，miR-103可通過靶向上調(diào)USP10并抑制YAP/TAZ表達(dá)，進(jìn)而抑制PANC-1/DDP 細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，從而逆轉(zhuǎn)PANC-1/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：閆紅印負(fù)責(zé)設(shè)計實驗、數(shù)據(jù)采集、分析、論文撰寫；楊柳負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析、對論文的知識性內(nèi)容做審閱；張克正負(fù)責(zé)課題設(shè)計、統(tǒng)計分析。