李正一, 陳永正, 萬南微

(遵義醫(yī)科大學 藥學院 貴州省生物催化與手性藥物合成重點實驗室 貴州省綠色制藥工程研究中心,貴州 遵義 563000)

酰胺鍵的合成是有機化學中最重要的反應之一。酰胺類化合物具有穩(wěn)定性高、極性大等特點,因而被廣泛地應用于各個領域,尤其在醫(yī)藥和精細化學品中扮演著重要的作用,例如丙烯酰胺(1)、煙酰胺(2)、卡巴拉汀(3)、對乙酰氨基酚(4)、β-內酰胺類抗生素(5)、多替拉韋(6)等(Scheme 1)。傳統(tǒng)的化學方法是將羧酸或其衍生物與胺偶聯(lián)形成酰胺類產物,但需要使用有毒或危險試劑以及昂貴的偶聯(lián)試劑,存在安全性、純化操作復雜和原子經濟性不高等問題[1-2]。例如,制備1 kg的抗艾滋病毒藥物Fuzeon需要45 kg的原料,其中并未包括合成和純化步驟中所使用的溶劑[3],原子經濟性差。2007年,美國化學學會綠色化學研究所舉行的制藥圓桌會議明確提出了酰胺鍵綠色高效合成的挑戰(zhàn)和重要意義[4]。生物催化技術反應條件溫和且選擇性較高,為酰胺類化合物的構建提供了一種綠色合成策略,本文概述了應用于合成酰胺類化合物的各類酶促反應的研究進展。

Scheme 1

Scheme 2

Scheme 3

1 腈水合酶

腈水合酶(Nitrile hydratase, NHase),是一類作用于腈類化合物的碳氮三鍵并通過水合反應生成相應酰胺類化合物的酶,被廣泛地應用于綠色高效地生產酰胺類物質。早在1980年,日本京都大學Asano實驗室篩選并重新鑒定出一株菌RhodococcusrhochochrousJ1,首次將含CN基團的有機腈轉化為含CONH2基團的酰胺類化合物的酶命名為腈水合酶[5-6]。其催化的水合反應還能有效地避免副產物羧酸的產生,實現(xiàn)結構上化學、區(qū)域和對映體的選擇性,展現(xiàn)出化學合成法無可比擬的優(yōu)勢[7]。更重要的是,隨著生物信息學、蛋白質工程、宏基因組學等領域的發(fā)展研究,其自身耐受性和穩(wěn)定性方面的缺陷正逐漸得到改善。經研究發(fā)現(xiàn),腈水合酶的催化反應機制是在該酶作用下使腈類化合物轉化為酰胺類化合物,如若有酰胺酶(Amidase)的存在,則再催化酰胺最終生成有機酸(Scheme 2a)[8]。繼上海市農藥研究所微生物法丙烯酰胺生產技術研發(fā)成功之后,生物法煙酰胺工業(yè)化技術也隨之發(fā)展起來,能使酶活力高達1000萬單位/毫升發(fā)酵液(Scheme 2b)[9]。

值得引起關注的是腈水合酶應用于治療癲癇的活性成分——左乙拉西坦的綠色合成。據(jù)專利報道[10],利用半理性設計的腈水合酶突變體能催化得到收率43%的產物,且副產物R-型異構體可以回收利用,但總體產率較低(Scheme 3a)。最近Arndt等[11]開發(fā)了一種新的左乙拉西坦的動態(tài)動力學拆分和釕催化的細胞外陽極氧化合成方法,產率提升至76%,ee值超過99%(Scheme 3b)。

依賴ATP的酶包含很多,例如ATP抓取酶(ATP-grasp)、酰胺鍵合成酶(ABS)、?；o酶A合成酶(ACS)、N-?；D移酶(NAT)以及氨?；鵷RNA合成酶(aaRS)等。而CapW和CapS是例外,在不依賴 ATP的條件下,CapW可以利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基化提供一個甲酯,隨后通過CapS連接甲酯和胺前體獲得酰胺類化合物(Scheme 4)[12]。

Scheme 4

Scheme 5

Scheme 6

Scheme 7

2.1 酰胺鍵合成酶

酰胺鍵合成酶(Amide bond synthase, ABS)由于其相對簡單的、單一的、獨立的特點而成為合成應用中較為通用的酶[13]。McbA是β-咔啉類生物堿Marinacarbolines(MCBs)生物合成途徑中一種重要的酰胺鍵合成酶[14],能夠利用ATP作為輔助因子,并表現(xiàn)出廣泛的底物普適性,不僅可以接受苯甲酸、惰性羧酸、喹啉和苯并呋喃等不同的羧酸底物,還能接受不同的胺供體形成一系列酰胺類產物[15]。2014年,Ju等[14]利用McbA酶作為一種溫和、高效且環(huán)保的生物催化劑,生成10種新的酰胺類化合物,產率高達93%,展現(xiàn)出其廣泛的底物靈活性(Scheme 5)。

2.2 泛酸合成酶

來自大腸桿菌的泛酸合成酶(Pantothenate synthase, PSE.coli)是一類結合三磷酸腺苷(ATP)催化羧酸和胺形成酰胺的連接酶。該酶可以催化(R)-泛解酸和β-丙氨酸的縮合反應生成輔酶A的前體物質——(R)-泛酸(維生素B5)[16]。2021年,Poelarends等[17]研究發(fā)現(xiàn)PSE.coli除了能夠催化β-丙氨酸外,還能接受各種不同結構的胺,具有較廣泛的底物譜,可以得到轉化率高達99%以上的酰胺類化合物(Scheme 6)。

2.3 冠狀酸連接酶

2021年,Jason等[18]發(fā)現(xiàn)冠狀酸連接酶(Coronafacic acid ligase, CfaL)可以催化茉莉酸與異亮氨酸反應,生成植物激素茉莉酸-L-異亮氨酸(JA-Ile),且進一步證明了該酶可以接受不同的羧酸底物(脂肪族羧酸與一些手性化合物等)和氨基酸底物來合成不同的酰胺(Scheme 7),轉化率高達99%,并通過與改進的ATP再生技術相結合等方法,提高了酶的活性以及穩(wěn)定性。

Scheme 8

Scheme 9

Scheme 10

Scheme 11

2.4 3-異氰丁酸腺苷化酶

3-異氰丁酸腺苷化酶(AMP-ligase, SfaB)是二異腈天然產物SF2768生物合成基因簇(sfa)中的一種獨立的腺苷酸形成酶,能利用腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)激活羧酸底物進行胺偶聯(lián)。2020年,He等[19]重新利用SfaB通過酶促反應和自發(fā)親核進攻實現(xiàn)酰胺化或硫酯化,從而提供了一種新的酶學方法用以制備相應的酰胺和硫酯(Scheme 8)。

3 脂肪酶

3.1 南極假絲酵母脂肪酶

南極假絲酵母脂肪酶(Candida antarctica lipase, CAL)分為A型和B型[20],而CAL-B被認為是一種比CAL-A具有更多功能的生物催化劑,能夠接受大范圍的底物,并且在一些反應中表現(xiàn)出了更好的選擇性[21-23]。因此,CAL-B作為許多底物的首選酶,目前已被廣泛地應用于合成α-羥基酰胺、脂肪酰胺、生物聚合物等。2006年,Baldessari等[24]描述了一種由CAL催化制備N-羥基烷基丙烯酰胺的方法。該方法在CAL-B和CAL-A催化下,通過烷醇胺與丙烯酸乙酯的氨基水解反應合成N-羥烷基丙烯酰胺。當使用CAL-B時,底物轉化率高(Conv.=89%～96%),但使用CAL-A時僅以低轉化率(Conv.=7%)獲得酰胺N-(2-羥乙基)丙烯酰胺(Scheme 9)。

Scheme 12

Scheme 13

Scheme 14

Scheme 15

3.2 柱狀假絲酵母脂肪酶

柱狀假絲酵母脂肪酶(Candida cylindracea lipase, CCL)可以催化水解、醇解和酯化等多種反應,還被廣泛應用于生物傳感器、生物材料和生物識別等領域中。1985年,Gotor等[25]提供了一種獲得丙炔酰胺的簡便方法(Scheme 10)。該方法指出丙酸乙酯與胺反應可以得到相應的加成產物,而有趣的是,在CCL作用下,丙酸乙酯還可以與芳香胺反應形成酰胺。

3.3 豬胰脂肪酶

豬胰腺脂肪酶(Porcine pancreas lipase, PPL)與其他脂肪酶相比更便宜,且對非天然底物的生物轉化具有高穩(wěn)定性和較好的特異性[26]。它可以通過對映選擇性水解,分解外消旋醇和羧酸為相應的酯來合成重要中間體[27-29],因此在精細化學品和商品的生產中應用越來越廣泛。Abell等[30]以叔戊醇為溶劑,利用PPL催化底物異丙基氨基酸酯的環(huán)化反應,生成轉化率高達80%的內酰胺(Scheme 11)。

3.4 洋蔥假單胞菌脂肪酶

洋蔥假單胞菌脂肪酶(Pseudomonas cepacia lipase, PCL)因具有很強的酯交換能力和高對映體選擇性而被廣泛應用于諸多領域。Adamczyk等[31]認為脂肪酶介導的芐基酯向酰胺的轉化具有重要的實際意義,并發(fā)現(xiàn)了從洋蔥假單胞菌中分離的PS-30是一種能介導芐基酯向酰胺轉化的酶,且該酶在7 d內實現(xiàn)了較好的轉化率(Scheme 12)。

3.5 淀粉假單胞菌脂肪酶

Pelt等[32]已經證明了淀粉假單胞菌脂肪酶(Pseudomonas stutzeri lipase, PSL)是一種有用的氨基分解催化劑,具有相對廣泛的底物范圍(Scheme 13)。且PSL在各種甲酯和胺的氨基分解反應中的催化能力優(yōu)于Novozym?435(固定化的CAL-B, NOV435)。

3.6 鞘氨醇單胞菌脂肪酶

研究發(fā)現(xiàn),鞘氨醇單胞菌脂肪酶(Sphingomonas paucimobilis lipase, SpL)來自鞘氨醇單胞菌HXN-200,是第一個可以催化酯或酸的氨基分解反應產生酰胺的胞內酶。它能直接從酸中高效合成酰胺,而不需要制備酯作為底物。此外,SpL具有較廣的底物范圍,能夠接受相對較大的底物進行氨基解反應得到相應高產量的酰胺。還可以催化外消旋酯或外消旋胺的高對映選擇性反應,為高ee值條件下合成手性酰胺提供了一種新的方法(Scheme 14)[33]。

Scheme 16

Scheme 17

Scheme 18

鹵醇脫鹵酶也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶(Halohydrin dehalogenases, HHDHs),能夠可逆地作用于鄰羥基鹵化物,從而形成環(huán)氧化物及其開環(huán)產物。2008 年,Janssen課題組[34]在鹵醇脫鹵酶HheC的催化作用下,利用親核試劑氰酸鈉對環(huán)氧化物進行β-位開環(huán),產生的β-取代醇進一步自發(fā)環(huán)化,實現(xiàn)了手性5-取代噁唑烷酮的合成(Scheme 15)。

2019年,本課題組探究了在親核試劑NaOCN作用下,利用HheG催化消旋環(huán)氧苯乙烷的α-開環(huán)反應,得到了4-芳基噁唑烷酮類化合物,并首次實現(xiàn)了通過酶催化環(huán)氧化物合成4-芳基噁唑烷酮,但該方法ee值較低(ee最高52%)(Scheme 16a)[35]。隨后在2020年,本課題組發(fā)現(xiàn)當HheC作為催化劑催化環(huán)氧苯乙烷對映和區(qū)域選擇性β-開環(huán)反應時,能得到手性的5-芳基噁唑烷酮類化合物,產率高達到47%,ee值高達到90%。該方法開發(fā)了一種溫和、綠色的合成手性噁唑烷酮類化合物的途徑(Scheme 16b)[36]。同年,本課題組通過篩選獲得可分別催化2-異丙基環(huán)氧乙烷不對稱開環(huán)反應的生物催化劑HheG和HheA10,并以超過99%ee值合成立體選擇性互補的手性5-異丙基-2-噁唑烷酮(Scheme 16c)[37]。

2021年,本課題組進一步以廉價的烯烴和氰酸鹽作為原料,將苯乙烯單加氧酶和鹵醇脫鹵酶相結合,開發(fā)了一種用于烯烴不對稱氨基羥基化的一鍋法生物催化級聯(lián)反應,該雙酶級聯(lián)SMO-HheG反應兼容性好,能使不同烯烴轉化為具有良好立體和區(qū)域選擇性的對映體噁唑烷酮,產率37%～70%,ee值94%～>99%,區(qū)域選擇性94%～>99%。此外,通過該生物催化級聯(lián)方法可以制備出含有兩個手性中心的4,5-二取代噁唑烷酮(Scheme 17)[38]。

5 其他酶

5.1 P450酶

細胞色素P450 (Cytochrome P450, CYP450)屬于單加氧酶,是一類擁有多種催化功能的酶,可以實現(xiàn)不同底物的羥基化、氨基化等。2015年,Fasan等[39]利用P450BM3的突變體P411BM3有效地催化碳酸鹽疊氮化物的環(huán)化反應,并成功合成4-取代噁唑烷酮(Scheme 18)。

Scheme 19

Scheme 20

Scheme 21

5.2 ?；D移酶

酰基轉移酶(Acyl transferase, AT)能催化?；D移形成酯或酰胺[40-41],而其中需要依賴復雜且昂貴的酰基供體,如?；o酶A硫酯等。自1993年以來,水解酶混雜?；D移酶被發(fā)現(xiàn)[42],它可以作為一種理想的生物催化劑應用于水酶級聯(lián)反應中,特別是對于幾乎不溶于有機溶劑的親水底物的?；磻?/p>

2007年,Richard等[43]從恥垢分枝桿菌(Mycolicibacteriumsmegmatis)中分離出一種新型的?；D移酶MsAcT,并進一步證明了該酶可以催化醇解反應。2016年,Berglund等[44]利用MsAcT與來自硅酸桿菌(Silicibacterpomeroyi)的胺轉氨酶(Sp-ATA)開發(fā)了一種高效的“一步一鍋”級聯(lián)反應形成酰胺,并得到轉化率高達97%的N-芐基-2-甲氧基乙酰胺(Scheme 19a),再次證明了水解酶混雜?；D移酶在級聯(lián)反應中的潛力。2018年,Paradisi等[45]證明了MsAcT具有非常廣的底物范圍,能接受不同的胺和?；w在水中制備N-乙酰衍生物。其中醋酸乙烯基是最好的供體,在反應20 min后得到具有較好產率(85%～99%)的酰胺類化合物(Scheme 19b)。

5.3 青霉素?；?/h3>

青霉素?；?Penicillin acylase, PA)又稱為青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶[46],根據(jù)其底物特異性不同可以分為:青霉素G?；?、青霉素V酰化酶和氨芐西林酰化酶。1960年,Kaufman和Bauer首次證實了青霉素?；缸鳛樯锎呋瘎┰诤铣煞矫娴膽?Scheme 20)[47]。從那以后,該酶主要用于工業(yè)上制備6-氨基青霉酸和半合成β-內酰胺類抗生素[48]。

5.4 環(huán)狀假單胞菌

2016年,本課題組[49]證實了環(huán)狀假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)ZMU-T04作為生物催化劑可以對1,2,3,4-四氫喹啉進行對映選擇性芐位C—H鍵氧化。研究發(fā)現(xiàn),芐基羥基化過程不僅產生了主要的(R)-1,2,3,4-四氫喹啉-2-醇,而且還產生了少量的3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮(Scheme 21a)?；谶@一發(fā)現(xiàn),本課題組實現(xiàn)了利用ZMU-T04對胺進行α-氧化,并成功制備了內酰胺類化合物。更重要的是,該反應還為抗抑郁藥生物活性分子的合成提供了潛在的應用前景(Scheme 21b)[50]。

許多生物活性分子和藥物都含有酰胺鍵結構,酰胺鍵形成反應是藥物合成過程中重要的反應之一。本文歸納了腈水合酶、ATP依賴型酶、脂肪酶和鹵醇脫鹵酶等生物酶參與的酰胺合成反應。與傳統(tǒng)化學法相比,酶促酰胺合成反應展現(xiàn)出反應條件溫和、處理方式安全、具有化學選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性等優(yōu)點,在酰胺類醫(yī)藥中間體綠色合成方面已有諸多應用。但有些生物催化酰胺合成策略的工業(yè)應用還面臨一些瓶頸,如ATP依賴型酶介導的酰胺合成反應過程需使用昂貴的ATP試劑。隨著對這些酶催化反應特性和酶自身催化性能的深入探究,有望創(chuàng)制出更多高活性和高穩(wěn)定性的生物催化劑,用于結構多樣酰胺類化合物的綠色高效合成。