代冬琴，韓莉蘇，金星辰

(曲靖師范學院 生物資源與食品工程學院，云南 曲靖 655011)

物種多樣性是指動物，植物和微生物種類的豐富性，它們是人類生存和發(fā)展的基礎(chǔ).物種多樣性是生物多樣性的中心，是生物多樣性最主要的結(jié)構(gòu)和功能單位.物種多樣性包括兩個方面：一方面是指一定區(qū)域內(nèi)物種的豐富程度，可稱為區(qū)域物種多樣性；另一方面是指生態(tài)學方面的物種分布的均勻程度，可稱為生態(tài)多樣性或群落多樣性.物種多樣性是衡量一定地區(qū)生物資源豐富程度的一個客觀指標.真菌Fungi是生物界中很大的一個類群，世界上已被描述的真菌約有1萬屬15萬余種[1-6]，真菌學家戴芳瀾教授估計中國大約有4萬種[7].真菌廣泛存在于土壤、空氣、水等環(huán)境條件中，是地球上重要的生物類群之一，與人類的生產(chǎn)和生活息息相關(guān)，真菌作為分解者不僅參與生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)和能量的循環(huán)而且還與動植物形成不同程度的復(fù)雜的共生、寄生等關(guān)系，與人類的關(guān)系十分密切.目前世界范圍內(nèi)已報道的竹生真菌約650種，其中大部分為子囊菌[8-9].

1 研究區(qū)概況

云南省位于我國西南部，屬于中低緯度，是我國自然條件最為復(fù)雜的省區(qū)之一[10].其地形由西北向東南傾斜，西北高，東南低，河流峽谷與山脈相間分布，境內(nèi)海拔差異懸殊，山地縱橫，湖泊眾多.因其處在東南季風和西南季風控制之下，又受西藏高原區(qū)的影響，所以自然地理環(huán)境復(fù)雜多樣，具有內(nèi)陸近海性，邊緣性，過渡性和封閉性的特征[11].云南省的氣候變化受水平、垂直兩個方向上的一致疊加而加倍，兼有寒溫性、溫性、暖溫性、暖熱性和熱性等氣候類型，具低緯氣候、季風氣候、山原氣候的立體氣候特點，全省年平均氣溫4℃～24℃之間，大部分地區(qū)15℃左右.特殊的地理環(huán)境和氣候特點讓云南省成為中國生物多樣性最豐富的省份，具有豐富性、珍貴性和脆弱性的特點[12].云南是我國竹類植物物種最為豐厚的地區(qū)也是亞洲竹子分布中心[13-15]，為竹類真菌的多樣性調(diào)查提供了不可替代的研究背景.

2 研究方法

2.1 樣品采集與分離

根據(jù)云南竹林分布，將采樣地分為滇中、滇南、滇東北、滇西北竹區(qū)，采樣地點包括云南昆明、曲靖、玉溪、普洱、紅河、西雙版納、德宏、昭通、大理、麗江、怒江和迪慶，采樣時間從2017年至2021年，采集被子囊菌感染的竹子樣本或凋落腐爛的枝、竿、葉、葉鞘、花、莖和根等，將采集的樣品放入保鮮袋中帶回實驗室，并對未成熟的子實體進行保濕處理，采用單孢分離或組織分離法對新鮮的樣品進行分離，獲得純培養(yǎng)菌株.

2.2 形態(tài)解剖

用體式顯微境觀察真菌子實體的形狀、顏色和著生方式等，并對子實體宏觀特征進行拍照；使用光學顯微境觀察子囊果、子座的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和顏色，使用梅爾澤試劑(Melzer's reagent)檢測子囊頂端結(jié)構(gòu)(是否含淀粉質(zhì))，棉蘭試劑(Lactophenol cotton blue)觀察子囊壁結(jié)構(gòu)，印度墨水(India ink)測試子囊孢子周圍是否被膠質(zhì)鞘包裹，使用乳酸液制作半永久玻片以備后續(xù)觀察.同時將樣本干燥后制做成標本保存于紙質(zhì)信封.

2.3 DNA提取與測序

采用DNA真菌基因組試劑盒提取菌絲體DNA，部分無法獲得菌株的樣本，先用75%酒精消毒，再用無菌水清洗3次，晾干后，去除子座表皮，取子囊腔內(nèi)子實層體于研缽內(nèi)，加液氮磨成粉.基因組DNA的提取采用OMEGA E.Z.N.A.? Forensic試劑盒.DNA和PCR產(chǎn)物檢測采用1%的西班牙瓊脂糖凝膠電泳法[16].rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、小亞基rDNA(SSU)序列擴增和測序引物分別采用ITS5和ITS4以及NS1和NS4[17]；大亞基rDNA(LSU)序列擴增和測序引物采用LROR和LR5[18]；翻譯延長因子1-α基因(TEF1-alpha)、RNA聚合酶II(RPB2)序列擴增和測序引物分別采用EF1-983F和EF1-2218R[19]以及fRPB2-5f和fRPB2-7cr[20].PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件沿用參考文獻[21].測序工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成.采用BioEdit軟件[22]讀取序列并拼接，得到理想序列.

2.4 物種鑒定與多樣性調(diào)查

采用ITS和LSU序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別進行blast比對，并結(jié)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的分析方法鑒定物種，采用MAFFT軟件[23]對單基因序列排列，并在MEGA6 6.0[24]中拼接ITS和LSU序列，由于SSU，TEF和RPB2基因在GenBank數(shù)據(jù)庫中缺失較多，本研究多基因序列未包含上述基因序列，ITS和LSU多基因組合排列共624條序列(包括外類群AleurodiscusbambusinusHe4261和AgaricusmemnoniusHMAS 0278359)，總長度1 579 bp.采用在線軟件(http://sing.ei.uvigo.es/ALTER/)轉(zhuǎn)換PHYLIP格式，采用Findmodel 選擇最優(yōu)模型，采用最大似然法Maximum-likelihood (ML)通過軟件RAxMLGUI v. 1.0[25-26]進行計算，采用1 000次重復(fù)，得到最優(yōu)系統(tǒng)發(fā)育樹以及支持率.ML樹支持率采用MLBP表示，所得系統(tǒng)發(fā)育樹通過TreeView[27]查看，并使用Adobe Illustrator CS v. 5進行編輯.在Index Fungorum中查詢物種科、目、綱的分類地位并統(tǒng)計分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS和LSU基因組合序列，利用GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的431條竹生真菌序列和本研究所分離的211條菌株序列共計642條，以AleurodiscusbambusinusHe4261和AgaricusmemnoniusHMAS 0278359為外類群，使用RAxML軟件[26]，采用最大似然分析法構(gòu)建的ML樹，建樹模型為GTR+G+I (圖1).研究揭示了竹生子囊菌物種間的親緣關(guān)系，并估算物種間分化時間，確立種的分類地位.結(jié)合GenBank Blast比對結(jié)果，共鑒定標本300份，74個物種隸屬座囊菌綱(Dothideomycetes)、Eurotiomycetes、Leotiomycetes和糞殼菌綱(Sordariomycetes).GenBank數(shù)據(jù)庫中竹生真菌Arthrinium屬和Roussoella屬上傳的物種序列較多.座囊菌綱包括了Astrosphaeriellaceae，Bambusicolaceae，Botryosphaeriaceae，Cladosporiaceae，Didymellaceae，Didymosphaeriaceae，Gloniaceae，Hysteriaceae，Occultibambusaceae，Parabambusicolaceae，Phaeosphaeriaceae，Roussoellaceae，Shiraiaceae，Strigulaceae，Tetraplosphaeriaceae和Tubeufiaceae等科；糞殼菌綱包含了Apiosporaceae，Bionectriaceae，Cephalothecaceae，Cordycipitaceae，Diaporthaceae，Distoseptisporaceae，Glomerellaceae，Hypocreaceae，Hypoxylaceae，Linocarpaceae，Oxydothidaceae，Vamsapriyaceae和Xylariaceae等科.

圖1 基于ITS和LSU基因序列采用最大似然法構(gòu)建的竹生子囊菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 物種鑒定與多樣性分析

本研究共采集樣本300份，鑒定竹生子囊菌74個物種(表1)，其中，分布在滇中、滇南、滇東北、滇西北各生境的物種數(shù)分別為17、24、19、14(圖2)，滇南竹林子囊菌分布的物種數(shù)最多，這可能與滇南屬于熱帶氣候，濕度較大、年溫差較小、雨季降雨量充沛、森林覆蓋面積大有關(guān)，適宜的環(huán)境促進了各類竹子生長，也為竹生真菌提供了良好的生長環(huán)境.滇中和滇東北地區(qū)平均海拔1 500米至1 800米，晝夜有一定溫差，常年較為干旱，該地區(qū)最為常見的物種隸屬節(jié)棱孢屬Arthrinium，該屬既能生長于高濕的滇南也能廣泛寄生或腐生于干旱的滇中和滇東北，節(jié)棱孢屬在世界范圍內(nèi)分布較廣，目前寄主主要為禾本科植物，如竹子和其他草本植物，也有報道該屬可寄生于薔薇科或棕櫚科，甚至在美洲有報道在人體皮膚分離了該屬一物種[21].滇西北屬于高寒區(qū)域，平均海拔達3 000米，該地區(qū)生長的竹類多為植株矮小的箭竹，竹生子囊菌物種多樣性偏低，但其特殊地理條件對竹生藥用菌的形成具有重要意義，目前所發(fā)現(xiàn)的3種野生藥用竹生子囊菌(竹黃ShiraiabambusicolaHenn.、竹紅RubroshiraiabambusaeD.Q. Dai & K.D. Hyde和竹肉球菌EngleromycessinensisM.A. Whalley et al.)均分布于滇西北區(qū)域(麗江、大理、怒江和香格里拉)，該研究對野生藥用菌的開發(fā)提供了基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù).

通過對竹生子囊菌各綱、目、科、屬的多樣性分析，表明云南竹生子囊菌類群主要隸屬糞殼菌綱(Sordariomycetes)占比60.85%和座囊菌綱(Dothideomycetes)占比37.01%，少數(shù)隸屬散囊菌綱(Eurotiomycetes)和錘舌菌綱(Leotiomycetes)(圖2)，物種分布較多的目為Botryosphaeriales、Hypocreales、Pleosporales和Xylariales分別占比3.88%、4.64%、32.95%和42.64%(圖3)，分布較多的科為Apiosporaceae、Bambusicolaceae、Botryosphaeriaceae、Roussoellaceae和Xylariaceae占比分別為36.62%、5.28%、3.52%、13.38%和4.32%(圖4)，分布較多的屬為Arthrinium、Bambusicola和Roussoella占比分別為14.78%、4.93%和7.39%(圖5)，Arthrinium和Botryosphaeriaceae是植物常見病原菌類群，該發(fā)現(xiàn)對竹類植物的病害防控與資源保護具有參考價值.

圖2 云南竹生子囊菌各區(qū)域物種統(tǒng)計(A)和各綱物種占比(B)

圖3 云南竹生子囊菌類群各目物種分布

圖4 云南竹生子囊菌類群各科物種分布

圖5 云南竹生子囊菌類群各屬物種分布

表1 云南竹生真菌鑒定統(tǒng)計表

(續(xù)表)

(續(xù)表)

(續(xù)表)

(續(xù)表)

4 討 論

早期的竹類真菌研究主要集中在日本，大部分以比較形態(tài)學為鑒定依據(jù)，21世紀后在中國香港和泰國等地相繼應(yīng)用分子手段開展了竹生真菌多樣性和分類研究，這使得竹生真菌的命名和物種的分類地位發(fā)生了改變.國內(nèi)外報道的竹生真菌已超過650種[8,21]，其中絕大部分為子囊菌.國內(nèi)已記錄的竹生子囊菌隸屬座囊菌綱Dothideomycetes、散囊菌綱Eurotiomycetes和糞殼菌綱Sordariomycetes，分別包含5目Capnodiales、Dothideales、Myriangiales、Pleosporales、Tubeufiales9科Balladynaceae、Capnodiaceae、Didymellaceae、Didymosphaeriaceae、Leptosphaeriaceae、Myriangiaceae、Phaeosphaeriaceae、Saccotheciaceae、Tubeufiaceae9屬12種普通膠殼炱(ScoriascommunisYamam)、剛竹亞球腔菌(MetasphaeriadenataSyd.)、竹鞘多腔菌(MyriangiumharaeanumTai et Wei)、亞隔孢殼(DidymellamaculosaPenz. et Sacc.)、美形亞隔孢殼(Didymellaeumorpha(Berk. et Curt.) Sacc.)、青籬竹隔孢球殼(DidymosphaeriaarundinariaeEll. et Ev.)、梭隔孢球殼(DidymosphaeriafusisporaPenz.)、疣孢小球腔菌(LeptosphaeriascabrisporaTeng)、慮斑小球腔菌(LeptosphaeriatigrisoidesHara)、竹暗球腔菌(PhaeosphaeriabambusaeMiyake et Hara)、竹生棘點殼(AcanthostigmabambusicolaTeng & S.H. Ou)、孝竹刺炱(BalladynalelebaeYamam.)；1目Chaetothyriales1科Chaetothyriaceae2屬2種小刺盾炱(ChaetothyriumechinulatumYamam)、刺三叉孢炱(Triposporiopsisspinigera(H?hn) Yamam)和6目Amphisphaeriales、Chaetosphaeriales、Hypocreales、Magnaporthales、Phyllachorales、Xylariales13科Amphisphaeriaceae、Apiosoiraceae、Bionectriaceae、Ceratosphaeriaceae、Chaetosphaeriaceae、Clavicipitaceae、Hypocreaceae、Nectriaceae、Niessliaceae、Hyponectriaceae、Phyllachoraceae、Xylariaceae16屬23種梭孢圓孔殼(Amphisphaeriafusispora(Syd.) Teng)、星形圓孔殼(AmphisphaeriastellataPal.)、Chaetosphaeriamacrospora(Kawam) Hara)、剛竹假竹黃(ShiraiellaphyllostachydisHara)、麥角菌(Clavicepspurpurea(Fr.) Tul.)、箬竹叢枝病菌(Epichlo?sasaeHara)、草野彎孢殼(Epichlo?kusanoiP. Henn.)、剛竹類肉座菌(HypocreopsisphyllostachydisMiyake et Hara)、刺竹麗赤殼(Calonectriabambusae(Hara) H?hn.)、美膠孢球殼(ExomassarinulacalosporaTeng)、毛竹喙球殼菌(CeratosphaeriaphyllostachydisS.X. Zhzng)、青籬竹墊座菌(Coccostromaarundinariae(Hara) Teng)、梭孢四胞座殼(Phragmocarpellafusispora(Syd. & P. Syd.) Syd. & P. Syd.)、竹黑痣菌(PhyllachoragracilisSpeg.)、孝順竹黑痣菌(PhyllachoralelebaeSaw.)、蒙塔涅梨假殼(ApiosoiramontagneiSacc.)、竹莖囊孢殼(PhysalosporareinkingianaSacc.)、奇異小花口殼(Anthostomellamirabilis(Berk. et Br.) H?hn.)、亮小花口殼(Anthostomellanitidissima(Dur. et Mont.) Sacc.)、深埋小花口殼(AnthostomellaprofundaSacc.)、白井小花口殼(Anthostomellashiraiana(Miyake et Hara) Hara)、條紋小花口殼(AnthostomellastriolaSacc.)、稈生座堅殼(RoselliniaculmicolaTeng)[8,13]，而云南作為我國竹子種類最為豐富的省份，報道的竹生真菌種類卻十分有限，大量竹生真菌有待進一步被發(fā)現(xiàn).

本研究在云南滇中、滇南、滇東北和滇西北等地區(qū)共采集竹生真菌300份，通過分子研究手段，分離出211條ITS和LSU基因組合片段，共鑒定出74個物種，分屬4綱、18目、29科、40屬.研究中一部分樣本由于與已知分子序列相近度低，無法僅僅通過分子手段鑒定到種，該部分樣本未列出，后續(xù)需進一步增加基因片段進行物種鑒定.由此可見云南竹生真菌多樣性較高，尤其在濕度較大和溫度較高的滇南地區(qū)，物種多樣性較為突出.

此外，本研究發(fā)現(xiàn)云南野生藥用竹生真菌竹黃、竹紅和竹肉球菌均采集于滇西北地區(qū)，竹黃作為我國傳統(tǒng)中藥，是一味非常著名的中藥材，治虛寒胃痛、風濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、跌打損傷、筋骨酸痛等，在我國南方民間具有很長的藥用歷史[28]，其子座內(nèi)含有光明化合物竹紅菌素(Hypocrellin)，該活性物質(zhì)具有較好的開發(fā)前景，如臨床醫(yī)學上利用竹紅菌素研制的軟膏可用于治療陰部白斑.本研究為上述藥用竹生菌的進一步開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ).