郭 星，王乾蕾，王 斌，竇 月，王永鳳

（1. 中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437；2. 廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510530）

《中華人民共和國藥典臨床用藥須知》[1]中介紹：清肝利膽口服液常用于清利肝膽濕熱，尤其對(duì)濕熱蘊(yùn)結(jié)肝膽所致的納呆、脅痛、疲倦、乏力、尿黃、苔膩、脈弦有明顯療效。方中茵陳清利濕熱，利膽退黃，為君藥。山銀花清熱解毒、疏散風(fēng)熱，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、免疫和保肝利膽等功效[2-3]；梔子清熱瀉火；二者助茵陳加強(qiáng)清利肝膽濕熱之效，為臣藥。厚樸行氣化濕；防己利水消腫，能使肝膽濕熱從小便而出，為佐藥。諸藥合用，共奏清利肝膽濕熱之功。有研究表明，清肝利膽口服液發(fā)揮保肝利膽的作用可能與抗炎、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞色素P450代謝和血糖調(diào)節(jié)相關(guān)[4]。

現(xiàn)行版藥典[5]中，清肝利膽口服液的標(biāo)準(zhǔn)僅以梔子苷為指標(biāo)進(jìn)行含量測定，不能全面反映藥品內(nèi)在質(zhì)量。目前國內(nèi)外未見清肝利膽口服液成方中的山銀花和防己專屬有效成分的含量研究。

山銀花含綠原酸等有機(jī)酸、黃酮類、三萜皂苷類等主要活性成分[6]。亦有研究在山銀花中發(fā)現(xiàn)積雪草酸[7]。婁玉霞等[8]建立高效液相色譜法（HPLC）測定7種成分的含量，取得較好結(jié)果。防己中多個(gè)化學(xué)成分能影響痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的凋亡、炎癥、血管新生及尿酸清除過程，可用于治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[9]?，F(xiàn)代研究表明，粉防己堿在抗癌及抗腫瘤方面[10-11]、防己諾林堿在抗癌方面[12]均發(fā)揮一定作用。根據(jù)目前研究，清肝利膽口服液中尚缺防己的特征成分及山銀花中三萜皂苷類特征成分的定量分析和控制。

為精準(zhǔn)考察藥品質(zhì)量，確保療效穩(wěn)定，本文建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLCELSD）測定清肝利膽口服液中臣藥山銀花專屬成分綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙的含量，建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）測定清肝利膽口服液中佐藥防己專屬成分粉防己堿、防己諾林堿的含量，為全面評(píng)價(jià)清肝利膽口服液的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；XS205DU電子分析天平（美國梅特勒-托利多公司）。

1.2 對(duì)照品、樣品及試劑

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)110753-202018，含量96.1 %），灰氈毛忍冬皂苷乙（批號(hào)111814-202005，含量97.2 %），川續(xù)斷皂苷乙（批號(hào)111813-201804，含量96.8 %），粉防己堿（批號(hào)110711-201810，含量99.6 %），防己諾林堿（批號(hào)110793-200605，含量100.0 %），均來自中國食品藥品檢定研究院；清肝利膽口服液5批（規(guī)格10 ml/瓶，廣州香雪）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 山銀花特征成分的HPLC-ELSD色譜條件色譜柱：Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈為流動(dòng)相A，以1 %冰醋酸溶液為流動(dòng)相B，按表1中程序進(jìn)行梯度洗脫。流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃, 漂移管溫度60 ℃，增益2，載氣氮?dú)?，氣體流速2 L/min，進(jìn)樣量10 μl。

表1 關(guān)于山銀花特征成分的流動(dòng)相梯度洗脫表

2.1.2 防己特征成分的HPLC-DAD色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm），以乙腈為流動(dòng)相A，以0.08 %三乙胺水溶液為流動(dòng)相B，按表2中程序進(jìn)行梯度洗脫。流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，紫外檢測波長280nm，進(jìn)樣量10 μl。

表2 關(guān)于防己特征成分的流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取綠原酸對(duì)照品約46.7 mg、灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品約159.6 mg、川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品約20.2 mg，置入250 ml量瓶，加70 %甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1 ml各含179.6，620.7，78.4 μg溶液，作為測定山銀花特征成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

精密稱取粉防己堿對(duì)照品約79.0 mg、防己諾林堿對(duì)照品約105.7 mg，置入100 ml量瓶，加50 %甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1 ml各含786.8，1057.0 μg溶液，作為測定防己特征成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取清肝利膽口服液1 ml，置入20 ml量瓶，加70 %甲醇定容至刻度，搖勻，作為測定山銀花特征成分的供試品溶液。精密量取供試品5 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為測定防己特征成分的供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照清肝利膽口服液的處方比例，制備山銀花陰性樣品和防己陰性樣品。按2.2.2項(xiàng)方法制備相應(yīng)陰性供試品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密量取2.2項(xiàng)下山銀花特征成分相關(guān)的溶液各10 μl，按2.1.1項(xiàng)色譜條件測定，結(jié)果見圖1；精密量取2.2項(xiàng)下防己特征成分相關(guān)的溶液各10 μl，按2.1.2項(xiàng)色譜條件測定，結(jié)果見圖2。在上述色譜條件下，清肝利膽口服液中5個(gè)被測成分均達(dá)到基線分離，與其他成分之間均無明顯干擾。

圖1 山銀花專屬性色譜圖

圖2 防己專屬性色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取山銀花特征成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液2，5，10，15，20，30，50 μl，按2.1.1項(xiàng)色譜條件測定，進(jìn)樣量（g）對(duì)數(shù)X為橫坐標(biāo)、峰面積對(duì)數(shù)Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，見表3。

表3 5個(gè)成分的線性關(guān)系結(jié)果

精密量取防己特征成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用50 %甲醇逐級(jí)稀釋20，100，150，200，400，1000，2000 倍，制成不同濃度的對(duì)照品溶液，按2.1.2項(xiàng)色譜條件測定，進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，見表3。

2.5 精密度試驗(yàn)

吸取山銀花特征成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液和防己特征成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按2.1項(xiàng)色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測得綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、粉防己堿、防己諾林堿的峰面積RSD依次為 0.35 %，0.11 %，0.64 %，0.48 %，0.71 %，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，由不同分析人員，在室溫下，分別于0，2，4，6，8，12，32，82 h，按2.1項(xiàng)色譜條件，測得綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、粉防己堿、防己諾林堿的峰面積RSD依次為2.36 %，1.46 %，2.01 %，0.96 %，1.17 %，表明供試品溶液在82 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批清肝利膽口服液按2.2.2 項(xiàng)方法制備6 份供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測定，綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙平均值分別為2.58，8.26，0.92 mg/ml，粉防己堿、防己諾林堿平均值分別為32.90，121.11 μg/ml，RSD依次為1.66 %，1.50 %，0.43 %，0.69 %，1.88 %，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性較好。

2.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

2.8.1 山銀花特征成分的加標(biāo)回收試驗(yàn) 精密量取6份已知含量的同一批號(hào)清肝利膽口服液，每份0.5 ml，分別置入20 ml量瓶，精密加入對(duì)照品溶液適量，加70 %甲醇定容，搖勻，按2.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表4，表明回收率良好。

表4 3種成分的加樣回收率

2.8.2 防己特征成分的加標(biāo)回收試驗(yàn) 精密量取6份已知含量的同一批號(hào)清肝利膽口服液，每份2.5 ml，分別精密加入對(duì)照品溶液適量，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋定容，搖勻，按2.1.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表5，表明回收率較好。

表5 2種成分的加樣回收率

2.9 樣品含量測定

取清肝利膽口服液樣品，按2.2項(xiàng)方法制備、2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，清肝利膽口服液中5種成分含量測定結(jié)果見表6。

表6 清肝利膽口服液中5種成分的含量

3 討論

在現(xiàn)行清肝利膽口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅以梔子苷為指標(biāo)進(jìn)行定量質(zhì)控，不能全面反映該制劑中多組分共同作用起效的特點(diǎn)，本試驗(yàn)嘗試多種方法研究君藥茵陳的指標(biāo)成分，除薄層鑒別茵陳方法，經(jīng)對(duì)比山銀花陰性樣品和茵陳陰性樣品色譜峰面積發(fā)現(xiàn)，該制劑中茵陳所含綠原酸的量極少，可忽略不計(jì)；采用液相色譜法測定清肝利膽口服液中茵陳指標(biāo)成分的方法有待進(jìn)一步研究。故本研究以清肝利膽口服液處方中臣藥山銀花、佐藥防己的特征成分作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。通過方法學(xué)研究，建立了相應(yīng)成分的含量測定方法。

研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸和三萜皂苷類溶解在70 %甲醇中3 d內(nèi)穩(wěn)定性較好，防己專屬堿類成分溶解在甲醇中2 d內(nèi)穩(wěn)定性較好。

考察水和不同比例的甲醇對(duì)有效成分的提取率，結(jié)果表明，用70 %甲醇提取山銀花特征成分效果較好，用甲醇提取防己特征成分效果較好。

比較了多種品牌各種型號(hào)的C18色譜柱，結(jié)果表明，本文中測定的5種成分基本能在不同的C18色譜柱中分離，但臣藥山銀花特征成分中的三萜皂苷類在Waters SunFire C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）分離效果較好，佐藥防己特征成分在不同品牌的C18色譜柱中分離效果區(qū)別不大。

考察流動(dòng)相中酸和堿的種類和比例，結(jié)果表明，乙腈-1 %冰醋酸水溶液分離山銀花特征成分效果較好，乙腈-0.08 %三乙胺水溶液分離防己特征成分較好，峰形好，出峰快。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中酸堿比例的輕微變化對(duì)特征成分的分離影響不大。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、粉防己堿和防己諾林堿5種成分在不同批次清肝利膽口服液的高效液相色譜圖中均可檢測，表明清肝利膽口服液的制備工藝較為穩(wěn)定。經(jīng)相應(yīng)的方法學(xué)考察，測定了清肝利膽口服液中的生物堿鹽、有機(jī)酸和三萜皂苷類成分，各成分分離效果均符合現(xiàn)行藥典要求，樣品前處理簡單，可為企業(yè)控制該產(chǎn)品質(zhì)量和藥品監(jiān)督抽檢等提供依據(jù)，也可為該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。