石 慧，李春磊，曾展灝，李欣玥，趙瑞琪，朱建華，于榮敏*

（1. 暨南大學 藥學院，廣東 廣州 510632；2. 暨南大學 中藥生物技術(shù)研究所，廣東 廣州 510632）

瓦楞子是傳統(tǒng)中藥，首載于漢代《名醫(yī)別錄》，在歷代經(jīng)典中醫(yī)典籍中皆有收載。中國藥典收載的瓦楞子有3種基源：蚶科動物毛蚶（Arca subcrenataLischke）、泥蚶（Arca granosaLinnaeus）魁蚶（Arca inflataReeve）的貝殼。作為一種常用海洋貝類中藥，瓦楞子具有消痰化瘀、軟堅散結(jié)、制酸止痛之功效[1]。中醫(yī)臨床常用于治療頑痰膠結(jié)、黏稠難咯、癭瘤、瘰疬、癥瘕痞塊、胃痛泛酸等癥。瓦楞子臨床功效確切，應用廣泛，但對其藥效物質(zhì)基礎的研究較少。有研究表明，瓦楞子等貝類中藥富含層狀和柱狀方解石，其主要成分為碳酸鈣[2]?？诜妓徕}具有中和胃酸的治療效果，符合瓦楞子“制酸止痛”的功效和胃痛泛酸的主治癥狀。因此認為瓦楞子的藥效物質(zhì)基礎為碳酸鈣。然而，瓦楞子除制酸止痛外，還具有消痰化瘀、軟堅散結(jié)等其它臨床功效，提示瓦楞子的藥效物質(zhì)基礎包括但不限于碳酸鈣[2-3]?，F(xiàn)有針對瓦楞子的藥效物質(zhì)研究存在較大的局限和空缺，仍有活性成分亟需挖掘。

近年，隨著現(xiàn)代生化技術(shù)、分子生物學技術(shù)和蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)的發(fā)展，從海洋貝殼中發(fā)現(xiàn)了多種具有生物活性的肽和蛋白質(zhì)類成分[4-9]。研究發(fā)現(xiàn)，這些成分與貝類生物自身的生物礦化、免疫應答和環(huán)境適應有密切聯(lián)系。貝殼中的基質(zhì)蛋白可通過促進或抑制方解石和文石的結(jié)晶化以及調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)形態(tài)，參與貝類的生物礦化過程[4]。此外，有報道顯示，為應對微生物侵襲，貝殼中多種蛋白成分過量表達，發(fā)揮抗菌和免疫調(diào)節(jié)作用。目前已從截海螂（Mya truncata）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）和櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的貝殼中發(fā)現(xiàn)了多種具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)等功能的蛋白酶，其在維持貝類自身防御、體液平衡方面發(fā)揮了重要作用[5]。研究人員還通過煎煮和離子交換層析方法從牡蠣貝殼中提取出一種抗氧化寡肽，其對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、超氧陰離子自由基具有較強的清除能力[10]。研究通過對貽貝（Perna viridis）進行蛋白組學鑒定分析，從中發(fā)現(xiàn)其含有378種貝殼基質(zhì)蛋白，聚類分析表明：貝類殼蛋白具有免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，具有潛在的藥用開發(fā)價值[11]。最近，從瓦楞子基源動物毛蚶的貝殼中分離得到2個活性肽AWLNH和PHDL，其能刺激成骨細胞分化，緩解骨質(zhì)疏松[12]。

本研究采用水煎煮和乙酸兩種提取方法從海洋中藥瓦楞子中提取免疫調(diào)節(jié)活性組分；同時在前期構(gòu)建的瓦楞子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基礎上，運用胰蛋白酶酶解和LC-MS/MS技術(shù)對瓦楞子免疫調(diào)節(jié)活性組分中蛋白質(zhì)類成分進行鑒定分析，以明確瓦楞子中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎，為進一步研究和開發(fā)海洋中藥瓦楞子奠定基礎，為其臨床合理應用提供科學資料。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DYY-2C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一生物科技有限公司），DYY-2C型配套垂直電泳槽（北京六一生物科技有限公司），GelDoc XR型凝膠成像儀（美國Bio-Rad生物科技公司），DS-1型高速組織搗碎機（上海精科科學儀器公司），CR21G型冷凍離心機（日本日立有限公司），DF-101S型集熱式磁力攪拌器（鞏義予華儀器公司），F(xiàn)D-1D-50型真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康儀器有限公司），6500TC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本NAPCO公司），SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺（蘇州凈化有限公司），Synergy H4型全功能酶標儀（美國Bio-Tek有限公司），Triple TOF 5600質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystem儀器公司），Eksigent micro-LC 415 System液相色譜系統(tǒng)（美國AB SCIEX公司）。

1.2 材料

實驗樣品中藥飲片瓦楞子（廣東省藥材公司中藥飲片廠），鼠源巨噬細胞RAW264.7（中山大學醫(yī)學院細胞庫）。

Trypsin蛋白酶（美國Promega生物科技公司），一氧化氮檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物科技公司），高pH RP肽段分級試劑盒（美國Thermo Fisher生物科技公司），色譜純乙腈（美國TEDIA高純試劑公司），其余化學試劑購自廣州化學試劑廠，均為分析純。

2 方法

2.1 活性組分WLZP-1和WLZP-2的制備

活性組分WLZP-1的制備：取凈制后的中藥瓦楞子飲片加入等倍體積（w/v）去離子水，沸水浴加熱30 min，收集煎煮后的液體。再次加入等倍體積（w/v）去離子水，繼續(xù)煎煮30 min，收集煎煮后的液體。合并兩次煎煮液，10000 r/min離心20 min，得上清。上清再用去離子水進行透析除鹽（分子量截留值 1 kDa），冷凍干燥后即得WLZP-1組分。

活性組分WLZP-2的制備：取過40目篩瓦楞子粉末加入2倍體積（w/v）去離子水浸泡2 h，去掉去離子水。加入2倍體積（w/v）50 %乙酸4 ℃浸泡過夜，收集液體。再次加入2倍體積（w/v）50 %乙酸4 ℃浸泡過夜，收集液體。與第一次收集液體合并，10000 r/min離心20 min，得上清。所得上清在去離子水中進行透析除鹽（分子量截留值 1 kDa），冷凍干燥后即得WLZP-2組分。

采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，牛血清蛋白為標準品，操作方法參考試劑盒說明書。采用苯酚-硫酸法測定WLZP-1和WLZP-2組分的總糖含量，葡萄糖為標準品。

采用12 %分離膠和4 %濃縮膠對WLZP-1和WLZP-2組分進行還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

2.2 WLZP-1和WLZP-2免疫調(diào)節(jié)活性測定

采用噻唑藍法（MTT法）考察WLZP-1和WLZP-2對RAW264.7巨噬細胞的影響。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞（貼壁細胞需用胰酶消化）用完全培養(yǎng)基吹打成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為3×104個/ml。將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔100 μl，培養(yǎng)板置于37 °C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞貼壁后，將用培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的樣品加入96孔板中，設置5個樣品濃度組，每個濃度設3個平行孔，以不加樣品的培養(yǎng)液孔為陰性對照組。在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液（濃度為5 mg/ml）。在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入100 μl DMSO溶液，室溫放置30 min。酶標儀上以570 nm測吸光度（A）值，以1 μg/ml的脂多糖（LPS）為陽性對照。

生長抑制率計算公式：

將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞懸浮于DMEM培養(yǎng)基中并調(diào)整細胞密度為1 × 105個/ml。將細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μl，每組3個復孔。將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h（37 ℃，5 % CO2）使細胞貼壁。隨后棄去上清，加入一系列梯度濃度的樣品溶液使每組孔中的終濃度分別為0，31.25，62.5，125，250及500 μg/ml）。同時選擇1 μg/ml的LPS溶液作為陽性對照。繼續(xù)將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（37 ℃，5 % CO2）。根據(jù)NO檢測試劑盒操作手冊，測定細胞培養(yǎng)上清中的NO含量。

2.3 WLZP-1和WLZP-2酶解分離及質(zhì)譜檢測

于WLZP-1和WLZP-2組分中分別加入100 μl預冷丙酮溶液，于-20 ℃冷柜過夜沉淀蛋白多肽。蛋白多肽沉淀用含蛋白酶抑制劑的8 mol/L尿素溶解，冰上保溫30 min后離心。之后加入1 mol/L三乙基碳酸氫銨（TEAB）溶液和10 mmol/L三-（2-羧乙基）膦（TCEP）溶液，37 ℃下反應1 h。加入40 mmol/L 碘乙酰胺（iodoacetamide）避光繼續(xù)反應40 min。丙酮沉淀蛋白多肽后，蛋白多肽沉淀加入胰蛋白酶酶解液于37 °C酶解過夜。酶解后的多肽產(chǎn)物用高pH肽段分級試劑盒進行分段，真空離心濃縮后，用質(zhì)譜上樣緩沖液溶解，進行液-質(zhì)聯(lián)用分析。每段餾分經(jīng)Eksigent 3C18-CL-120色譜柱和Eksigent micro-LC 415液相系統(tǒng)進行肽段分離。液相系統(tǒng)設置參數(shù)如下：流動相A為2 %乙腈（含0.1 %甲酸），流動相B為98 %乙腈（含0.1 %甲酸），流速5 μl/min，洗脫梯度為0～1 min，2 %～5 %B；1～65 min，5 %～20 %；65～80 min，20 %～25 %；80～90 min，25 %～80 %。質(zhì)譜設定參數(shù)如下：MS掃描范圍（m/z）350～1250，累積時間0.25 s；MS/MS掃描模式為HS高靈敏度模式，掃描范圍（m/z）100～1500，累積時間0.05 s，IDA采集模式，一個MS1圖譜選擇40個最強的母離子進行串級掃描[14]。

2.4 數(shù)據(jù)分析及蛋白多肽鑒定

基于瓦楞子轉(zhuǎn)錄組測序ORF的蛋白序列庫進行蛋白組分鑒定。使用軟件PEAKS Studio 8進行質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)比對搜庫，搜索參數(shù)：Enzyme Name:Trypsin；Max. Missed Cleavage Sites: 2；Cys alkylation: Iodoacetamide；ynamic Modification:Oxidation (M), Acetyl (Protein N-Terminus)；Precursor Mass Tolorance: 20 ppm；Fragment Mass Tolorance: 0.1 Da；Peptide FDR ≤0.01。利用GO（geneontology）、KEGG（kyoto encyclopedia of genesand genomes orthology）數(shù)據(jù)庫對鑒定的蛋白質(zhì)類成分進行注釋分析。

3 結(jié)果

3.1 活性組分WLZP-1和WLZP-2的電泳表征及免疫調(diào)節(jié)活性

瓦楞子采用水煎煮和乙酸兩種提取方法分別得到WLZP-1和WLZP-2組分，苯酚-硫酸法分析和BCA蛋白定量結(jié)果表明表明WLZP-1和WLZP-2兩組分均不含糖，蛋白多肽含量分別為60 %和19.03 %。

SDS-PAGE分析結(jié)果見圖1。WLZP-1組分條帶彌散分布且條帶顏色淺，提示該組分中蛋白質(zhì)類成分種類多，且各蛋白質(zhì)類成分豐度低；WLZP-2組分在35 kDa處有明顯條帶，說明此分子量蛋白豐度較高；此外有多個彌散條帶，說明該組分成分復雜。因WLZP-1和WLZP-2組分蛋白質(zhì)類成分復雜，難以使用分離技術(shù)獲得全部蛋白多肽化合物，本研究運用蛋白組學聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)分析瓦楞子活性組分中蛋白質(zhì)多肽成分。

圖1 WLZP-1和WLZP-2組分的SDS-PAGE圖

利用鼠源巨噬細胞RAW264.7細胞進行免疫調(diào)節(jié)活性測試，結(jié)果見圖2。WLZP-1和WLZP-2組分對RAW264.7細胞無明顯毒性。WLZP-1和WLZP-2組分均能明顯促進RAW264.7細胞分泌NO，具有較好的體外免疫增強活性。此外，WLZP-1組分促進NO釋放活性強于WLZP-2組分，提示W(wǎng)LZP-1組分的蛋白多肽成分可能與WLZP-2組分不同，特異性存在于WLZP-1組分中的蛋白多肽成分體外免疫增強活性可能更優(yōu)。

圖2 WLZP-1和WLZP-2組分免疫調(diào)節(jié)活性

3.2 蛋白質(zhì)類成分的質(zhì)譜鑒定

運用胰酶酶解和LC-MS/MS對WLZP-1和WLZP-2組分中蛋白質(zhì)類成分進行鑒定，分別得到26583和15613個質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)。將瓦楞子蛋白預測庫模擬胰酶酶切，將所得肽段構(gòu)建標準質(zhì)譜圖譜，運用PEAKS Studio 8軟件將實測質(zhì)譜圖譜與標準圖譜比對。在假發(fā)現(xiàn)率FDR≤1 %時，WLZP-1組分比對得到圖譜3890個，鑒定特征肽段2380個，最終鑒定得到276個蛋白質(zhì)類成分；WLZP-2組分比對得到圖譜2460個，鑒定特征肽段2040個，最終鑒定得到175個蛋白質(zhì)類成分（表1）。通過Venn圖分析（圖3），WLZP-1和WLZP-2活性組分中僅有17個相同蛋白質(zhì)類成分。將上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對，結(jié)果見表2。這17種蛋白質(zhì)包括類Actin蛋白、類β-Actin蛋白、類dynactin蛋白、CYP4B1、類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3蛋白、類煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶、類組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白、類胱硫醚β裂解酶、CEP290、類titin X1亞型和沒有特征性的新蛋白。將鑒定得到的蛋白質(zhì)類成分進行GO和KEGG注釋分析。GO注釋有助于了解蛋白質(zhì)類成分所代表的生物學意義，利用GO數(shù)據(jù)庫，將鑒定得到的蛋白多肽按照其細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function, MF）和參與的生物過程（biological process, BP）進行分類注釋。結(jié)果見表1、圖4和圖5。WLZP-1和WLZP-2組分中蛋白質(zhì)類成分分別包含有BP、CC和MF等3類。

圖3 WLZP-1和WLZP-2蛋白多肽成分Venn圖

表1 WLZP-1和WLZP-2組分搜庫結(jié)果及GO注釋分析列表/個

圖4 WLZP-1蛋白多肽成分GO注釋二級分類統(tǒng)計圖

圖5 WLZP-2蛋白多肽成分GO注釋二級分類統(tǒng)計圖

表2 WLZP-1和WLZP-2組分共有蛋白的氨基酸序列和注釋

表2（續(xù)）

通過KEGG注釋分析發(fā)現(xiàn)，WLZP-1組分有8個蛋白質(zhì)類成分能參與人源免疫系統(tǒng)，有18個蛋白質(zhì)類成分具有信號傳導功能，進而通過信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮調(diào)節(jié)人體免疫的作用（圖6）。WLZP-2組分中有7個蛋白質(zhì)類成分能參與人源免疫系統(tǒng)，另有15個蛋白質(zhì)類成分具有信號傳導功能（圖7）。這可能是WLZP-1和WLZP-2活性組分發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎。

圖6 WLZP-1蛋白多肽成分KEGG注釋統(tǒng)計圖

圖7 WLZP-2蛋白多肽成分KEGG注釋統(tǒng)計圖

4 討論

近年，隨著對貝殼來源蛋白質(zhì)類成分研究的不斷深入，越來越多的貝殼活性蛋白質(zhì)類成分被發(fā)現(xiàn)并報道。此類發(fā)現(xiàn)為研究海洋貝類中藥藥效物質(zhì)基礎提供了一個全新角度。海洋中藥瓦楞子是雙殼綱蚶科貝類的貝殼，在中醫(yī)臨床應用廣泛。然而，其活性物質(zhì)相關的研究鮮有報道，這在一定程度上限制了瓦楞子的臨床合理使用和深入研究開發(fā)。

本研究使用不同提取方法分別獲得了水溶性蛋白質(zhì)類組分WLZP-1和酸溶性蛋白質(zhì)類組分WLZP-2。從WLZP-1組分中鑒定得到276個蛋白質(zhì)類成分，在WLZP-2組分中鑒定得到175個蛋白質(zhì)類成分。然而，WLZP-1和WLZP-2的電泳圖譜顯示，相同上樣量時，WLZP-1組分蛋白多肽條帶淺、少且彌散，WLZP-2組分蛋白條帶豐富且明顯。上述結(jié)果提示，WLZP-1組分中各蛋白質(zhì)類成分豐度低，而WLZP-2組分中的蛋白成分大多數(shù)為高豐度蛋白。因此，我們推測，瓦楞子中酸溶性蛋白多肽（堿性蛋白多肽）成分多為高豐度蛋白多肽，而水溶性蛋白多肽（中性蛋白多肽）為低豐度蛋白多肽。

在瓦楞子體外免疫活性實驗中，我們發(fā)現(xiàn)WLZP-1和WLZP-2活性組分對小鼠RAW264.7巨噬細胞均無明顯的細胞毒性，并可顯著刺激RAW264.7細胞分泌促炎因子NO，發(fā)揮免疫增強作用，其中WLZP-1組分的活性優(yōu)于WLZP-2。此結(jié)果表明，相比于酸溶性蛋白多肽，瓦楞子中水溶性蛋白多肽成分可能為其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的物質(zhì)基礎。我們進一步使用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對瓦楞子活性蛋白質(zhì)類成分進行了功能注釋分析。WLZP-1和WLZP-2活性組分中均包含具有生物過程、細胞組分和分子功能的蛋白質(zhì)類成分。此外，WLZP-1和WLZP-2活性組分均含有多種與人源免疫系統(tǒng)及信號傳導途徑相關的蛋白質(zhì)類成分，這些成分也有助于瓦楞子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

不同物種的貝殼蛋白質(zhì)類成分發(fā)揮不同的生物活性[14]。目前人們對海洋貝殼來源蛋白質(zhì)類成分及其生物活性了解甚少，限制了海洋貝類生物資源的研究開發(fā)和利用，同時也制約了海洋貝類中藥的守正創(chuàng)新。因此，加強貝殼來源蛋白質(zhì)類成分的鑒定將為海洋貝類中藥的合理應用和深入開發(fā)提供新的思路和化學結(jié)構(gòu)，為海洋中藥綜合利用開拓新的方向。本研究結(jié)果為進一步挖掘瓦楞子藥效物質(zhì)提供了科學依據(jù)，為探索其免疫調(diào)節(jié)活性物質(zhì)基礎指引了方向，同時也為海洋貝類中藥藥效物質(zhì)基礎研究提供了參考資料。