武彥昭， 張?zhí)m， 武子笑， 單菊彤， 時(shí)萍， 劉妍， 楊菲， 熊晨

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院耳鼻咽喉及頭頸外科，河北石家莊 050011；2.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；3.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，河北石家莊 050017）

蒽環(huán)類藥物阿霉素（doxorubicin，DOX）是臨床常用的抗惡性腫瘤的藥物，具有抗瘤譜廣、抗瘤活性強(qiáng)的特點(diǎn)，常被用來(lái)治療急性白血病、淋巴瘤、骨腫瘤、乳腺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤[1]。然而，DOX 在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)，由于其對(duì)心肌組織的親和力明顯高于其他組織，使DOX 容易蓄積于心肌細(xì)胞中，對(duì)心肌產(chǎn)生毒副作用，最終導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病和充血性心力衰竭，故限制了其在臨床上的應(yīng)用[2-4]。因此，迫切需要既預(yù)防DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性，又不能以降低其抗腫瘤作用為代價(jià)的有效藥物。

引起DOX 心臟毒性的病理生理機(jī)制是多方面的，其中，越來(lái)越多的證據(jù)表明，過(guò)量產(chǎn)生的活性氧簇（ROS）和氧化劑誘導(dǎo)的線粒體損傷是DOX心臟毒性作用的重要因素[2，5]。因此，使用抗氧化劑是保護(hù)心肌細(xì)胞免受DOX 誘導(dǎo)氧化損傷和心臟毒性的重要策略。盡管從理論上講，針對(duì)氧化應(yīng)激是合乎邏輯的，但當(dāng)前大多數(shù)策略均無(wú)法取得滿意的心肌保護(hù)效果[6-7]。這些研究結(jié)果提示其他機(jī)制可能涉及DOX 引起的心臟毒性。顯然，DOX的心臟毒性并非歸因于單一靶標(biāo)，而是涉及多條蛋白信號(hào)途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，p66Shc 在DOX 引起的心肌細(xì)胞毒性機(jī)制中扮演著重要的角色[8]，但其基本機(jī)制尚未完全闡明。p66Shc 是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵介質(zhì)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激生成過(guò)量ROS，參與促進(jìn)線粒體氧化應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，p66Shc 基因敲除嚙齒動(dòng)物的壽命大約延長(zhǎng)30%，且對(duì)氧化應(yīng)激和氧化應(yīng)激依賴性病理有顯著的抵抗力[11-13]。亦有研究表明，在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性中，p66Shc 的表達(dá)明顯上調(diào)[9，14]。故選擇性抑制p66Shc 通路是一種很有前途的對(duì)抗DOX 心臟毒性的方法。迄今為止，尚無(wú)p66Shc 蛋白的特異性藥物抑制劑。沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1（SIRT1）是一種氧化應(yīng)激負(fù)調(diào)節(jié)因子，其功能與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的Ⅲ類組蛋白脫乙酰化酶（HDAC）相同[15-16]。已有研究表明，p66Shc 確是SIRT1 的靶標(biāo)，其表達(dá)可以通過(guò)SIRT1 上調(diào)至少部分減少[17-18]，而SIRT1 基因的敲除增強(qiáng)了p66Shc的表達(dá)[19]。基于此，我們認(rèn)為SIRT1介導(dǎo)的p66Shc 抑制可能參與了DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性，但SIRT1/p66Shc 通路的確切作用仍然存在爭(zhēng)議。

小檗堿（berberine，Ber）是一種異喹啉類生物堿，為中藥黃連的主要成分，現(xiàn)被作為廣譜抗菌素用于胃腸炎、細(xì)菌性痢疾等疾病的治療。越來(lái)越多的臨床試驗(yàn)研究表明，Ber對(duì)代謝癥候群和心血管疾病具有很好的治療作用[20-22]。研究發(fā)現(xiàn)，Ber 還有抗腫瘤和心臟保護(hù)的作用[23-24]。DOX 聯(lián)合Ber應(yīng)用不僅可增強(qiáng)DOX抗腫瘤作用[25]，還可降低DOX引起的急性心肌損傷[26]，但Ber保護(hù)心肌的確切機(jī)制目前仍不清楚。值得關(guān)注的是，研究報(bào)道Ber 可能通過(guò)激活SIRT1 信號(hào)通路在各種病理?xiàng)l件下產(chǎn)生保護(hù)作用[27-28]。然而，SIRT1 信號(hào)通路是否參與Ber在DOX誘導(dǎo)的心功能障礙中的保護(hù)作用及其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究構(gòu)建DOX 損傷AC16 心肌細(xì)胞模型，重點(diǎn)探討B(tài)er 能否通過(guò)抗氧化作用及線粒體保護(hù)作用從而保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗DOX 心肌毒性，明確SIRT1/p66Shc 通路是否參與DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性，明確Ber的保護(hù)作用是否主要與SITT1/p66Shc 通路的調(diào)節(jié)有關(guān)，以期為深入闡明Ber 的心肌保護(hù)作用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器小檗堿、阿霉素（美國(guó)Sigma Aldrich 公司）。p66Shc、β-actin 和SIRT1 等抗體（美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司）；錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）及Bax 抗體（美國(guó)Abcam 公司）；熒光染料Rh123、Rhod 2-AM 和EX527（美國(guó)Sigma Aldrich 公司）；其他化工產(chǎn)品購(gòu)自天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。SpectraMax 190 微量滴定讀板器（美國(guó)Molecular Device 公司）；Lasersharp MRA2 激光共聚焦顯微鏡（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞來(lái)源、培養(yǎng)與處理方法人心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院（上海）。以DMEM 培養(yǎng)基（加入1.5 g/L碳酸氫鈉、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），在37 ℃、5%CO2的加濕環(huán)境中培養(yǎng)。取80%融合生長(zhǎng)、狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AC16 細(xì)胞，用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，以5 × 104個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于96 孔板中，每孔接種100 μL。預(yù)處理按如下步驟實(shí)施：①DOX對(duì)AC16 細(xì)胞的毒性作用：先用PBS 清洗2 次，換用無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基，并加入不同濃度的DOX（0.1、0.5、1、5、10 μmol/L）作用24 h。②觀察不同濃度Ber 對(duì)DOX 損傷心肌作用的影響：采用0.1、1、10 μmol/L 濃度的Ber處理AC16細(xì)胞24 h，再用1 μmol/L 的DOX 處理24 h，建立細(xì)胞損傷模型。③觀察應(yīng)用EX527預(yù)處理1 h對(duì)DOX損傷心肌作用的影響：在Ber 處理前1 h，用10 μmol/L EX527（SIRT 抑制劑）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，接著給予1 μmol/L DOX 作用24 h。對(duì)照組加入相同體積的相應(yīng)溶劑。

1.3 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測(cè)定細(xì)胞活力將細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合后，按照上述“1.2”項(xiàng)進(jìn)行分組處理。處理后，每孔加入10 μL MTT染料（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后將培養(yǎng)基丟棄，將150 μL二甲基亞砜（DMSO）加入到各孔中，搖床震蕩15 min。待結(jié)晶物充分溶解后，使用微量滴定讀板器于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（OD值）?？瞻讓?duì)照組的細(xì)胞存活率視作100%，給藥處理組的細(xì)胞存活率=給藥處理組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期80%～90%融合生成狀態(tài)良好的AC16 細(xì)胞消化后配制成細(xì)胞懸液，點(diǎn)在圓形蓋玻片上，每孔接種100 μL，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下孵育4 h 后，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，孵育過(guò)夜。加入1 μmol/L Ber處理30 min后分別加入1 μmol/L DOX和10 μmol/L EX527進(jìn)行分組：對(duì)照組、DOX 組、Ber+DOX 組、Ber+DOX+EX527 組。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用PBS 清洗2 次，將ROS 特異性熒光探針二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）稀釋成1 μmol/L，染色30 min，激光共聚焦顯微鏡FITC 模式下檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1. 5蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)細(xì)胞p66Shc、SIRT1、Mn-SOD、Bax的蛋白表達(dá)各實(shí)驗(yàn)組AC16細(xì)胞給予不同的處理因素后，先用預(yù)冷的PBS 洗2 遍，裂解取上清，采用二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量。從每個(gè)樣品中分離出等量的蛋白質(zhì)（50 μg），經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂奶粉（50 mm Tris-HCl，150 mm NaCl，0.1% Tween，pH 7.4）室溫封閉1 h 后，分別加入p66Shc 抗體（1∶200 稀釋）、SIRT1 抗體（1∶200 稀釋），Mn-SOD 抗體（1∶1 000稀釋）及Bax 抗體（1∶1 000 稀釋），4 ℃過(guò)夜，采用TBST 洗3 次，10 min/次。然后加入相應(yīng)二抗（1∶2 000 稀釋），37 ℃孵育1 h，TBST 洗3 次，10 min/次。將PVDF 膜用電化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，暗室曝光到X 線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.6 線粒體膜電位（MMP）及線粒體內(nèi)鈣（[Ca2+]m）的測(cè)定當(dāng)AC16細(xì)胞生長(zhǎng)到約80%融合時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要給予不同的條件培養(yǎng)基。用DOX和Ber處理結(jié)束后，用PBS 洗2 次，在含有100 μg/L Rh123的無(wú)血清培養(yǎng)基中37 ℃孵育30 min。Rh123 是一種親脂性陽(yáng)離子熒光染料，對(duì)細(xì)胞膜具有通透性，可選擇性地富集在線粒體上。細(xì)胞處于存活狀態(tài)時(shí)，Rh123通過(guò)細(xì)胞膜，積聚于線粒體發(fā)出綠色熒光。在細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，電負(fù)性降低，細(xì)胞線粒體積聚Rh123 的能力也喪失，熒光強(qiáng)度降低[8]。據(jù)此可檢測(cè)MMP的變化以反映細(xì)胞的凋亡情況。激光共聚焦顯微鏡FITC模式下檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，通過(guò)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

用熒光染料Rhod 2-AM（分子探針）測(cè)定線粒體Ca2+濃度（[Ca2+]m）。將AC16 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有10 μmol/L Rhod-2 AM 的1 mL 新鮮DMEM 中，于4 ℃培養(yǎng)120 min，然后于37 ℃培養(yǎng)30 min。然后，將Rhod-2 AM 負(fù)載細(xì)胞置于共焦顯微鏡臺(tái)上，通過(guò)510 nm 和570 nm 帶通勢(shì)壘濾光片對(duì)[Ca2+]m進(jìn)行熒光分析，最后選擇10 000 個(gè)細(xì)胞的中位熒光強(qiáng)度計(jì)算[Ca2+]m。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，獨(dú)立樣本和2 組數(shù)據(jù)間的比較均采用雙側(cè)t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ber對(duì)DOX降低心肌細(xì)胞存活率的影響為了檢測(cè)不同濃度DOX和Ber處理后的細(xì)胞活性，采用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率。AC16細(xì)胞暴露于不同濃度（0.1、0.5、1、5、10 μmol/L）的DOX 12、24、48 h 后，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間及濃度的增加，細(xì)胞存活率顯著下降，至24 h 作用更為明顯，一直持續(xù)到48 h。具體結(jié)果見表1。結(jié)果表明，DOX對(duì)AC16細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。由于在24 h時(shí)DOX對(duì)AC16細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，考慮細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響，本研究將給藥時(shí)間確定為24 h。進(jìn)一步檢測(cè)DOX 孵育24 h 使AC16 細(xì)胞存活率下降50%的濃度為1.07 μmol/L，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均用1 μmol/L 建立DOX AC16細(xì)胞損傷模型。

表1 阿霉素（DOX）對(duì)AC16細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of DOX on the survival rate of AC16 cells （±s，%）

表1 阿霉素（DOX）對(duì)AC16細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of DOX on the survival rate of AC16 cells （±s，%）

①P＜0.01，與對(duì)照組比較

組別對(duì)照組0.1 μmol/L DOX 0.5 μmol/LDOX 1 μmol/LDOX 5 μmol/L DOX 10 μmol/L DOX 48 h 0.45±0.09 0.32±0.07①0.30±0.04①0.27±0.05①0.19±0.03①0.12±0.04①12 h 0.51±0.06 0.48±0.05 0.43±0.08 0.40±0.06①0.39±0.03①0.34±0.05①24 h 0.38±0.07 0.41±0.04 0.38±0.01 0.26±0.02①0.23±0.01①0.18±0.05①

本研究利用心肌細(xì)胞AC16 作為模式細(xì)胞株，在用1 μmol/L DOX處理AC16心肌細(xì)胞前，應(yīng)用不同濃度（0.1、1、10 μmol/L）的Ber 分別預(yù)處理24 h，并對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示：0.1、1、10 μmol/L Ber 對(duì)AC16 細(xì)胞存活率均無(wú)明顯影響（P＞0.05），但0.1、1、10 μmol/L Ber 預(yù)處理皆能明顯提高DOX 致AC16 細(xì)胞存活率的下調(diào)（P＜0.01），并且呈劑量依賴性。具體結(jié)果見表2。表明Ber可減輕DOX對(duì)AC16細(xì)胞的損傷。0.1、1 μmol/L Ber與DOX處理的細(xì)胞比較，細(xì)胞存活率分別提高了25%、41%，而高濃度的Ber（10 μmol/L）對(duì)細(xì)胞活力的提高無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選擇1 μmol/L劑量的Ber對(duì)抗DOX產(chǎn)生的毒性進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。

表2 小檗堿（Ber）對(duì)阿霉素（DOX）降低AC16細(xì)胞存活率的影響Table 2 Effect of Ber on the reduction of AC16 cell survival by DOX （±s）

表2 小檗堿（Ber）對(duì)阿霉素（DOX）降低AC16細(xì)胞存活率的影響Table 2 Effect of Ber on the reduction of AC16 cell survival by DOX （±s）

①P＜0.01，與對(duì)照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與DOX組比較

細(xì)胞存活率/%0.41±0.07 0.40±0.09 0.39±0.09 0.42±0.08 0.24±0.05①0.28±0.03②0.36±0.05③0.38±0.06③組別對(duì)照組Ber 0.1 μmol/L組Ber 1 μmol/L組Ber 10 μmol/L組DOX 1 μmol/L組Ber 0.1 μmol/L+DOX 1 μmol/L組Ber 1 μmol/L+DOX 1 μmol/L組Ber 10 μmol/L+DOX 1 μmol/L組

2. 2 SIRT1參與Ber對(duì)DOX引起的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高的影響采用濃度為1 μmol/L 的Ber預(yù)處理AC16細(xì)胞24 h、繼用1 μmol/L的DOX進(jìn)行處理24 h 后，對(duì)心肌細(xì)胞ROS 水平進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。激光共聚焦結(jié)果顯示，將對(duì)照組的ROS 水平設(shè)為100%，用1 μmol/L DOX處理24 h后，熒光比值為（218.7 ± 16.9）%，相比于對(duì)照組ROS 的水平出現(xiàn)顯著性的升高（P＜0.01），提示DOX致心肌細(xì)胞氧自由基增多。而用1 μmol/L Ber 預(yù)處理24 h、繼用1 μmol/L DOX 處理24 h 后，心肌細(xì)胞ROS 的水平降至（168.25 ± 11.44）%，相比于DOX 處理組出現(xiàn)顯著性的降低（P＜0.01），提示Ber 預(yù)處理能夠降低由DOX 引起的心肌細(xì)胞氧自由基增加的現(xiàn)象。然而，在細(xì)胞暴露于Ber+DOX 之前1 h 加入SIRT1 抑制劑EX527 可逆轉(zhuǎn)Ber 降低ROS 的作用（P＜0.01）。具體結(jié)果見圖1。

圖1 小檗堿（Ber）對(duì)阿霉素（DOX）誘導(dǎo)后的AC16細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）含量升高的影響Figure 1 Effect of Ber on elevated ROS content in AC16 cells after DOX induction

2. 3 Ber干 預(yù) 對(duì)DOX致AC16心 肌 細(xì)胞SIRT1和p66Shc蛋白表達(dá)的影響為了驗(yàn)證p66Shc 下調(diào)和SIRT1激活與Ber干預(yù)的拮抗DOX心毒性有關(guān)的假說(shuō)，我們測(cè)定了在Ber作用下的SIRT1和p66Shc蛋白表達(dá)變化。Western Blot 分析結(jié)果顯示，1 μmol/L DOX 處理的AC16 細(xì)胞中p66Shc 蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01），而SIRT1 表達(dá)明顯減少（P＜0.01）。與此相反，Ber 增強(qiáng)了SIRT1 的蛋白表達(dá)，但明顯抑制了p66Shc 的蛋白表達(dá)。我們假設(shè)Ber 在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性中的拮抗作用可能與SIRT1介導(dǎo)的p66Shc 表達(dá)抑制有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述假說(shuō)，我們?cè)?4 h 1 μmol/L DOX 處理前，用SIRT1抑制劑EX527 預(yù)處理AC16 細(xì)胞1 h，結(jié)果顯示，與SIRT1 負(fù)性調(diào)節(jié)p66Shc 表達(dá)的觀察結(jié)果一致。這進(jìn)一步表明，與Ber + DOX 組比較，預(yù)先加用SIRT1抑制劑EX527預(yù)處理AC16細(xì)胞組中，Ber上調(diào)SIRT1 及下調(diào)p66Shc 表達(dá)的效應(yīng)顯著減弱（P＜0.01），提示Ber通過(guò)激活SIRT1參與調(diào)控p66Shc的表達(dá)。具體結(jié)果見圖2。

圖2 小檗堿（Ber）干預(yù)對(duì)阿霉素（DOX）誘導(dǎo)AC16心肌細(xì)胞SIRT1和p66Shc蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of Ber intervention on SIRT1 and p66Shc protein expression in AC16 cardiomyocytes induced by DOX

2.4 SIRT1激活對(duì)DOX誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體損傷的影響線粒體在維持Ca2+穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，是DOX 對(duì)心肌細(xì)胞毒性的靶細(xì)胞器。線粒體內(nèi)外膜的電位差稱為線粒體膜電位（MMP），MMP 是控制線粒體基質(zhì)、細(xì)胞呼吸和ATP合成中Ca2+積累的重要參數(shù)。為明確DOX 對(duì)心肌細(xì)胞線粒體是否造成損傷，我們用DOX 作用于AC16 細(xì)胞，采用Rh123 染色法測(cè)定給藥后24 h MMP 的變化情況。為了進(jìn)一步研究SIRT1 對(duì)p66Shc 的抑制是否能夠防止DOX誘導(dǎo)的線粒體損傷，Ber的保護(hù)作用是否參與了這一途徑，本研究觀察了給予1 μmol/L DOX 后心肌細(xì)胞內(nèi)Rh123 熒光強(qiáng)度的相應(yīng)變化。共聚焦圖像結(jié)果（見圖3-A）顯示，1 μmol/L DOX處理AC16細(xì)胞24 h可使MMP明顯降低，但1 μmol/L Ber 預(yù)處理1 h 能明顯地減輕DOX 對(duì)線粒體的損傷作用，使MMP 升高（P＜0.01），減弱了DOX 誘導(dǎo)的Rh123熒光強(qiáng)度的降低。而EX725抑制了Ber對(duì)DOX 致線粒體損傷的修復(fù)作用。這些結(jié)果表明，Ber 阻止了DOX 誘導(dǎo)的MMP 的丟失，這可能與SIRT1 的激活有關(guān)。因線粒體Ca2+超載導(dǎo)致線粒體功能障礙，我們觀察了Ber是否能夠減弱由DOX治療引起的[Ca2+]m水平的增加。采用Rhod2-AM 熒光探針?lè)z測(cè)評(píng)價(jià)[Ca2+]m的處理特性，[Ca2+]m也有類似的結(jié)果，DOX組心肌細(xì)胞[Ca2+]m較對(duì)照組顯著增加，而Ber 明顯抑制DOX 誘導(dǎo)的[Ca2+]m的增加，如圖3-B所示。相反，這些改變可以通過(guò)SIRT1抑制劑EX527逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明，Ber治療顯著地阻止了DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MMP和[Ca2+]m異常。

圖3 小檗堿（Ber）對(duì)阿霉素（DOX）誘導(dǎo)后的AC16細(xì)胞線粒體損傷的影響Figure 3 Effect of Ber on mitochondrial damage in AC16 cells after DOX induction

2. 5 SIRT1抑制劑干預(yù)對(duì)Ber減輕DOX所致心肌細(xì)胞氧化損傷及凋亡的影響為進(jìn)一步探討SIRT1/p66Shc通路在Ber修復(fù)DOX所致心肌細(xì)胞損傷中的作用，利用心肌細(xì)胞AC16 觀察了Ber 對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)（如超氧化物清除劑Mn-SOD）以及凋亡相關(guān)因子（如Bax）的影響。Western Blot 分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DOX處理后Mn-SOD 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），而Ber + DOX 處理后Mn-SOD 表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。表明Ber可能通過(guò)上調(diào)Mn-SOD蛋白表達(dá)而提高M(jìn)n-SOD的活性，提示Ber預(yù)處理能夠降低心肌細(xì)胞氧化水平。用濃度為1 μmol/L的Ber預(yù)處理24 h 后，再用1 μmol/L 的DOX 進(jìn)行處理24 h，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax 進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax幾乎不表達(dá)，表明心肌細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯細(xì)胞凋亡事件。用1 μmol/L DOX處理24 h后，心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著升高，提示DOX 處理導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)通路被激活，凋亡蛋白大量表達(dá)。而在用1 μmol/L Ber 預(yù)處理24 h，再以1 μmol/L DOX處理24 h，心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯的降低，提示Ber預(yù)處理能夠減少心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，Ber 預(yù)處理可抑制DOX誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。為了闡明Ber 的抗氧化和抗凋亡活性與SIRT1 的關(guān)系，以及SIRT1在Ber拮抗DOX誘導(dǎo)心臟毒性中所發(fā)揮的作用，本研究進(jìn)一步觀察了SIRT1 特異性抑制劑（EX527）是否對(duì)Ber 的保護(hù)作用有影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用特異性SIRT1 抑制劑EX725 對(duì)AC16 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，可部分逆轉(zhuǎn)Ber對(duì)DOX誘導(dǎo)的心臟毒性的拮抗作用，表現(xiàn)為EX527 預(yù)處理可消除Ber 對(duì)Mn-SOD 及Bax 表達(dá)的影響。結(jié)果表明，Ber 對(duì)DOX 誘導(dǎo)心臟毒性的拮抗作用可部分通過(guò)SIRT1的活化來(lái)發(fā)揮作用，進(jìn)一步證實(shí)了Ber降低DOX誘導(dǎo)的心臟毒性的氧化損傷及凋亡的效應(yīng)與SIRT1/p66Shc通路相關(guān)。具體結(jié)果見圖4。

圖4 SIRT1參與小檗堿（Ber）對(duì)阿霉素（DOX）誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的拮抗作用Figure 4 The protective effect of SIRT1 involved in Ber on oxidative stress and apoptosis of DOX-induced AC16 cells

3 討論

阿霉素（DOX）致心臟毒性機(jī)制尚未完全了解，主要與氧自由基損傷、鈣超載、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡等有關(guān)[29-30]。由于DOX在臨床腫瘤治療中的重要作用，研究和尋找既能減輕其心臟毒性，又能保持其抗腫瘤活性的藥物具有重要意義。值得關(guān)注的是，有研究表明DOX激活了p66Shc通路，導(dǎo)致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體部分，進(jìn)一步產(chǎn)生局部氧化應(yīng)激[8]，這可能有助于揭示DOX引起心臟毒性的新機(jī)制。故推測(cè)，p66Shc 下調(diào)可能阻礙DOX誘導(dǎo)的心臟毒性發(fā)展。

研究表明，在各種病理?xiàng)l件和疾病狀態(tài)下，p66Shc 作為一種氧化應(yīng)激傳感器，通過(guò)其氧化還原酶活性和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，增加ROS 的生成，從而導(dǎo)致器官功能障礙[31]。本研究結(jié)果證實(shí)，p66Shc蛋白表達(dá)水平在DOX誘導(dǎo)的AC16心肌細(xì)胞損傷的模型中顯著增高，這提示p66Shc 在DOX 引起的心臟毒性中起重要作用，有望成為治療干預(yù)候選藥物作用的靶點(diǎn)。而p66Shc 信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，目前還沒有特異的p66Shc 抑制劑。但越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)和基于種群的證據(jù)表明，SIRT1是一個(gè)Ⅲ類組蛋白脫乙酰酶，通過(guò)表觀遺傳染色質(zhì)修飾負(fù)面調(diào)節(jié)p66Shc表達(dá)[18]。激活的SIRT1有助于細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生抵抗[32-34]。基于這些發(fā)現(xiàn)，我們假設(shè)p66Shc可能是SIRT1 在DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性中的作用靶點(diǎn)。本研究中，Western Blot結(jié)果顯示，DOX誘導(dǎo)后心肌SIRT1 蛋白表達(dá)明顯降低，p66Shc 明顯升高，Ber干預(yù)可逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)。另外，體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，EX527作為SIRT1的特異性抑制劑，可以減弱小檗堿（Ber）對(duì)AC16 細(xì)胞經(jīng)DOX 處理后p66Shc 表達(dá)的抑制作用。與此同時(shí)，Ber 可改善DOX 引起線粒體Ca2+超負(fù)荷及導(dǎo)致線粒體膜去極化，且這種作用可被EX527 所逆轉(zhuǎn)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明Ber介導(dǎo)的p66Shc抑制至少部分通過(guò)激活SIRT1 的表達(dá)發(fā)生，提示Ber 可能是一個(gè)潛在的SIRT1激活劑，并可能通過(guò)SIRT1上調(diào)來(lái)拮抗DOX誘導(dǎo)的心臟毒性。這一發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)研究[35]結(jié)果相一致，即SIRT1對(duì)多巴胺誘導(dǎo)的線粒體生物合成障礙和心肌細(xì)胞毒性具有阻抑作用。SIRT1對(duì)p66Shc表達(dá)的調(diào)節(jié)可能是由于SIRT1 降低乙?；M蛋白H3與p66Shc 啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并抑制p66Shc 活性[33]。提示SIRT1/p66Shc 是預(yù)防DOX 心臟毒性的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)，SIRT1/p66Shc通路的激活參與了Ber抗DOX心臟毒性作用。雖然本研究結(jié)果表明Ber可以減輕DOX 引起的心肌細(xì)胞毒性，但是否同樣在體內(nèi)有效及其具體上下游信號(hào)通路仍不清楚，有待下一步深入的研究。

綜上所述，Ber預(yù)處理可以減輕DOX引起的心肌氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙，從而發(fā)揮對(duì)DOX誘導(dǎo)的心臟毒性的治療作用，其治療機(jī)制與SIRT1介導(dǎo)的p66Shc 抑制有關(guān)，提示該途徑是減輕DOX心肌毒性的一個(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)。