王明國(guó)，饒克成，喬卿均，高 飛

垂體瘤是起源于腺垂體、神經(jīng)垂體及胚胎期顱咽管殘余鱗狀上皮的腫瘤，在顱內(nèi)良性腫瘤中較為常見(jiàn)，占10%～12%，病人主要表現(xiàn)為頭痛、惡心、嘔吐、視力減退等[1-2]。臨床上，大部分垂體瘤病人采用手術(shù)治療可以治愈，且不影響自然壽命，少部分病人經(jīng)手術(shù)無(wú)法治愈的原因在于垂體瘤纖維化程度較高，病灶質(zhì)地堅(jiān)韌，無(wú)法徹底切除。有研究表明，垂體腺瘤質(zhì)地與纖維化程度密切相關(guān)[3]。纖維化是指機(jī)體組織、器官纖維結(jié)締組織過(guò)度形成的病理過(guò)程，其中，成纖維細(xì)胞可參與合成大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，其主要成分為膠原蛋白，可促進(jìn)組織、器官纖維化進(jìn)程[4]。正常情況下，ECM產(chǎn)生和分解處于平衡狀態(tài)，而病理情況下，ECM含量異常升高，從而導(dǎo)致組織器官纖維化，引起實(shí)質(zhì)功能下降[5]。有研究表明，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)2B受體可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)纖維化發(fā)生，對(duì)5-HT2B受體信號(hào)進(jìn)行抑制，可以減輕纖維化程度，從而達(dá)到治療目的[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立垂體瘤大鼠模型，并采用不同方式作用于5-HT2B受體，明確對(duì)垂體瘤纖維化的影響，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只7周齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)健康SD雌性大鼠(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量(180±20)g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2016-0029，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 5-HT2B受體激動(dòng)劑(美國(guó)APExBIO Technology公司生產(chǎn)，BW723C86)，5-HT2B受體拮抗劑(美國(guó)Gene Operation公司生產(chǎn)，SB204741)，兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)一抗(美國(guó)Bioworld Technology公司)，兔抗大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)、一抗(武漢博士德生物工程公司)，兔抗大鼠細(xì)胞外調(diào)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，超聲診斷儀(徐州貝爾斯電子科技有限公司)，DYS-40顯微鏡(購(gòu)自上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及建模 選取45只大鼠，以雌激素建立垂體瘤模型[8]：大鼠皮下埋置10 mg雌激素微量緩釋泵，誘導(dǎo)垂體瘤模型，8周后，通過(guò)彩超觀察大鼠體內(nèi)垂體瘤形成情況，若無(wú)明顯腫瘤形成，則更換緩釋泵繼續(xù)干預(yù)4周，第12周經(jīng)彩超觀察均建模成功。將建模成功大鼠分為模型組、5-HT2B受體拮抗劑組、5-HT2B受體激動(dòng)劑組，各15只，剩余15只大鼠為對(duì)照組，皮下埋置10 mg生理鹽水微量緩釋泵。

1.3.2 干預(yù)方法 建模成功后24 h，5-HT2B受體拮抗劑組、5-HT2B受體激動(dòng)劑組大鼠分別用2 mg/kg SB204741、2 mg/kg BW723C86腹腔注射，對(duì)照組及模型組腹腔注射等量生理鹽水，每天2次，共14 d，期間大鼠自由進(jìn)食、飲水，干預(yù)結(jié)束后，無(wú)大鼠死亡。

1.3.3 測(cè)量垂體腫瘤最大直徑、體積及體質(zhì)量 末次干預(yù)結(jié)束后2 h，腹腔注射2%戊巴比妥麻醉大鼠，頸部備皮消毒，作頸正中切口。經(jīng)鈍性分離，暴露胸骨舌骨肌，由其外緣分離肌肉層至找到枕骨嵴，分離枕蝶縫合，調(diào)節(jié)鉆顱針長(zhǎng)度，于枕骨嵴及枕蝶縫合交點(diǎn)處垂直鉆孔，待骨板鉆通，取出骨板，挑破垂體腦膜，用連接1/8馬力吸引器的玻璃管吸出垂體。測(cè)量腫瘤最大直徑，并通過(guò)腫瘤最大徑(d1)、垂直方向最小徑(d2)計(jì)算各組垂體瘤體積，并對(duì)垂體稱(chēng)重。垂體瘤體積V=π/2×d1×(d2)2。

1.3.4 蘇木精-伊紅(HE)染色 測(cè)量結(jié)束后，將各組大鼠1/2垂體組織于-80 ℃保存。剩余部分置于4%的甲醛中固定72 h，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋并切片，厚度4 μm。蘇木素染色4 min，1%鹽酸乙醇分化20 s，1%氨水返藍(lán)30 s，伊紅染色90 s，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察垂體組織病理變化。

1.3.5 Masson染色 取垂體組織切片，二甲苯脫蠟，乙醇沖洗，滴加Weigert鐵蘇木素染色10 min，水洗后用1%鹽酸乙醇分化10 s，麗春紅酸性復(fù)紅液染色10 min，蒸餾水沖洗，1%磷鉬酸水溶液處理5 min，苯胺藍(lán)復(fù)染5 min，1%冰醋酸處理1 min，水洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察垂體組織膠原分布情況。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè) 取凍存垂體組織200 mg，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。PCR體系：2×Mix 6 μL，cDNA 2 μL，正向、反向引物各1 μL，超純水15 μL，共25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，循環(huán)數(shù)35個(gè)，60 ℃終延伸10 min。利用相對(duì)定量2-△△Ct法評(píng)估各個(gè)目的基因mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè) 取垂體組織200 mg，加入RIPA裂解液，離心后取上層清液，進(jìn)行蛋白定量。上樣，進(jìn)行凝膠電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入TGF-β1、CTGF、ERK1/2、p-ERK1/2一抗(1∶500)，4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，洗膜，加入相應(yīng)的二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL化學(xué)反應(yīng)液，曝光后顯影，測(cè)定蛋白條帶灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，目的蛋白/內(nèi)參蛋白條帶比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組垂體瘤直徑、體積及垂體質(zhì)量比較 各組大鼠垂體瘤最大直徑、體積及垂體質(zhì)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，5-HT2B受體拮抗劑組垂體瘤最大直徑、體積及垂體質(zhì)量均下降(P<0.05)，5-HT2B受體激動(dòng)劑組垂體瘤最大直徑、體積及垂體質(zhì)量均升高(P<0.05)；與5-HT2B受體拮抗劑組比較，5-HT2B受體激動(dòng)劑組垂體瘤最大直徑、體積及垂體質(zhì)量均升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組垂體瘤最大直徑、體積及垂體質(zhì)量比較(±s)

2.2 各組垂體組織病理變化 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組垂體細(xì)胞數(shù)目較多，多為圓形，排列整齊有序，血竇豐富，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠垂體細(xì)胞有瘤樣改變，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈圓形或多角形，胞核大小不一，血竇數(shù)量明顯減少，細(xì)胞間質(zhì)增生明顯，可見(jiàn)毛細(xì)血管增生，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；5-HT2B受體拮抗劑組大鼠垂體細(xì)胞有瘤樣改變，細(xì)胞數(shù)量較少，偶有間質(zhì)增生現(xiàn)象，炎性反應(yīng)較輕；5-HT2B受體激動(dòng)劑組大鼠垂體細(xì)胞數(shù)量大量增多，核大且核仁明顯，血竇數(shù)量明顯減少，細(xì)胞間質(zhì)增生現(xiàn)象嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組垂體組織病理變化HE染色圖(×400)

2.3 各種垂體組織膠原分布情況 Masson染色結(jié)果顯示，對(duì)照組垂體細(xì)胞較多，分布均勻，無(wú)膠原產(chǎn)生；模型組可見(jiàn)不連續(xù)膠原纖維，分布密集，并可見(jiàn)結(jié)節(jié)；5-HT2B受體拮抗劑組偶有稀疏、散在分布膠原，無(wú)連續(xù)膠原纖維，結(jié)節(jié)較少；5-HT2B受體激動(dòng)劑組，膠原纖維較多且連續(xù)，呈片狀，結(jié)節(jié)較多。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組垂體組織膠原分布Masson染色圖(×400)

2.4 各組TGF-β1、CTGF、ERK1/2 mRNA相對(duì)表達(dá)情況比較 各組大鼠垂體組織中TGF-β1、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組、5-HT2B受體拮抗劑組及5-HT2B受體激動(dòng)劑組TGF-β1、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)；與模型組比較，5-HT2B受體拮抗劑組TGF-β1、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，5-HT2B受體激動(dòng)劑組TGF-β1、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)；與5-HT2B受體拮抗劑組比較，5-HT2B受體激動(dòng)劑組TGF-β1、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)。對(duì)照組、模型組、5-HT2B受體拮抗劑組及5-HT2B受體激動(dòng)劑組ERK1/2 mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組垂體組織TGF-β1、CTGF、ERK1/2 mRNA相對(duì)表達(dá)情況比較(±s)

2.5 各組TGF-β1、CTGF、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)情況比較 各組大鼠垂體組織中TGF-β1、CTGF、p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組、5-HT2B受體拮抗劑組及5-HT2B受體激動(dòng)劑組TGF-β1、CTGF、p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)；與模型組比較，5-HT2B受體拮抗劑組TGF-β1、CTGF、p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05)，5-HT2B受體激動(dòng)劑組TGF-β1、CTGF、ERK1/2、p-ERK1/2均升高(P<0.05)；與5-HT2B受體拮抗劑組比較，5-HT2B受體激動(dòng)劑組TGF-β1、CTGF、p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)。對(duì)照組、模型組、5-HT2B受體拮抗劑組及5-HT2B受體激動(dòng)劑組ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表4、圖3。

表4 各組垂體組織中TGF-β1、CTGF、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

圖3 各組垂體組織中TGF-β1、CTGF、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)條帶圖

3 討 論

據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，各類(lèi)疾病致死的病人中，大約45%都與組織器官纖維化有關(guān)[9]。纖維化是病理性過(guò)程，可發(fā)生在包括心臟、肺臟、胰臟、神經(jīng)系統(tǒng)等在內(nèi)的多個(gè)器官內(nèi)，是多種慢性疾病及腫瘤的標(biāo)志，不但使組織、器官功能下降，還可能因器官結(jié)構(gòu)破壞、功能衰竭引發(fā)死亡[10-11]。5-HT是一種促纖維化生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞生長(zhǎng)，其生物學(xué)功能主要通過(guò)不同類(lèi)型受體及亞型實(shí)現(xiàn)，5-HT2B受體與神經(jīng)系統(tǒng)病理生理過(guò)程關(guān)系密切[12]。有研究表明，5-HT2B受體拮抗劑可通過(guò)抑制相關(guān)通路，起到抗增殖作用，從而減輕肺纖維化程度[13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)5-HT2B受體進(jìn)行干預(yù)，為抑制垂體瘤纖維化提供新型治療方案。

當(dāng)機(jī)體損傷較大或反復(fù)出現(xiàn)超出細(xì)胞自身再生能力時(shí)，間質(zhì)結(jié)締組織大量增生會(huì)對(duì)缺損區(qū)域進(jìn)行修復(fù)，以維持組織器官相對(duì)完整性。膠原過(guò)度沉積是垂體瘤纖維化的顯著特征，減少膠原沉積可一定程度抑制瘤體纖維化，抑制腫瘤增長(zhǎng)。5-HT2B受體位于動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞及其他類(lèi)型細(xì)胞膜上，介導(dǎo)血清素作為內(nèi)源性配體，參與神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的傳遞，其可通過(guò)激活分裂-纖維化途徑，參與垂體及垂體腺瘤纖維化的形成。有研究表明，當(dāng)5-HT2B受體作用被抑制，成纖維細(xì)胞分化能力降低，組織纖維化進(jìn)程受到抑制[14]。Janssen等[15]研究顯示，SB204741作為5-HT2B受體拮抗劑的一種，可減少膠原蛋白沉積，抑制右心室纖維化，通過(guò)慢性治療可以阻止因壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)引起的心臟功能衰竭的發(fā)生。本研究分別采用5-HT2B受體激動(dòng)劑BW723C86和5-HT2B受體拮抗劑SB204741干預(yù)成模大鼠，結(jié)果顯示，與模型組比較，5-HT2B受體拮抗劑組垂體瘤最長(zhǎng)直徑、體積及垂體質(zhì)量均降低，5-HT2B受體激動(dòng)劑組均升高；同時(shí)膠原沉積以對(duì)照組最少，5-HT2B受體拮抗劑組次之，5-HT2B受體激動(dòng)劑組最高，表明5-HT2B受體拮抗劑可以減少膠原沉積，抑制垂體瘤增長(zhǎng)，與既往研究結(jié)果相符。

細(xì)胞外調(diào)蛋白激酶(ERK)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程有關(guān)，通過(guò)下調(diào)ERK相關(guān)信號(hào)通路，可降低間皮瘤纖維化程度[16-17]。TGF-β1參與組織損傷修復(fù)，當(dāng)損傷因素持續(xù)存在時(shí)，使ECM異常沉積，造成組織器官功能障礙[18]。此外，TGF-β1還可通過(guò)誘導(dǎo)CTGF表達(dá)，促進(jìn)ERK磷酸化，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)纖維化病變的發(fā)生。有研究表明，通過(guò)影響ERK信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減弱肺纖維化程度[19]。Hori等[20]研究顯示，5-HT2B受體在缺乏血管和神經(jīng)元的軟骨組織中表達(dá)，可在軟骨發(fā)育和再生過(guò)程中發(fā)揮功能，通過(guò)5-HT2B受體激動(dòng)劑處理可增加ERK1/2的磷酸化，從而加快纖維化進(jìn)程。而5-HT2B受體拮抗劑則通過(guò)阻斷TGF-β1介導(dǎo)的ERK途徑，抑制成纖維細(xì)胞的促纖維化，從而影響硬皮病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[7]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，5-HT2B受體拮抗劑組大鼠垂體組織中TGF-β1、CTGF mRNA及TGF-β1、CTGF、p-ERK1/2蛋白表達(dá)降低，5-HT2B受體激動(dòng)劑組均升高，表明5-HT2B受體拮抗劑可減少TGF-β1、CTGF表達(dá)，從而抑制ERK通路磷酸化活化，影響ERK信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，從而減輕垂體纖維化程度。

綜上所述，5-HT2B受體拮抗劑可減輕垂體瘤大鼠垂體組織纖維化程度，抑制腫瘤增長(zhǎng)，可能與抑制ERK相關(guān)通路有關(guān)，為臨床垂體瘤治療提供參考。