封 銳，王丹丹，師 帥，李樹(shù)斌，姜 北，胡元會(huì)，

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中等多種血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。研究表明，70%～80%的動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)是易損斑塊和繼發(fā)血栓形成所導(dǎo)致的[1]，而血小板的活化、黏附、聚集是血栓形成的初始環(huán)節(jié)[2]。這些動(dòng)脈硬化性心血管疾病屬中醫(yī)“痰濁”“血瘀”的范疇，而痰與瘀密切相關(guān)，日久可相互搏結(jié)而致病，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，血小板活化、內(nèi)皮損傷、血栓形成等均為痰瘀證的病理表現(xiàn)[3-5]。胡元會(huì)教授潛心研究多年創(chuàng)制的騏龍血脈健方是治療痰瘀互結(jié)型心腦血管疾病的有效方劑，本研究通過(guò)復(fù)制載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，探究騏龍血脈健方對(duì)主動(dòng)脈功能和血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)/CD36介導(dǎo)血小板活化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 騏龍血脈健方(配方顆粒，四川新綠色藥業(yè)研制)，由黃連、全瓜蔞、法半夏、血竭、茯苓等組成，阿托伐他汀鈣片(商品名：立普妥，輝瑞公司生產(chǎn))。

1.1.2 動(dòng)物與飼料 選用無(wú)特定病原體(SPF)級(jí) 8 周齡雄性 ApoE-/-小鼠 40 只及C57BL/6J野生型小鼠 8 只，購(gòu)自北京維通利華公司，許可證SCXK(京)2016-0006，于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。以西方飲食飼料(脂肪 21%、膽固醇 0.15%)飼養(yǎng) ApoE-/-小鼠；以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)C57BL/6J 小鼠。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守國(guó)家動(dòng)物福利倫理及保護(hù)規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)及操作。

1.1.3 主要設(shè)備與器械 低溫高速離心機(jī)(Sigma，Germany)、MSE125P-1CE-DU精密電子分析天平(Sartorius，Ger3many)，Navios 流式細(xì)胞儀， Vevo 2100超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(Visual Sonics，Canada)。

1.1.4 主要試劑 Anti-Thrombospondin 1 抗體(Abcam，England，ab85762)，Ms CD61FITC 2C9.G2 100 μg(BD Pharmingen，China，561911)，Ms CD62P Alexa 647 RB40.34 50 μg(BD Pharmingen，China，563674)，Ms CD36PE CRF D-2712 100 μg(BD Pharmingen，China，562702)

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及建模 將 40只8周齡雄性ApoE-/-小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、立普妥組、中藥大劑量組、中藥中劑量組、中藥小劑量組，每組8只，予高脂飲食喂養(yǎng)14周。另選取8只8周齡雄性C57BL/6J小鼠作為空白組，予以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.2.2 給藥方法 以0.9%氯化鈉注射液將中藥配方顆粒配成中藥混懸液，隨用隨配，置于 4 ℃冰箱保存，并以0.9%氯化鈉注射液將阿托伐他汀鈣片配成藥品溶液，與中藥混懸液同樣條件保存?？瞻捉M及模型組以每天10 g體重0.1 mL給予氯化鈉注射液(0.009 g/mL)；立普妥組以每天10g體重0.1mL給予立普妥溶液(0.300 3 mg/mL)；中藥大劑量組以騏龍血脈健方臨床用量的20倍(36.04 g/mL)、中劑量組以騏龍血脈健方臨床用量的10倍(18.02 g/mL)、小劑量組以騏龍血脈健方臨床用量的5倍(9.01 g/mL)配制溶液，按照10 g體重0.1 mL進(jìn)行灌胃。每日灌胃1次，共持續(xù)14周，實(shí)際用藥量根據(jù)每周體重動(dòng)態(tài)調(diào)整。

1.2.3 取材及處理 末次灌胃完成后，所有小鼠空腹 12 h后取材。①取血：以摘眼球方式獲得血液，采集后置于采血管中保存，以3 000 r/min(4 ℃)速度離心10 min，分離得到血清和血漿，置于-80 ℃冰箱保存。 ②取材：脫臼法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，小心剪開(kāi)皮膚及腹膜，打開(kāi)胸腔剪除臟器，使用注射器將0.9%氯化鈉溶液從小鼠心尖部注入左心室進(jìn)行沖洗。小心地分離主動(dòng)脈周圍的脂肪直至完整暴露。隨后小心剝離主動(dòng)脈束，置于凍存管中，液氮冷凍后迅速置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存[6]。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)徑超聲影像檢測(cè) 造模結(jié)束前 3 d，腹腔注射巴比妥鈉麻醉小鼠，控制心率在 350 次/min左右，麻醉成功后，平臥位固定小鼠，腹部備皮，采用超聲影像系統(tǒng)測(cè)定小鼠腹主動(dòng)脈收縮末期內(nèi)徑(systolic diameter，Ds)、舒張末期內(nèi)徑(diastolic diameter，Dd)。Ds及Dd均測(cè)量3次，取平均值。

1.3.2 主動(dòng)脈TSP-1蛋白檢測(cè) 采用蛋白印跡法測(cè)定小鼠主動(dòng)脈TSP-1 蛋白表達(dá)[7]。

1.3.3 血小板活化率及CD36表達(dá)率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)血小板活化率及CD36表達(dá)率，建立前向角(FSC)-側(cè)向角(SSC)散點(diǎn)圖，參照空白和同型對(duì)照，調(diào)節(jié)儀器閾值、FSC，F(xiàn)L1、FL2、FL6 通道增益和電壓，以收取 5萬(wàn)個(gè)陽(yáng)性事件為終止條件。先在前色相中標(biāo)記出 CD61+的部分，作為C門；以CD61+/CD36+區(qū)域?yàn)镈門；CD61+/CD62P+區(qū)域?yàn)镋門。CD36+CD62P-CD61+%為血小板CD36表達(dá)率；CD36-CD62P+CD61+%為血小板活化率。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腹主動(dòng)脈Ds、Dd比較 與空白組比較，模型組主動(dòng)脈Ds及Dd明顯減小(P<0.01)。與模型組比較，立普妥組與中藥大劑量組主動(dòng)脈Ds及Dd明顯增大(P<0.01)，中藥中劑量組、小劑量組主動(dòng)脈Ds均明顯增大(P<0.01)，中藥中劑量組主動(dòng)脈Dd增大(P<0.05)，中藥小劑量組Dd增大不明顯(P>0.05)。詳見(jiàn)表1及圖1、圖2。

表1 各組小鼠腹主動(dòng)脈Ds、Dd比較(±s) 單位：mm

與空白組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△ P<0.01。圖2 各組小鼠腹主動(dòng)脈Ds、Dd柱狀圖

圖1 各組小鼠腹主動(dòng)脈超聲圖

2.2 各組小鼠主動(dòng)脈TSP-1蛋白表達(dá)比較 與空白組比較，模型組主動(dòng)脈TSP-1 蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，立普妥組、中藥大劑量組 TSP-1蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01)，中藥中劑量組TSP-1 蛋白表達(dá)也減少(P<0.05)，中藥小劑量組 TSP-1 蛋白表達(dá)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2及圖3。

表2 各組小鼠主動(dòng)脈TSP-1蛋白表達(dá)比較(±s)

與空白組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△ P<0.01。圖3 各組小鼠主動(dòng)脈TSP-1蛋白表達(dá)情況

2.3 各組小鼠血小板CD36表達(dá)率比較 與空白組比較，模型組血小板CD36表達(dá)率明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，立普妥組與中藥大劑量組血小板CD36表達(dá)率明顯降低(P<0.05)。中藥中劑量組、中藥小劑量組CD36表達(dá)率與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3及圖4、圖5。

表3 各組小鼠血小板CD36表達(dá)率比較(±s) 單位：%

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠CD36表達(dá)率水平結(jié)果(A為空白組；B為模型組；C為立普妥組：D為中藥大劑量組；E為中藥中劑量組；F為中藥小劑量組)

與空白組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖5 各組小鼠CD36表達(dá)率柱狀圖

2.4 各組小鼠血小板活化率比較 與空白組比較，模型組血小板活化率明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，立普妥組與中藥大劑量組血小板活化率明顯降低(P<0.05)。中藥中、小劑量組血小板活化率與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表4及圖6、圖7。

表4 各組小鼠血小板活化率比較(±s) 單位：%

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠血小板活化率結(jié)果(A為空白組；B為模型組；C為立普妥組：D為中藥大劑量組；E為中藥中劑量組；F為中藥小劑量組)

與空白組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖7 各組小鼠血小板活化率柱狀圖

3 討 論

血小板活化與聚集對(duì)血栓形成至關(guān)重要[8]，在血管內(nèi)皮受損及血流剪切力改變時(shí)，血小板黏附、活化和聚集發(fā)生，導(dǎo)致血栓形成。血小板活化會(huì)刺激細(xì)胞因子大量釋放，而釋放的細(xì)胞因子又會(huì)介導(dǎo)早期血管反應(yīng)，使血小板活化加速，并促進(jìn)黏附分子表達(dá)以及巨噬細(xì)胞的募集[9-10]。活化血小板釋放的主要蛋白包括TSP-1[11]，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡繼而抑制血管新生，并可保護(hù)血管性血友病因子(vWF)遭裂解，以及介導(dǎo)血小板的黏附、聚集，參與血栓形成的過(guò)程，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。當(dāng)血管損傷時(shí)，受損部位有大量的TSP-1聚集，這些TSP-1是由活化的血小板所釋放，誘導(dǎo)鈣調(diào)素(CAM)表達(dá)，促使單核細(xì)胞黏附明顯增加[12]。除此以外，內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)等多種細(xì)胞也可分泌TSP-1[11]。與胚胎比較，健康成年人組織 TSP-1蛋白表達(dá)較少[13]。但當(dāng)組織損傷時(shí)，細(xì)胞會(huì)提高 TSP-1 蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)組織修復(fù)[14]，動(dòng)脈粥樣斑塊中TSP-1 蛋白表達(dá)明顯高于健康血管[15]。血小板表面存在 TSP-1的受體CD36，TSP-1可與血小板表面的CD36結(jié)合來(lái)抑制血管性血友病因子裂解，這一過(guò)程能加速血小板活化[16]；另一方面，TSP-1也可能通過(guò)抑制 CD36介導(dǎo)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路或阻斷一氧化氮(NO)/環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)信號(hào)的抗血栓活性來(lái)間接介導(dǎo)血小板活化[17]。CD36還是一種雙跨膜蛋白[18]，與氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、TSP-1、氧化磷脂(oxPL)和長(zhǎng)鏈脂肪酸有一些共同的結(jié)合位點(diǎn)[19-20]，阻斷CD36或酪氨酸激酶可抑制 TSP-1 或氧化型低密度脂蛋白的血小板信號(hào)反應(yīng)。既往研究證實(shí)，在血小板活化過(guò)程中out-in 信號(hào)的觸發(fā)，與TSP-1和氧化型低密度脂蛋白密切相關(guān)，而在其中起主要連接作用的就是CD36[21]。在血小板活化過(guò)程中，血小板分泌作用的擴(kuò)大與整聯(lián)蛋白活化密不可分，而上述反應(yīng)由CD36所介導(dǎo)，并被血小板自分泌產(chǎn)生的 二磷酸腺苷(ADP)所增強(qiáng)，進(jìn)而加速血栓形成[22]。在血栓形成過(guò)程中，血小板活性增強(qiáng)的同時(shí)，伴隨著血管內(nèi)皮功能紊亂，鐘慧等[23]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死發(fā)病時(shí)，血漿中NO分泌受抑制而內(nèi)皮素-1(ET-1)濃度過(guò)高，使用活血化瘀中藥注射劑可有效促進(jìn)梗死后心功能的恢復(fù)和心肌組織損傷修復(fù)。而Ds和Dd與動(dòng)脈粥樣硬化程度密切相關(guān)，高輝等[24]研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀中成藥可明顯改善肱動(dòng)脈靜息時(shí)基礎(chǔ)內(nèi)徑、反應(yīng)性充血后內(nèi)徑及血管內(nèi)皮舒張功能(FMD)、踝臂脈搏波傳導(dǎo)速度(BaPWV)。

本研究使用超聲影像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠腹主動(dòng)脈Ds及Dd變化，發(fā)現(xiàn)模型組Ds及Dd明顯減小。與模型組比較，立普妥組與中藥大劑量組Ds及Dd明顯增大，考慮與動(dòng)脈粥樣硬化所致管腔狹窄和內(nèi)皮功能紊亂有關(guān)。與空白組比較，模型組主動(dòng)脈TSP-1 蛋白表達(dá)、血小板活化率及CD36表達(dá)水平均增高，證明動(dòng)脈粥樣硬化加重時(shí)，TSP-1蛋白表達(dá)和CD36表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)血小板的活化。而立普妥組與中藥大、中劑量組對(duì)TSP-1蛋白表達(dá)、血小板 CD36表達(dá)率及血小板活化率均有下調(diào)。TSP-1表達(dá)升高與血小板活化均能夠加速動(dòng)脈粥樣硬化形成。因此，騏龍血脈健方可能通過(guò)下調(diào) TSP-1 蛋白的表達(dá)，減少血小板CD36水平并且抑制血小板活化的過(guò)程，最終達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。