陸偉杰,高小姣,史春桃,韓 瑋,程 杰△

(1.江蘇大學附屬昆山醫(yī)院普外科 215300；2.江蘇大學附屬昆山醫(yī)院病理科 215399；3江蘇省無錫市錫山人民醫(yī)院普外科 214000)

結(jié)直腸癌已經(jīng)成為全球發(fā)病率第三的惡性腫瘤,嚴重影響這人類的生命健康,因此,發(fā)掘新的腫瘤標志物對結(jié)直腸癌早期篩查及診療具有重要意義[1-2]。癌基因c-myc定位于染色體8q24,由于該基因的激活可使細胞無限增殖,獲得永生化功能,故其在腫瘤發(fā)生和進展中起關(guān)鍵作用[3-4]。著絲粒蛋白A(centromere protein A,CENPA)是由位于染色體2p23的CENPA基因所編碼的促癌蛋白,目前研究表明,其異常高表達是導致人類癌癥基因組不穩(wěn)定性的重要因素,其中包括8q24/Myc區(qū)域相關(guān)的基因不穩(wěn)定[5-6]。因此,本研究通過數(shù)據(jù)庫及臨床樣本,旨在分析c-myc與CENPA在結(jié)直腸癌中的相關(guān)性及臨床病理學價值。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析

利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)和GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)檢索CENPA與c-myc在結(jié)直腸癌組織與正常組織中的表達差異,并應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析明確二者的相關(guān)性。利用PROMO數(shù)據(jù)庫(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)預(yù)測人類組織中可能作用于CENPA與c-myc啟動子(序列從-2 500到0)的轉(zhuǎn)錄因子。

1.2 標本來源

篩選出2016年1月至2019年12月于江蘇大學附屬昆山市第一人民醫(yī)院行腸癌根治術(shù)的86例具有完整的臨床病例資料的標本,標本來源患者平均年齡為(66.05±14.06)歲,其中男42例,女44例。每例標本具有癌組織與癌旁正常組織,且病理結(jié)果均經(jīng)兩名以上病理醫(yī)師確認。

1.3 主要試劑

免疫組織化學試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；抗c-myc兔多克隆抗體(ab32072)和抗CENPA兔多克隆抗體(ab45694)購自Abcam公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 免疫組織化學法(SP)

本實驗采用SP法檢測,c-myc抗體稀釋度為1∶200,CENPA抗體稀釋度為1∶300。通過對石蠟切片脫蠟水化和抗原修復(fù),用免疫組織化學試劑盒試劑A與B依次作用切片,進行封閉；滴加一抗工作液,過夜孵育后再依次使用試劑C與D；經(jīng)DAB顯色后,復(fù)染脫水封片。

1.5 染色評分方法

染色強度評分和陽性細胞計數(shù)評分相乘結(jié)果記為免疫組織化學染色評分(immunoreactive score,IRS)。按染色強度記分：無色、黃色、棕色、褐色分別記為0、1、2、3分,按陽性細胞所占百分比1%～100%分別記為1～100分。根據(jù)c-myc和CENPA的IRS值,將≥100定為陽性,反之為陰性。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0和Graphpad 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)變量采用成組配對t檢驗,組內(nèi)變量采用配對χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。c-myc與CENPA的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 c-myc與CENPA在結(jié)直腸癌與正常組織中的表達相關(guān)性

Oncomine數(shù)據(jù)庫分析可得,c-myc與CENPA在結(jié)直腸癌組織中的基因表達水平明顯高于正常組織；不僅如此,共表達分析中發(fā)現(xiàn),二者在結(jié)直腸正常組織與結(jié)直腸癌組織中的表達呈正相關(guān)。

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中,筆者同樣發(fā)現(xiàn),在275例結(jié)腸癌組織和92例直腸癌組織中,CENPA與c-myc表達均明顯高于正常組織,且二者在結(jié)直腸癌組織中表達呈正相關(guān)(R=0.26,P<0.001),見圖1。

A:CENPA在結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸上皮組織中的表達差異；B:c-myc在結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸上皮組織中的表達差異；C:CENPA與c-myc在結(jié)直腸癌組織中的表達相關(guān)性。

在86例結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織的免疫組織化學中可以發(fā)現(xiàn),c-myc與CENPA均位于細胞核內(nèi),在胞質(zhì)與胞外基質(zhì)中無未見明顯表達(圖2A)；且二者在結(jié)直腸癌組織中的表達水平均顯著高于癌旁正常組織(tc-myc=9.103,P<0.001；tCENPA=7.913,P<0.001；圖2B)；相關(guān)性分析中同樣發(fā)現(xiàn),兩者在結(jié)直腸癌組織中的表達呈正相關(guān)(P<0.001,圖2C)。

A:c-myc(左)與CENPA(右)分別在正常結(jié)直腸上皮組織和結(jié)直腸癌組織中的免疫組織化學染色結(jié)果(×400)；B:c-myc(左)與CENPA(右)分別在正常組織與癌組織中免疫組織化學染色評分比較；C:c-myc與CENPA在癌組織中免疫組織化學染色評分的相關(guān)性分析。

2.2 c-myc與CENPA表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

根據(jù)二者在結(jié)直腸癌組織中的表達情況,進行分組(≥100為陽性,反之為陰性),c-myc陽性組有37例,陰性組49例；CENPA陽性組40例,陰性組46例。c-myc與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004)和TNM分期(P=0.013)呈正相關(guān),而與年齡、性別、腫瘤大小以及病理分級無關(guān)(P>0.05)；CENPA陽性者,則僅與更高的病理分級相關(guān)(P=0.027)，見表1。

表1 c-myc與CENPA在結(jié)直腸癌中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

續(xù)表1 c-myc與CENPA在結(jié)直腸癌中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 c-myc與CENPA陽性在結(jié)直腸癌臨床病理中的作用

c-myc與CENPA均為陽性患者共25例,c-myc陽性、CENPA陰性有12例,c-myc陰性、CENPA陽性有15,二者均陰性有34例。c-myc與CENPA均為陽性與更高的病理分級(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.012)及更晚的TNM分期(P=0.024)密切相關(guān),而與年齡、性別及腫瘤大小無明顯相關(guān)。

表2 結(jié)直腸癌中c-myc、CENPA均為陽性與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

續(xù)表2 結(jié)直腸癌中c-myc、CENPA均為陽性與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 PROMO數(shù)據(jù)庫預(yù)測作用CENPA與c-myc啟動子的轉(zhuǎn)錄因子

PROMO數(shù)據(jù)庫中預(yù)測發(fā)現(xiàn),有81個轉(zhuǎn)錄因子可能作用CENPA啟動子,有80個轉(zhuǎn)錄因子可能作用c-myc啟動子,其中,有AR、TCF-4、YY1等71個轉(zhuǎn)錄因子可能共同作用CENPA與c-myc啟動子，見圖3。

圖3 PROMO數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果

3 討 論

結(jié)直腸癌是源于結(jié)直腸腺上皮的惡性腫瘤,其發(fā)病主要與生活方式、環(huán)境、和飲食結(jié)構(gòu)及遺傳因素有關(guān)[7]。在這些因素的綜合作用下,癌基因的異常激活成為惡變的重要因素。一直以來,尋找和挖掘新的生物學指標成為學者們攻克結(jié)直腸癌的主要研究方向之一。然而,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),單一的生物學指標并不能完全解釋結(jié)直腸的臨床病理學參數(shù)[8]。因此,多基因的聯(lián)合檢測成了早期篩查與預(yù)后評估的關(guān)鍵。

c-myc作為一種經(jīng)典的癌基因,參與Akt/mTOR、Wnt/β-Catenin等多個信號通路的調(diào)控,促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[9-10]。因此,c-myc高表達普遍存在于多種惡性腫瘤中[11-13]。本研究同樣發(fā)現(xiàn),相比于正常組織,c-myc在結(jié)直腸癌組織中表達明顯增高,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較晚的TNM分期密切相關(guān)。不僅如此,c-myc又是一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多種基因,尤其在腫瘤細胞中上調(diào)多種癌基因的表達水平[14]。因此,通過檢測c-myc調(diào)控的相關(guān)基因的表達,在臨床病理學診斷中或許有一定的輔助作用。

著絲粒結(jié)構(gòu)是染色體結(jié)構(gòu)和功能高度特化的重要組件,參與細胞有絲分裂及增殖過程[15]。CENPA則是著絲粒特異組蛋白,是細胞周期相關(guān)的重要指標,該基因的缺失會造成細胞染色體異常分離,進而減緩生長[16]。文獻表明,該基因在多種癌組織中的表達明顯升高,提示其參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。本研究同樣發(fā)現(xiàn),CENPA高表達于結(jié)直腸癌組織,且與病理分級呈正相關(guān)；從Oncomine與GEPIA數(shù)據(jù)庫中可以發(fā)現(xiàn),c-myc與CENPA在結(jié)直腸癌組織中的表達存在正相關(guān)關(guān)系。這一正相關(guān)關(guān)系在本研究收集的86例結(jié)直腸癌病例中也得以證實。另外,二者均表達于細胞核內(nèi),為此,本研究又將病例分為兩組,即c-myc、CENPA均為陽性組與其他表達組,從而發(fā)現(xiàn),二者均為陽性組與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)?？梢?二者聯(lián)合在臨床病理學參數(shù)的評估價值優(yōu)于任意一種。然而,c-myc與CENPA之間的相關(guān)調(diào)控機制,還需開展深入的基礎(chǔ)實驗來確認。PROMO數(shù)據(jù)庫預(yù)測出有AR、TCF-4、YY1等71個轉(zhuǎn)錄因子可能共同作用CENPA與c-myc啟動子。這些轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中具有促進作用,尤其是TCF-4,在Wnt/β-catenin信號異常激活中起到重要作用[18]。而c-myc又能通過多種途徑形成正反饋環(huán)路,進一步刺激自身表達上調(diào)[19]。根據(jù)PROMO數(shù)據(jù)庫預(yù)測和相關(guān)性分析結(jié)果,筆者推測,很可能就是因為c-myc的這種反饋調(diào)控促進CENPA的表達上調(diào),并使二者表達呈正相關(guān)。但是,這些推論還需后續(xù)體內(nèi)外實驗的驗證。

綜上所述,c-myc與CENPA在結(jié)直腸癌組織中表達均明顯升高,且呈正相關(guān)；c-myc與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān),而CENPA僅與病理分級呈正相關(guān)；二者均為陽性與更高級的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及更晚的TNM分期密切相關(guān)。c-myc與CENPA的啟動子可能同時都受到AR、TCF-4、YY1等71個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。