曾圣強(qiáng)，歐陽長(zhǎng)生，王 洪，洪德志，譚文亮，徐成偉，劉子銘，王云霞

(江西省人民醫(yī)院，南昌 330006)

目前各種血運(yùn)重建技術(shù)可及時(shí)有效地恢復(fù)心肌血流灌注，減輕心肌缺血損傷及壞死。然而心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷仍然嚴(yán)重制約著急性心肌梗死患者的預(yù)后。近年來藥物性預(yù)處理及其作用機(jī)制研究已成為熱點(diǎn),中醫(yī)藥防治心肌I/R損傷的研究取得了一定進(jìn)展。多項(xiàng)研究證實(shí)參附注射液(Shenfu Injection,SFI)對(duì)心肌I/R損傷有明顯保護(hù)作用，具有缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPC)效應(yīng)[1-2]。既往研究均認(rèn)為SFI的IPC效應(yīng)可能與誘導(dǎo)熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)表達(dá)相關(guān)[3-7]，但未能證實(shí)SFI的IPC效應(yīng)與HSP70直接相關(guān)。由于HSP70表達(dá)受到熱休克蛋白22(heat shock protein 22,HSP22)調(diào)控，多項(xiàng)研究已證實(shí)HSP22具有重要的抗心肌I/R損傷作用，該保護(hù)作用等同于IPC。HSP22作為一種較新的熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)，在心肌I/R損傷中的作用日益受到關(guān)注。SFI同樣具有IPC效應(yīng)，它對(duì)HSP22的作用尚不清楚。本研究通過體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞，予以缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation,A/R)處理模擬心肌I/R損傷，觀察SFI對(duì)A/R損傷大鼠心肌細(xì)胞HSP22表達(dá)的影響，探討參附注液對(duì)A/R損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

大鼠H9C2心肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。H9C2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃飽和濕度、含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9C2細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2 儀器與試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司(貨號(hào)GT1402)，RIPA裂解液(強(qiáng))、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，RNase抑制劑(貨號(hào)E00381)、三磷酸脫氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotides,dNTPs)(貨號(hào)GD1102)、RevertAid逆轉(zhuǎn)錄酶(貨號(hào)EP0441)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司，羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)KPL(貨號(hào)分別為074-1806、074-1506)，兔抗人HSP22一抗(貨號(hào)3059S)購(gòu)自美國(guó)CST公司，β-actin (貨號(hào)66009-1-lg)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)購(gòu)自美國(guó)Genview公司(貨號(hào)GR1201)，四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑購(gòu)自廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限，焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水(貨號(hào)40718)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的Annexin V(Annexin V-FITC)及碘化丙錠(propidium iodide,PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)SQ201)購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司，參附注射液購(gòu)自北京雅安三九藥業(yè)有限公司。

CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)美國(guó)賽默飛世爾科技公司，7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，Clinx Chemi Scope 6000化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，Nano-200超微量核酸分析儀購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司(型號(hào)FACSCalibur)，DYCZ-24DN雙垂直電泳儀、DYCZ-40DN轉(zhuǎn)印電泳儀(槽)均購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1A/R損傷模型的建立及分組

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板；每孔3×105個(gè)細(xì)胞，每孔最終的培養(yǎng)基總量2 mL；分為5個(gè)組(n=3)：對(duì)照組、A/R組、A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組。按照分組加入1.5% SFI，2.5% SFI，3.5% SFI在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；在5%CO2和95%N2條件下培養(yǎng)6 h，95%空氣和5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h(根據(jù)MTT檢測(cè)確定最佳復(fù)氧時(shí)間為2 h)后，收樣檢測(cè)。

1.3.2MTT 比色法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9C2細(xì)胞接種到96孔板中，密度為1×104/孔，分組為：對(duì)照組，A/R(0 h) 組，A/R(2 h) 組，A/R(4 h) 組，A/R(8 h) 組，A/R(16 h) 組；按照分組在5% CO2和95% N2條件下培養(yǎng)6 h，95%空氣和5%CO2條件下分別培養(yǎng)0 h、2 h、4 h、8 h、16 h。各組細(xì)胞在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，每孔加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μL 二甲基亞砜。用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)值，以得到的A值反映各組H9C2細(xì)胞的增殖能力。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率

各組細(xì)胞離心收集；用4 ℃預(yù)冷PBS洗滌2次，然后用500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為106/mL；然后取100 μL細(xì)胞懸浮于5 mL流式管中，加入Annexin V-APC和碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色，于室溫避光孵育15 min；加樣于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.4熒光定量RT-PCR檢測(cè)各組心肌細(xì)胞HSP22 mRNA表達(dá)

分別收集各組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。以超微量核酸分析儀測(cè)定RNA純度和濃度，選取合格RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以稀釋的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。引物設(shè)計(jì)見表1。擴(kuò)增程序設(shè)置：95 ℃ 預(yù)變性 3 min、95 ℃ 變性15 s，11個(gè)循環(huán)，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，記錄熔解曲線，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。應(yīng)用2-ΔΔCt法分析各組HSP22 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.5HSP22蛋白表達(dá)的 Western blot 檢測(cè)

各組細(xì)胞離心收集；加入細(xì)胞裂解液，置冰上提取各組細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，采用金屬浴致蛋白變性。取30 μg蛋白樣品，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。將膜移至5%BSA封閉液中封閉1 h；特異性一抗用含5%BSA溶液稀釋至適當(dāng)濃度(根據(jù)抗體說明書提供的稀釋比)；4 ℃孵育過夜后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗3次；二抗用1×PBST溶液稀釋至適當(dāng)濃度(根據(jù)抗體說明書提供的稀釋比)，室溫下孵育1～2 h后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗3次，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。加入ECL化學(xué)發(fā)光液，顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，采用Quantity One圖像分析軟件，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各組H9C2細(xì)胞中HSP22蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)氧2 h后心肌細(xì)胞的增殖受到明顯抑制

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，復(fù)氧2 h、4 h、8 h后H9C2心肌細(xì)胞增殖率顯著降低；復(fù)氧2 h后H9C2心肌細(xì)胞增殖率均顯著低于其他各組，見表2。故后續(xù)試驗(yàn)均采用復(fù)氧2 h建立A/R模型。

表2 各組H9C2心肌細(xì)胞增殖率

2.2 SFI顯著降低A/R損傷誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，A/R組、A/R+1.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)，提示A/R損傷可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；與A/R組相比較，A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組細(xì)胞凋亡率均顯著下降(P<0.05)，表明低中高濃度SFI均顯著降低A/R損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞，見表3、圖1。

表3 各組H9C2心肌細(xì)胞凋亡率

A:對(duì)照組；B:A/R組；C:A/R+1.5% SFI組；D:A/R+2.5% SFI組；E：A/R+3.5% SFI組。

2.3 SFI對(duì)H9C2心肌細(xì)胞HSP22 mRNA表達(dá)的影響

熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，A/R組、A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組HSP22 基因mRNA的表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)；與A/R組相比，A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組HSP22 基因mRNA的表達(dá)水平均無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組H9C2心肌細(xì)胞HSP22 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 SFI對(duì)H9C2細(xì)胞HSP22蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相相比較，A/R組、A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組HSP22蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；與A/R組相比較，A/R+2.5% SFI組、A/R+3.5% SFI組HSP22蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；A/R+3.5% SFI組HSP22蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于A/R組、A/R+1.5% SFI組、A/R+2.5% SFI組(P<0.05)，見圖2、表5。

1：對(duì)照組；2：A/R組；3：A/R+1.5% SFI組；4：A/R+2.5% SFI組；5：A/R+3.5% SFI組。

表5 各組H9C2心肌細(xì)胞HSP22蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

急性心肌梗死是全球范圍內(nèi)致死和致殘的重要疾病之一。在過去20余年，通過藥物或血運(yùn)重建技術(shù)恢復(fù)心肌血流灌注，可顯著減輕心肌缺血壞死，已成為治療急性心肌梗死的標(biāo)準(zhǔn)程序[8]。然而缺血心肌血流再灌注后，受損心肌功能并未得到恢復(fù)，心肌損傷反而進(jìn)一步加重，甚至出現(xiàn)梗死面積擴(kuò)大等不可逆損傷，該現(xiàn)象稱為心肌I/R損傷[9]。目前臨床上仍然無法有效避免心肌I/R損傷，嚴(yán)重影響著患者預(yù)后[10]。

SFI組方來源于中醫(yī)著名古方“參附湯”[11]，主要成分是人參皂甙和烏頭類生物堿[12]，能顯著增加血管灌注量、改善心肌能量代謝，具有抗凋亡、抗炎、抗心肌I/R損傷等作用[11,13-16]。本研究通過建立H9C2大鼠心肌細(xì)胞A/R損傷模型，應(yīng)用不同濃度SFI預(yù)處理心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著SFI濃度升高可顯著減輕A/R損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，表明SFI具有減輕H9C2大鼠心肌細(xì)胞A/R損傷的抗凋亡作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)SFI的多器官保護(hù)作用與誘導(dǎo)HSPs相關(guān)。SFI預(yù)處理可增加HSP70表達(dá)并減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，具有IPC效應(yīng)[4]。王峰等[5]通過建立大鼠心肌I/R損傷模型，觀察到SFI預(yù)處理可誘導(dǎo)HSP70 mRNA及其蛋白的表達(dá)，并發(fā)揮抗心肌I/R損傷作用。陳玉培等[7]同樣觀察到在大鼠心肌I/R損傷模型中，SFI預(yù)處理可誘導(dǎo)心肌HSP70表達(dá)上調(diào)，同時(shí)還可增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、減少丙二醛(malondialdehyde,MDA)生成，具有抗氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的心肌保護(hù)作用。因此，既往研究認(rèn)為SFI的IPC效應(yīng)可能與誘導(dǎo)HSP70表達(dá)相關(guān)，但并未證實(shí)SFI的IPC效應(yīng)與HSP70直接相關(guān)。由于HSP70在細(xì)胞受到應(yīng)激刺激后生成明顯增多，以往研究多關(guān)注于SFI對(duì)HSP70 的誘導(dǎo)表達(dá)作用。由于HSP70 的表達(dá)受到HSP22的調(diào)控，HSP22可誘導(dǎo)HSP70表達(dá)上調(diào)[17-18]，提示HSP22可能在SFI的IPC效應(yīng)中有重要作用。

熱休克蛋白是機(jī)體細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類重要的內(nèi)源性保護(hù)蛋白，主要通過“管家”作用使受損蛋白恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)細(xì)胞存活[19]。其中相對(duì)分子質(zhì)量為(12～43)×103的熱休克蛋白被稱為小熱休克蛋白(small heat shock proteins,sHSPs)[17]。HSP22又稱HSPB8、H11K，屬于sHSPs超家族成員之一[17]，在改善心肌細(xì)胞線粒體能量代謝[17,21]、抗心肌缺血[17-18,22-23]、抑制心肌重構(gòu)[22,24]及抗心肌細(xì)胞凋亡[18,25]等方面有著積極的作用。

研究證實(shí)HSP22具有抗心肌I/R損傷作用，其保護(hù)作用等同于IPC[18,26]。DEPRE等[18]發(fā)現(xiàn)HSP22過表達(dá)小鼠與IPC小鼠心肌梗死面積無明顯差異，HSP22可激活參與IPC效應(yīng)的主要生存激酶，包括Akt及AMP依賴的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]。HSP22直接與Akt和AMPK結(jié)合，并激活來自細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的存活機(jī)制，主要包括抑制促凋亡效應(yīng)因子(糖原合酶激酶3β、Bad及 Foxo)，激活抗凋亡效應(yīng)子(PKCε、內(nèi)皮和誘導(dǎo)型NO合酶亞型以及HSP70)，上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1的表達(dá)及促進(jìn)基因組向葡萄糖利用的轉(zhuǎn)換。因此，HSP22激活生存途徑可預(yù)先觸發(fā)對(duì)缺血的抗凋亡和代謝反應(yīng)，并賦予完全等同于IPC的心臟保護(hù)作用。

在本研究中，與對(duì)照組相比，A/R組大鼠心肌細(xì)胞HSP22 mRNA及HSP22蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞凋亡率顯著增加。A/R損傷時(shí)，SFI可顯著增加大鼠心肌細(xì)胞HSP22蛋白的翻譯并減輕細(xì)胞凋亡，但對(duì)HSP22 mRNA的轉(zhuǎn)錄無明顯影響，表明SFI可能通過促進(jìn)HSP22表達(dá)發(fā)揮抗大鼠心肌細(xì)胞A/R損傷作用。既往研究證實(shí)在心肌I/R損傷中HSP22通過誘導(dǎo)HSP70表達(dá)上調(diào)及激活發(fā)揮IPC效應(yīng)[17-18]，因此，筆者認(rèn)為在心肌I/R損傷中，SFI對(duì)HSP70的誘導(dǎo)表達(dá)作用可能受到HSP22的調(diào)控，HSP22在SFI的IPC作用中起關(guān)鍵作用。

SFI對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與濃度相關(guān)。在SFI干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，本研究分別使用濃度為1.5%、2.5%及3.5%的SFI預(yù)處理心肌細(xì)胞，觀察到SFI可減少A/R損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并且A/R+2.5%SFI組心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于A/R+1.5%SFI組及A/R+3.5%SFI組，表明2.5% SFI抗心肌細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)，因此體外實(shí)驗(yàn)中SFI培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞的最適宜濃度為2.5%。同時(shí)本研究還觀察到SFI對(duì)HSP22的誘導(dǎo)表達(dá)作用呈濃度依賴性。

本研究中與對(duì)照組相比,A/R組H9C2心肌細(xì)胞HSP22 mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào),而細(xì)胞凋亡率顯著升高。然而，筆者觀察到 HSP22 在 SFI 給藥后蛋白質(zhì)水平上調(diào)，但 mRNA 水平上調(diào)。 SFI可顯著增加H9C2細(xì)胞中HSP22蛋白的翻譯，但對(duì)HSP22 mRNA的轉(zhuǎn)錄無顯著影響。Western blot結(jié)果與PCR結(jié)果不一致可能有3個(gè)原因：首先，基因表達(dá)分為轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，即mRNA水平和蛋白質(zhì)水平。 HSP22表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯的時(shí)間和位點(diǎn)之間存在時(shí)間和空間差距；其次，轉(zhuǎn)錄后會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加工、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解、翻譯、翻譯后加工和修飾。 SFI 可能作用于 HSP22 表達(dá)的翻譯水平。最后，不同的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)也可能導(dǎo)致結(jié)果不一致。

本研究尚存在一定的不足。首先，僅通過心肌A/R損傷細(xì)胞模型得到體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其證明力度還不夠充分，有待在心肌I/R損傷動(dòng)物模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證；其次，I/R損傷是通過多種信號(hào)通路作用，下游信號(hào)分子可以重疊，僅研究單一信號(hào)通路不夠全面，本實(shí)驗(yàn)尚不能證實(shí)SFI的抗心肌細(xì)胞A/R損傷作用與誘導(dǎo)HSP22表達(dá)直接相關(guān)，SFI是否通過HSP22調(diào)控HSP70表達(dá)尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，SFI在大鼠心肌細(xì)胞A/R損傷中可誘導(dǎo)HSP22表達(dá)上調(diào)，并減輕A/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，為臨床上應(yīng)用SFI治療心肌I/R損傷提供了一定的理論依據(jù)。