赫 琪,肖偉利,曹銀芳,劉佳誼,梁子紅△

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,呼和浩特 010017;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科,呼和浩特 010017)

特發(fā)性肺纖維化普遍發(fā)病年齡在60歲以上,屬于難治性疾病,目前尚無(wú)有效的治療手段阻止其進(jìn)展[1]。肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells,AECs)在持續(xù)微損傷環(huán)境下自身修復(fù)功能下降致肌成纖維細(xì)胞聚集是肺纖維化進(jìn)展的核心事件[2]。研究表明在肺纖維化中AECs修復(fù)功能下降與細(xì)胞衰老有關(guān),然而目前AECs衰老的原因、機(jī)制不明[3]。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)是一類自然生長(zhǎng)激素,在促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育中發(fā)揮重要作用,通過(guò)激活下游磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K) 及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB;別名AKT),最終引發(fā)細(xì)胞衰老[4-5]。衰老后的AECs通過(guò)衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9)促進(jìn)AECs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及增加膠原的合成,最終加重肺纖維化[6-7]。筆者推測(cè)：IGF-1信號(hào)通路活化可能是AECs衰老致肺纖維化進(jìn)展的重要機(jī)制,若能對(duì)IGF-1信號(hào)通路活性進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，有可能恢復(fù)AECs的修復(fù)功能及抑制肺纖維化進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57小鼠,體重18～25 g,6～8周齡,購(gòu)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào)NMGYKDX(蒙)2020-0534。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為2組,每組6只,分別為對(duì)照組(鹽水組)、博來(lái)霉素(BLM)組。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)A549細(xì)胞株購(gòu)于ATCC細(xì)胞庫(kù)；A549細(xì)胞用含有RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素混合溶液培養(yǎng)并置于37 ℃孵箱中進(jìn)行孵育。

1.2.2主要實(shí)驗(yàn)試劑

BLM購(gòu)自海正輝瑞制藥有限公司；IGF-1購(gòu)自北京索萊寶生物公司。HE染色試劑盒和戊巴比妥鈉購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA純化試劑盒購(gòu)自QIAGEN；其他生化試劑均購(gòu)自北京索萊寶生物公司。

1.2.3肺纖維化小鼠模型建立

充分麻醉后,向小鼠氣管內(nèi)一次性滴入實(shí)驗(yàn)用量的 BLM(5 mg/kg)構(gòu)建肺纖維化模型。向?qū)φ战M小鼠氣管內(nèi)滴入等量的生理鹽水,記為第0天,常規(guī)自由飲食；第21天腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉處死小鼠,并分別收集兩組小鼠的肺組織。取部分肺組織于4%多聚甲醛固定24 h后,制作石蠟切片,用于HE染色和Masson染色；剩余肺組織經(jīng)液氮速凍后,保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4小鼠肺組織免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟,不同濃度乙醇(100%、95%、80%、70%)脫水后,用微波抗原修復(fù)法對(duì)石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)。修復(fù)完成后滴加工作封閉山羊血清對(duì)樣本進(jìn)行封閉(時(shí)間30 min)。封閉結(jié)束后孵育一抗過(guò)夜。次日依據(jù)北京中杉金橋公司的過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔/鼠試劑盒說(shuō)明書(shū),分別滴加SP試劑(鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶),進(jìn)行DAB顯色、蘇木素復(fù)染等操作，并在顯微鏡下觀察評(píng)分。IGF-1主要表達(dá)于腺體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜,以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜出現(xiàn)淡黃色、黃色、棕黃色為陽(yáng)性，按陽(yáng)性細(xì)胞比例計(jì)分:<10%為0分,10%～30%為1分,>30%～60%為2分,>60%為3分;按染色強(qiáng)度計(jì)分:無(wú)色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。將兩項(xiàng)計(jì)分相乘,0、1～3、4～6、7～9分別記錄為-、+、++、+++。這些得分也可以表述為≤3分為表達(dá)陰性(-),>3分為表達(dá)陽(yáng)性(+)。切片均經(jīng)2名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師在雙盲情況下分別閱片。

1.2.5細(xì)胞免疫熒光

將正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞株傳代至24孔板爬片中。PBS清洗3次后,4%多聚甲醛固定、0.1%Trition破膜后用山羊血清進(jìn)行封閉,孵育一抗(4 ℃冰箱過(guò)夜)。次日孵育二抗,時(shí)間2 h。DAPI染核、封片，并于激光共聚焦顯微鏡下觀察目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6IGF-1檢測(cè)

ELISA法測(cè)定小鼠肺組織中 IGF-1的水平。

1.2.7mRNA檢測(cè)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組將不同處理方法的A549細(xì)胞用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解并提取總RNA,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組RNA濃度；嚴(yán)格按照TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行操作,以此獲得反轉(zhuǎn)錄后的cDNA；檢測(cè)各組細(xì)胞樣本中PI3K、AKT的mRNA的表達(dá)水平(PI3K:F-GAAAAGTTTGGCCGGTTCCG、R-GCAGTCAACATCAGCGCAAA;AKT:F-CTTTCGGCAAGGTGATCCTG、R-GTACTTCAG GGCTGTGAGGA;GAPDH:F-TGACTTCAACA GCGACACCCA、R-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA)。

1.2.8細(xì)胞免疫印跡

將上述所得的各組處理后的組織樣本用RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。選取各組蛋白20 μg進(jìn)行上樣,SDS-PAGE蛋白凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜。結(jié)束后根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量準(zhǔn)確裁剪目的蛋白條帶,并用0.4% 明膠進(jìn)行封閉,時(shí)間30 min。封閉結(jié)束后孵育一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。次日,PBST 緩沖液清洗3次,隨后用HRP標(biāo)記的抗人源 IgG二抗室溫孵育1.5 h,再次用PBST緩沖液清洗,最后曝光并對(duì)其進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 IGF-1在BLM小鼠肺組織中廣泛表達(dá)

HE、Masson染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組的肺臟病理相比,BLM小鼠肺臟間質(zhì)中細(xì)胞數(shù)量增多、藍(lán)染的膠原纖維增加。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：與對(duì)照組(-/+)相比,BLM小鼠肺臟中IGF-1的表達(dá)(+++)明顯上調(diào),見(jiàn)圖1。

圖1 正常小鼠肺組織與BLM小鼠肺組織中IGF-1的表達(dá)(×200)

2.2 IGF-1可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生衰老現(xiàn)象

IGF-1(10 ng/mL)刺激A549細(xì)胞72 h后,β-半乳糖染色(SA-β-gal)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比,IGF-1刺激組衰老陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比,IGF-1刺激組紅色熒光表達(dá)的P21、P16明顯上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A：SA-β-gal染色檢測(cè)各組衰老陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量；B：免疫熒光檢測(cè)各組P16、P21表達(dá)變化。紅色熒光代表P16、P21。

2.3 IGF-1上調(diào)了細(xì)胞衰老表型中TGF-β1、MMP-9的表達(dá)

ELISA法對(duì)A549細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比,IGF-1刺激A549細(xì)胞72 h后的培養(yǎng)基中,TGF-β1、MMP-9的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 ELISA法檢測(cè)各組TGF-β1、MMP-9的表達(dá)

2.4 IGF-1致肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化(EMT)現(xiàn)象

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比,IGF-1誘導(dǎo)A549細(xì)胞衰老72 h后,A549細(xì)胞蛋白中的N-Cadherin、α-SAM表達(dá)明顯上調(diào)，見(jiàn)圖4。

圖4 免疫印跡檢測(cè)各組A549細(xì)胞蛋白中的N-Cadherin、α-SAM的表達(dá)變化

2.5 細(xì)胞衰老中出現(xiàn)了IGF-1/ PI3K/AKT信號(hào)通路的活化

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比,IGF-1誘導(dǎo)A549細(xì)胞72 h后,PI3K、p-AKT的表達(dá)明顯上調(diào)，見(jiàn)圖5。

圖5 qRT-PCR檢測(cè)各組A549細(xì)胞中的PI3K、p-AKT的mRNA表達(dá)水平變化

3 討 論

臨床資料的流行病特點(diǎn)顯示，特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病人群普遍以老年人為主,且與AECs衰老明顯相關(guān)[8]。但AECs發(fā)生衰老的原因及具體機(jī)制不明。所以本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)了IGF-1信號(hào)通路的活化導(dǎo)致AECs衰老后發(fā)生IPF的重要原因。

AECs在慢性損傷等病理?xiàng)l件下具有很強(qiáng)的再生及修復(fù)能力,但I(xiàn)PF發(fā)生時(shí)AECs喪失了自身的修復(fù)功能并啟動(dòng)了后續(xù)致纖維化的生物學(xué)效應(yīng)[9]。細(xì)胞衰老理論認(rèn)為隨著年齡的增長(zhǎng),細(xì)胞會(huì)發(fā)生損傷,影響了自身的修復(fù)功能,由此可見(jiàn)修復(fù)功能下降的AECs與細(xì)胞衰老明顯相關(guān)[10]。但細(xì)胞衰老不僅僅是年齡增加的結(jié)果,更多的是在慢性損傷等病理?xiàng)l件下共同作用的結(jié)果?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)：AECs遭遇慢性損傷時(shí),會(huì)過(guò)度釋放IGF-1,激活I(lǐng)GF-1/PI3K/AKT信號(hào)通路,一方面釋放炎癥因子,形成氧化應(yīng)激反應(yīng)；另一方面IGF-1會(huì)加速細(xì)胞生長(zhǎng)速度,使細(xì)胞發(fā)生功能性改變,最終發(fā)生細(xì)胞衰老[11]。雖然不少學(xué)者報(bào)道了IGF-1是致纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞因子,但在肺纖維化中IGF-1是否是造成AECs衰老的重要原因，以及具體機(jī)制是什么并不清楚。所以在本研究中利用 BLM小鼠模型觀察IGF-1在肺纖維化的表達(dá)情況,同時(shí)利用IGF-1對(duì)AECs進(jìn)行誘導(dǎo),觀察AECs衰老的現(xiàn)象。在本研究中發(fā)現(xiàn)了BLM小鼠肺組織中不僅存在IGF-1的廣泛表達(dá),還發(fā)現(xiàn)IGF-1誘導(dǎo)AECs 72 h后,AECs發(fā)生了明顯的細(xì)胞衰老現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)均說(shuō)明了IGF-1是導(dǎo)致AECs衰老及肺纖維化發(fā)生的重要原因。

SASP是細(xì)胞衰老后發(fā)生纖維化生物學(xué)效用的重要標(biāo)志[12]。文獻(xiàn)報(bào)道了IGF-1/ PI3K/AKT信號(hào)通路活化后會(huì)釋放TGF-β1、MMP-9,恰巧這些細(xì)胞因子均是IPF進(jìn)展的重要蛋白[13-14]。TGF-β1可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖活化及膠原合成,使未成熟的成纖維細(xì)胞演變成肌成纖維細(xì)胞[15]。MMP-9則可以活化炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥細(xì)胞在肺間質(zhì)中的積聚[16]。本研究IGF-1誘導(dǎo)小鼠AECs衰老后,除了引起細(xì)胞培養(yǎng)基中 TGF-β1、MMP-9表達(dá)增加外,AECs還發(fā)生了EMT現(xiàn)象。這更加充分說(shuō)明了IGF-1致AECs衰老后發(fā)生的EMT現(xiàn)象是肺纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制。

PI3K/AKT信號(hào)通路活化依賴于上游細(xì)胞因子IGF-1的釋放[17]。PI3K/AKT信號(hào)通路的活化不僅僅是纖維化發(fā)生的重要信號(hào)通路,也是細(xì)胞衰老的重要信號(hào)通路[18]。所以本研究進(jìn)一步利用IGF-1建立AECs衰老模型,檢測(cè)下游信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PI3K、AKT的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-1誘導(dǎo)AECs衰老72 h后,PI3K、AKT的表達(dá)明顯上調(diào)。

IPF是多個(gè)蛋白介導(dǎo)的多條信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)樣活化過(guò)程,在AECs衰老中是否存在其他信號(hào)通路的活化及IGF-1信號(hào)通路的活化是否比其他信號(hào)通路活化更為重要,均需要進(jìn)一步研究。本研究的發(fā)現(xiàn)有助于了解及預(yù)防衰老相關(guān)性疾病,為精準(zhǔn)研發(fā)IPF藥物提供了臨床轉(zhuǎn)化的理論基礎(chǔ)。