顧雨熹 王 錦 陳 帥 李 理 陳晉瑩

(中儲糧成都儲藏研究院有限公司 610091)

沙門氏菌屬(Salmonellaspp.)是一類腸桿菌科的革蘭氏陽性菌，需氧及兼性厭氧，是主要的食源性病原體之一[1]，也是一種常見的人畜共患的病原菌，可引起人和動物腸炎熱、胃炎熱、敗血癥等[2]。

人類感染沙門氏菌的主要途徑是食用了被沙門氏菌污染的蛋類、禽類肉制品和豬肉[3]。據世界衛(wèi)生組織(WHO)2015年發(fā)布的統(tǒng)計數據，自2010年以來全球發(fā)生了涉及22種不同食源性腸道疾病5.82億例，造成35.1萬人死亡，其中傷寒沙門氏菌造成5.2萬例死亡。近年來報道顯示，在我國每年也有900多萬人次因沙門氏菌患病，導致近800人死亡。沙門氏菌也容易成為動物源性飼料的主要污染源，其中以骨粉、魚粉、血粉等蛋白質飼料最易被沙門氏菌污染[4]。用沙門氏菌污染的飼料飼喂動物，是引起禽傷寒、豬霍亂、鼠傷寒沙門氏菌病、豬副傷寒、馬流產沙門氏菌等動物疾病的主要途徑，造成的經濟損失巨大，嚴重威脅養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展[5]。

沙門氏菌已經成為食源性致病菌重點監(jiān)控對象，但是目前還沒有發(fā)現能有效預防沙門氏菌傳播的藥物[6]。因此，快速、準確地檢測食品和飼料中的沙門氏菌是有效防控沙門氏菌感染的關鍵環(huán)節(jié)，重視沙門氏菌的檢測工作才能最大限度防范沙門氏菌帶來的食品安全隱患。截至2021年9月30日，現行有效的沙門氏菌相關檢測標準共28個，其中國家標準6個，地方標準12個，行業(yè)標準10個。

食品安全國家標準GB 4789.4-2016規(guī)定了食品中沙門氏菌的檢驗方法，該方法為較為傳統(tǒng)的微生物學檢驗法，檢驗鑒定程序復雜，檢測周期較長。隨著近年來細菌學研究的持續(xù)深入，細菌檢測漸漸從表型判定轉向基因鑒定。近年發(fā)展起來的PCR技術(Polymerase Chain Reaction)其本質是在體外大量擴增目的DNA片段，該技術具有檢測時間少、特異性強、靈敏度高、操作簡單、成本低等優(yōu)點[7]。

本次研究對同一批樣品分別使用微生物學檢驗法和PCR法進行檢測。通過對比兩種方法在實際檢測過程中的差異，為探索沙門氏菌檢測方法的優(yōu)化提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品及陽性對照 待測盲樣3個，均為白色粉狀樣品，采用西林瓶真空密封包裝，由大連中食國實檢測技術有限公司提供，分別編號為N1、N2、N3。

陽性對照：腸沙門氏菌腸亞種(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號：CICC21513)，由本實驗室保存。

陰性對照：滅菌ddH20。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 培養(yǎng)基：緩沖蛋白胨水(BPW)；四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液；亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液；亞硫酸鉍(BS)瓊脂；木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂；營養(yǎng)瓊脂。

試劑：DBI-05沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒(北京產)；細菌DNA提取試劑盒(南京產)；2×Rapid Taq Master Mix(南京產)；Ultra GelRed Nucleic Acid Stain(南京產)；1×TAE緩沖液；DL2000 Plus DNA Marker(南京產)。

沙門氏菌特異性引物設計參考飼料中沙門氏菌檢測PCR法中所用引物[8]，本研究所使用的PCR引物及測序均由成都某公司提供。

表1 PCR引物及測序

1.1.3 儀器與設備 高壓蒸汽滅菌鍋(HVE-50)；無菌操作臺(SW-CJ-1FD)，蘇州產；恒溫培養(yǎng)箱(BD53)；PCR儀(ETC811),北京產；電泳儀(WIX-EP600)，北京產；凝膠成像儀(GenoSens 2100),上海產；純水儀(Direct 16)。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物學檢驗 微生物學檢驗方法按照國家標準GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》中規(guī)定的食品中沙門氏菌的檢驗方法，依據其生化特性，通過預增菌、選擇性增菌、分離、純化培養(yǎng)、生化鑒定5個步驟對沙門氏菌進行檢測(圖1)。

圖1 沙門氏菌微生物學檢測流程

1.2.1.1 預增菌 在無菌條件下，將3個待測盲樣與225 mL BPW培養(yǎng)基混勻后，置于恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃培養(yǎng)8 h～18 h。

1.2.1.2 選擇性增菌 在無菌條件下，分別取預培養(yǎng)的樣品混合液1 mL加入10 mL TTB培養(yǎng)基與10 mL SC培養(yǎng)基。TTB培養(yǎng)基混合物置于恒溫培養(yǎng)箱中42±1℃培養(yǎng)18 h～24 h，SC培養(yǎng)基混合物置于恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。

1.2.1.3 分離 在無菌條件下，分別取選擇性增菌液一環(huán)，劃線接種于一個BS平板和一個XLD平板，置于恒溫培養(yǎng)箱中36±1℃分別培養(yǎng)40 h～48 h(BS平板)和18 h～24 h(XLD平板)。培養(yǎng)后觀察各選擇性平板上生長的菌落特征(表1)。

表1 沙門氏菌落特征

1.2.1.4 純化培養(yǎng) 從選擇性平板上分別挑取2個以上典型菌落接種于營養(yǎng)瓊脂平板進行純化培養(yǎng)，于36±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。

1.2.1.5 生化鑒定 挑取營養(yǎng)瓊脂平板的培養(yǎng)物，按照DBI-05沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒說明書操作進行生化鑒定。

1.2.2 PCR法檢驗 根據沙門氏菌特征基因片段的分子生物學特性，通過預增菌、選擇性增菌、模板制備、PCR擴增、電泳檢測、測序驗證6個步驟對沙門氏菌進行快速檢測(圖2)。

圖2 沙門氏菌PCR法檢測流程圖

1.2.2.1 預增菌 將3個待測盲樣、陽性對照和陰性對照，采用1.2.1中的預增菌方法進行預增菌。

1.2.2.2 選擇性增菌 同1.2.1.2中的選擇性增菌方法。

1.2.2.3 模板制備 使用細菌DNA提取試劑盒，提取增菌后的3個待測盲樣、陽性對照樣品和陰性對照樣品的DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳，待測盲樣和陽性對照出現明亮條帶并且陰性對照無條帶，則為模板制備成功且模板制備過程中沒有出現人為污染。

1.2.2.4 PCR擴增(見表2)

表2 反應體系和循環(huán)參數

1.2.2.5 電泳檢測 將1.5 g瓊脂糖加入100 mL 1×TAE緩沖液中加熱至充分溶化，冷卻至60℃～65℃，加入10 μL GelRed充分混勻。根據需要在制膠器中放入合適的梳子，制成電泳膠塊，放入電泳槽內。取6 μL Marker2000點樣，并將7 μL～9 μL PCR擴增產物點樣于同一塊膠上。5 V/cm恒壓電泳，至指示劑遷移至凝膠中后部，用成像儀進行凝膠成像，觀察在330 bp處是否出現條帶，如有則為疑似陽性樣品。

1.2.2.6 測序 對于疑似陽性樣品，將其擴增產物進行測序，測序結果NCBI網站上用BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行序列比對。

2 結果與分析

2.1 兩種方法檢測程序對比

沙門氏菌微生物檢測的過程中，預增菌步驟所需時間為8 h～18 h，增菌步驟所需時間為18 h～24 h，純化培養(yǎng)所需時間為18 h～24 h，微生物學檢測在使用較為便捷的沙門氏菌生化鑒定試劑盒的情況下仍需24 h的檢測時間，該法的總檢測時間為68 h～90 h。

本次試驗所使用的沙門氏菌PCR檢測的過程中，預增菌和增菌步驟與微生物法一致，但在分子生物學檢測中僅需要2 h左右即可完成初步檢測，總檢測時間約為28 h～44 h，如需進行測序則總檢測時間再增加8 h～12 h，為36 h～56 h。

PCR法檢測總時長36 h～56 h較微生物學檢測總時長68 h～90 h，節(jié)約了近一半的檢測時間，顯著地提升了檢測效率。且在前期的實驗準備中，微生物學法需要準備6種培養(yǎng)基，PCR法僅需準備3種培養(yǎng)基，利用PCR法對沙門氏菌進行檢測的檢測成本更低、操作更簡單。

2.2 檢測結果對比

2.2.1 微生物學檢測法檢測結果 檢測結果表明(表3)，N2為典型的含沙門氏菌屬的樣品，N1、N3為不含沙門氏菌屬的樣品。

表3 沙門氏菌微生物學檢測結果

2.2.2 PCR法檢測結果 選擇性增菌后提取N1-N3、陽性對照樣品和陰性對照樣品的核酸，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示模板制備成功且試驗過程中沒有出現人為污染。

利用試驗設置的程序和引物對N1-N3樣品及陽性對照進行PCR擴增，電泳結果如圖3，N2和陽性對照在約330 bp處出現明亮條帶。

圖3 PCR法檢測電泳結果圖

送測序后返回的結果使用NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST功能進行序列比對。結果顯示，N2擴增產物與目的片段的同源性為99%[圖4(a)]，陽性對照與目的片段擴增產物的同源性為98%[圖4(b)]，N2與陽性對照中均順利擴增出目的片段，說明利用本試驗中的方法檢測沙門氏菌具有可行性，檢測結果可靠。

(a)N2擴增序列與目的片段(Target)比對結果

(b)對照組(C)擴增序列與目的片段(Target)比對結果

為了進一步了解樣品中沙門氏菌的種屬，將對照組(C)的擴增序列在NCBI基因數據庫中進行比對，該序列與腸沙門氏菌腸亞種(Salmonellaentericasubsp.enterica)完全一致，同源性達到100%[圖5(a)]，該結果與事實相符。隨后，我們將N2擴增產物序列在NCBI基因數據庫中進行比對，該序列與腸沙門氏菌腸亞種的同源性最高達到99%[圖5(b)]，推測N2中的沙門氏菌為腸沙門氏菌腸亞種中的一種。

(a)C(對照組)在基因數據庫中的比對結果

(b)N2在基因數據庫中的比對結果

通過試驗證明，PCR法的檢測結果與微生物學檢測法的結果一致，均為：N2為含沙門氏菌的陽性樣品，N1、N3為不含沙門氏菌的陰性樣品。

3 分析與結論

PCR法與傳統(tǒng)微生物學檢測法得出的結果高度一致，結果均是N2為沙門氏菌陽性樣品、N1和N3為沙門氏菌陰性樣品，后經大連中食國實反饋該檢測結果正確。說明兩種方法均能在實際檢測應用中得出準確的檢測結果，且PCR法檢測具有時間短、特異性強、靈敏度高、操作簡單、成本低的應用優(yōu)勢[8]。

盡管PCR技術具有一定的優(yōu)勢，在現代食品安全檢測技術中發(fā)揮著重要作用，但它還存在一些值得關注的問題。其中最常見的就是外源基因污染問題，由于PCR的靈敏度較高，且該PCR的實質是通過體外大量擴增DNA片段從而放大信號。如果檢測過程中被外源DNA污染，很容易得到假陽性結果，就會嚴重影響檢測結果的準確性[9]。

近年來，PCR技術在沙門氏菌檢測中還取得了一些新的進展。有研究運用多重PCR技術檢測沙門氏菌，僅需一次反應即可同時檢測沙門氏菌的多個特異片段，在節(jié)約試劑、減少反應時間、大幅提高靈敏度的同時減少假陽性的出現[10]；多重PCR技術還可以用于同時檢測沙門氏菌和其它有害菌，如奇異變形桿菌[11]、溶血性大腸桿菌、蘭氏乳桿菌[12]、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、霉菌[13]、副溶血性弧菌、霍亂弧菌[14]等。還有研究利用巢式PCR的原理通過使用兩對不同的引物擴增同一條特異性片段，此法的特異性很高可以檢測到最低4 CFU/25 g的沙門氏菌[15]。劉斌等[16]在PCR反應體系中加入人造擴增內標片段，可以有效排除沙門氏菌PCR檢測中的假陰性結果，提高檢測準確率。為了進一步提高敏感性和特異性，PCR法還可以和其它方法聯(lián)合使用。比如，將PCR和DNA探針法相結合，該體系可以檢測到30 pg以上的沙門氏菌DNA[17]；將PCR法和ELISA法相結合，可以檢測到14 pg以上的沙門氏菌DNA[18]；將PCR技術與疊氮溴乙錠相結合，可以避免沙門氏菌檢測中因死細菌[19]造成的假陽性結果；將多重PCR技術檢測與毛細管電泳成像技術相結合，可以同時對五種病原進行快速檢測大幅提高檢測效率[20]等等。

食品中致病菌的快速檢測是確保食品安全的前提，PCR法為沙門氏菌的檢測提供了一種新選擇，該方法的應用也為相關標準的制修定提供了理論支撐和技術支撐。由此可以預見，隨著社會進步和科學技術的不斷發(fā)展，PCR技術及其衍生出的新技術與其他諸如生物芯片、免疫磁珠等在食品致病菌檢測中的聯(lián)合使用，既能大大提高檢測效率，又能保證分析結果的準確性，必將在食品微生物檢測和研究領域開辟一個新的應用時代。