尤夢瑤，閆佳佳，萬 璐，張 赫，鄭春英

（1黑龍江大學/農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

作為新型微生物資源，植物內(nèi)生菌及其活性代謝產(chǎn)物一直都是研究的熱點[1]。關于植物內(nèi)生菌活性代謝物的研究，大多直接從其發(fā)酵液中進行提取、分離[2]，而其揮發(fā)性成分卻較少被關注。揮發(fā)性成分一般具有芳香氣味，而且組成復雜[3]。目前，香味成分要么直接從芳香動植物原料中提取[4]；要么利用化學合成的方法獲得[5]；或者采用微生物發(fā)酵法直接進行生產(chǎn)[6]或通過周期短、品質(zhì)高、綠色環(huán)保等優(yōu)點成為目前生產(chǎn)的熱點[7]，真菌是生物合成天然揮發(fā)性香味物質(zhì)的主要微生物轉(zhuǎn)化的方式間接獲得[8]。在上述3種香味成分的來源途徑中，微生物發(fā)酵法以其成本低廉、生產(chǎn)資源[9]。

烏拉爾甘草(Glycrrhiza uralensis Fisch)為北方瀕危藥用植物[10]，具有抗病毒[11]、抗炎[12]、抗腫瘤[13]等多種活性作用，是臨床常用中草藥之一。甘草的主要成分為三萜皂苷化合物和黃酮類化合物[14]，在甘草化學成分的研究中，對皂苷、黃酮類等非揮發(fā)性成分的研究較多[15]，但對其揮發(fā)油成分的研究很少有報道[16]。所以為進一步開發(fā)利用這一藥用資源并為其提供試驗基礎，本研究選取分離自健康野生甘草根部的甘草內(nèi)生真菌RP2為研究對象，該菌株具有持久、清新、愉悅的香味，對其進行初步鑒定后并采用GC-MS法分析其揮發(fā)性成分，不僅能夠闡明其香味物質(zhì)組成，同時也可為綜合利用具有生物活性的揮發(fā)性成分奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草內(nèi)生真菌RP2由黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業(yè)實驗室分離自野生健康甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)根；健康野生甘草采自黑龍江省大慶地區(qū)；PDA、PDB培養(yǎng)基配制方法參閱文獻[17]；試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

GC-MS聯(lián)用儀（7890AGC-240MS，美國安捷倫公司）。

1.3 方法

1.3.1 甘草內(nèi)生真菌RP2菌株的鑒定

（1）形態(tài)學觀察

參閱文獻[18]，對RP2菌落顏色、形狀、菌絲、是否產(chǎn)生色素等進行初步觀察。

（2）甘草內(nèi)生真菌RP2 ITS序列分析

按照文獻方法[19]PCR擴增，通用引物ITS1和ITS4（上海生工生物工程股份有限公司合成）：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ， ITS4： 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測后，委托上海生工生物工程股份有限公司進行ITS序列分析，所獲序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，從GenBank中進行Blast檢索分析，對比檢測同源性較高的菌株序列，利用MEGA5.0軟件建立甘草內(nèi)生真菌RP2的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其生物學分類。

1.3.2 甘草內(nèi)生真菌RP2揮發(fā)性成分分析

（1）供試品液的制備

將甘草內(nèi)生真菌RP2菌絲體接種于“1.1”下的培養(yǎng)基(60 mL)中，28℃、120 r/min培養(yǎng)3天后作為種子液；取種子液以5%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接至300 mL PDB培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min發(fā)酵14天。分取發(fā)酵液（60℃低溫濃縮）及菌絲體（超聲破碎），乙酸乙酯萃取3次(3×100 mL)，回收溶劑，殘渣用乙酸乙酯溶解，微孔濾膜(0.22 μm)過濾，即得發(fā)酵液供試品液及菌絲體供試液，備用。

（2）空白對照品的制備

取“1.1”的PDB培養(yǎng)基600 mL，抽濾后，同“1.3.2(1)”處理，作為培養(yǎng)基空白對照品，備用。

（3）甘草內(nèi)生真菌RP2揮發(fā)性成分分析

GC色譜條件：HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；載氣為高純氦氣(He)，流速1mL/min；進樣溫度250℃；壓力設置為57.4 kPa；頂空進樣量1 μL；分流比為30:1。程序升溫：初始溫度50℃（保持2 min），以10℃/min的速率升溫至102℃（保持1 min），以0.5℃/min升溫至120℃保持1 min，以20℃/min的速率升溫至260℃（保持10 min）。

MS條件：EI轟擊；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；溶劑延遲2 min；四級桿溫度160℃；電離化電壓70 eV；質(zhì)量掃描范圍40～650 amu；掃描速率1.65 scan/s。通過質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫對分析，采用峰面積歸一化法計算其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草內(nèi)生真菌RP2菌株的鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學觀察結(jié)果 甘草內(nèi)生真菌RP2菌落及孢子形態(tài)學觀察結(jié)果見圖1及圖2。

圖1 RP2菌落形態(tài)

圖2 RP2孢子顯微形態(tài)

由圖1及圖2可知，甘草內(nèi)生真菌RP2菌落呈現(xiàn)白色，菌絲中間較為密集，邊緣較為稀疏，呈外擴姿態(tài)，菌落基質(zhì)為紫色，中間顏色較深，外圈呈現(xiàn)乳白色；孢子略微彎曲，具有分枝，橫隔較多。

2.1.2 甘草內(nèi)生真菌RP2 ITS序列分析結(jié)果 甘草內(nèi)生真菌RP2基因組DNA PCR擴增獲得一條長度為518bp的特異性條帶，將測得的內(nèi)生真菌RP2的ITS序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，進行GenBank分析，使用MEGA5.0軟件對內(nèi)生真菌RP2序列同源性較高的菌株序列進行分析，建立內(nèi)生真菌RP2的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。

圖3 內(nèi)生真菌RP2的系統(tǒng)發(fā)育樹

分析結(jié)果表明，內(nèi)生真菌RP2（登陸號：MW834592）與Fusarium oxysporum(MK424838.1)聚于同一分支，且兩者同源性為99%。綜合形態(tài)學鑒定以及ITS序列分析結(jié)果，將甘草內(nèi)生真菌RP2鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。

2.2 甘草內(nèi)生真菌RP2揮發(fā)性成分分析結(jié)果

為排除培養(yǎng)基中成分對分析結(jié)果的干擾，同法對PDB培養(yǎng)基也進行了揮發(fā)性成分的分析，采用GC-MS法，分別對內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液、菌絲體及空白培養(yǎng)基對照品進行揮發(fā)性成分分析，其離子流見圖4。

圖4可以看出，PDB培養(yǎng)基中含有14種揮發(fā)性物質(zhì)，鑒定了其中6種成分；內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液中分離出揮發(fā)性物質(zhì)21種，鑒定了其中的11種成分；菌絲體中分離出13種，鑒定了其中的6種成分，結(jié)果見表1、表2及表3。

圖4 揮發(fā)性總離子流

表1為PDB培養(yǎng)基揮發(fā)性成分分析，從表1可以看出，PDB培養(yǎng)基中含有6種揮發(fā)性成分。對比分析表2、表3結(jié)果內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液和菌絲體中均含有鄰苯二甲酸二丁酯成分，此為PDB培養(yǎng)基中的干擾成分。

表2為內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液揮發(fā)性成分分析，從表2可以看出，內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液中含有11種揮發(fā)性成分，由于鄰苯二甲酸二丁酯為PDB中干擾性成分，所以在內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液中相對含量最高的是2-苯基乙醇，為3%。

表3為內(nèi)生真菌RP2菌絲體揮發(fā)性成分分析，從表3可以看出內(nèi)生真菌RP2菌絲體中揮發(fā)性成分共有6種，其中相對含量最高的為苯乙二醇。此外，內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液和菌絲體中均含有芥酰胺，此為二者共同的揮發(fā)性成分。

對比分析表1、表2及表3結(jié)果，除去與PDB培養(yǎng)基相同的揮發(fā)性成分鄰苯二甲酸二丁酯的干擾之外，甘草內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液及菌絲體中均含有芥酰胺，此外，甘草內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液和菌絲體中還有一些特異性成分：2-苯基乙醇、1-苯基乙烷-1,2-二醇、尼克酰胺、對羥基苯乙酸、2,2,4,4,6,6,8,8,10,10,12,12,14,14-十四甲基-1,3,5,7,9,11,13-七氧雜-2,4,6,8,10,12,14-七硅雜環(huán)十四烷、2-(4-羥基苯基)乙酸、2-(1H-吲哚-1-基)乙酸、2-((1R,6R)-3-甲基-6-(丙-1-烯-2-基)環(huán)己-2-烯基)-5-戊基苯-1,3-二酚、2-羥基-1-苯基乙酮、苯乙二醇、鄰苯二甲酸5-甲基-2-乙基酯，其中含量最高的是2-苯基乙醇，為3.00%。

表1 PDB培養(yǎng)基揮發(fā)性成分分析

表2 內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液揮發(fā)性成分分析

表3 內(nèi)生真菌RP2菌絲體揮發(fā)性成分分析

3 討論與結(jié)論

經(jīng)形態(tài)學觀察及ITS序列分析，甘草內(nèi)生真菌RP2初步鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。尖孢鐮刀菌分致病性及非致病性菌株，非致病性菌株一般存在于土壤或植物組織內(nèi)部，是常見的植物內(nèi)生菌[20]。隨著尖孢鐮刀菌活性代謝物研究報道的增加[21]，越來越多的學者致力于尖孢鐮刀菌的健康產(chǎn)品的開發(fā)應用[22]，本文對甘草內(nèi)生真菌RP2進行初步鑒定，為后續(xù)綜合利用該菌株奠定基礎。

經(jīng)GC-MS分析表明，內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液及菌絲體中均含有大量揮發(fā)性成分，且以內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液中揮發(fā)性成分較多，其中含量最高的揮發(fā)性成分是2-苯基乙醇。2-苯基乙醇是一種重要的玫瑰香型風味物質(zhì)，在飲料[23]、化妝品[24]中應用較多，同時，也因其具有抗腫瘤[25]、抑菌[26]、強心[27]等的作用在醫(yī)藥衛(wèi)生領域也有重要應用；此外，內(nèi)生真菌RP2所含的芥酰胺是內(nèi)源性大麻素類似物，能夠調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有抗抑郁和抗焦慮的能力[28]；而甘草內(nèi)生真菌RP2所產(chǎn)的揮發(fā)性成分尼克酰胺[29]在治療急性髓細胞白血病(AML)等方面有重要作用，可以在保留正常造血干細胞的同時，選擇性的清除白血病干細胞(LSCs)。

關于植物內(nèi)生菌揮發(fā)性成分分析，已有報道。萬璐等[30]以分離自黃芪根部的枯草芽孢桿菌HS8為研究對象，利用氣相色譜－質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術對其進行揮發(fā)性成分進行分析，在枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液中分離并鑒定了21種揮發(fā)性成分；在枯草芽孢桿菌HS8菌絲體中分離并鑒定了18種揮發(fā)性成分。由于甘草屬于瀕危的藥用植物，所以針對于甘草內(nèi)生菌的揮發(fā)性成分也做了一些研究，許哲祥等[31]采用GC-MS用技術對甘草內(nèi)生真菌GRE9發(fā)酵液和菌絲體揮發(fā)性成分進行分析，在甘草內(nèi)生真菌GRE9菌株發(fā)酵液中分離并鑒定了13個揮發(fā)性成分，在甘草內(nèi)生真菌GRE9菌絲體中分離并鑒定了7個揮發(fā)性成分。

一直被作為生物活性物質(zhì)來源的植物內(nèi)生真菌，從其發(fā)酵液中提取分離生物活性物質(zhì)一直是研究的熱點[32]，但對其揮發(fā)性成分研究甚少。本研究分析結(jié)果說明，甘草內(nèi)生真菌RP2能夠產(chǎn)生多種現(xiàn)有工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用的揮發(fā)性香味成分，如2-苯基乙醇等，所以其在新型天然香精香料生產(chǎn)中具有較好的應用前景，同時，分析結(jié)果也提示，甘草內(nèi)生真菌RP2發(fā)酵液中也含有一些具有重要開發(fā)應用價值的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，該結(jié)果可為綜合開發(fā)利用內(nèi)生真菌RP2揮發(fā)性代謝物奠定基礎。