黃晨,楊悅，李紅俠

宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是與宮頸浸潤(rùn)癌發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)的癌前病變，根據(jù)病灶浸潤(rùn)范圍和異型程度分為CINⅠ～Ⅲ級(jí)，其中CINⅠ級(jí)可在1～2年內(nèi)自行消退，CINⅡ～Ⅲ級(jí)進(jìn)展為宮頸癌的概率則分別為5%和12%，因此其早期識(shí)別和治療對(duì)預(yù)防宮頸癌發(fā)生具有重要意義[1]。近年來(lái)隨著醫(yī)學(xué)水平快速發(fā)展，CIN早期篩查工作取得明顯進(jìn)展，同時(shí)冷刀錐切術(shù)(cold-knife conization，CKC)和宮頸環(huán)形電切術(shù)(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)等微創(chuàng)手術(shù)治療水平也獲得明顯提升，有效率可超過(guò)90%，但術(shù)后病灶殘留和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)仍然較高，且有研究認(rèn)為復(fù)發(fā)患者更容易進(jìn)展為宮頸癌[2-4]。人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是人體具有高度多態(tài)性的同種異體抗原，其中HLA-E和HLA-G均屬于非經(jīng)典型主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子，正常情況下表達(dá)水平較低，近年來(lái)研究表明其在多種腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。本研究主要分析CIN患者血清和腫瘤組織中HLA-E、HLA-G表達(dá)水平及其與臨床病理特征和術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，現(xiàn)將具體結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年5月至2016年5月民航總醫(yī)院492例CIN患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：① 經(jīng)宮頸多點(diǎn)病理活檢確診為CIN；② 年齡18～80歲；③ 均接受CKC或LEEP手術(shù)且術(shù)后隨訪時(shí)間≥1年；④ 患者及家屬知曉本研究?jī)?nèi)容并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 合并其它生殖系統(tǒng)疾病；② 合并其它部位惡性腫瘤；③ 入組前已接受放化療或免疫治療者；④ 妊娠期或產(chǎn)褥期女性；⑤ 既往接受子宮全切或其它宮頸錐切術(shù)治療。

1.2 研究方法

1.2.1 血清HLA-E和HLA-G水平檢測(cè) 采集CIN患者入院第1天空腹外周靜脈血3 mL并以3 000 r/min離心10 min，取上清-20℃保存?zhèn)溆?，采用ELISA法(試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司)檢測(cè)HLA-E和HLA-G水平，所有操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求完成。

1.2.2 CIN病灶HLA-E和HLA-G水平檢測(cè) 收集CIN患者術(shù)后組織標(biāo)本并以4%甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋后制作厚度5 μm連續(xù)切片，采用二甲苯脫蠟后置于PBS緩沖液中溫育4～8 h，然后采用無(wú)水乙醇、95%和50%濃度乙醇按梯度脫水，檸檬酸鹽修復(fù)并充分暴露抗原決定簇，3%雙氧水室溫浸泡10 min進(jìn)行封閉，然后分別加入鼠抗人HLA-E單克隆抗體和鼠抗人HLA-G單克隆抗體(北京奧維亞生物技術(shù)有限公司)并于4℃條件孵育過(guò)夜，第2天沖洗干凈后加入通用型二抗試劑盒(美國(guó)Abcam公司)并室溫孵育30 min后采用DAB試劑盒(上海長(zhǎng)島試劑公司)顯色，2～5 min后終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染1.5～2.0 min，然后以梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，以PBS緩沖液代替HLA-E和HLA-G一抗進(jìn)行蘇木素復(fù)染為陰性對(duì)照，觀察胞質(zhì)HLA-E和HLA-G表達(dá)情況，根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算HLA-E和HLA-G相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 人乳頭瘤病毒檢測(cè)和分型 分別取CIN病理標(biāo)本研碎以1.5 mL離心管保存，加入裂解液150 μL并以12 000 r/min離心5 min，去除上清液，加入DNA提取液50 μL，充分震蕩混勻后加熱至100℃，10 min后以13 000 r/min離心10 min，取中間層DNA溶液進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用人乳頭瘤病毒(human papillomavirus ，HPV)分型試劑盒(深圳亞能生物技術(shù)有限責(zé)任公司)進(jìn)行檢測(cè)，該試劑盒可同時(shí)檢測(cè)28種亞型，包括23種高危型和5種低危型，測(cè)量樣本相對(duì)發(fā)光單位(RLU)和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照組臨界值(CO)，計(jì)算RLU/CO比值并以其值≥1為陽(yáng)性。

1.2.4 患者信息采集和分析 患者入院后詳細(xì)采集基本資料、病史和婚育史，完善相關(guān)檢查，明確診斷并評(píng)估CIN分級(jí)，然后結(jié)合患者基礎(chǔ)健康水平和自身意愿進(jìn)行CKC或LEEP手術(shù)，術(shù)后門診隨訪至少1年，1年內(nèi)每3個(gè)月1次，1年后每6個(gè)月1次，復(fù)查時(shí)完成陰道鏡、宮頸細(xì)胞學(xué)和HPV檢測(cè)，以術(shù)后6個(gè)月內(nèi)發(fā)現(xiàn)宮頸CIN為病灶殘留，6個(gè)月后發(fā)現(xiàn)宮頸CIN為復(fù)發(fā)，隨訪期間連續(xù)兩次檢測(cè)宮頸細(xì)胞學(xué)均無(wú)明顯異常為無(wú)殘留或復(fù)發(fā)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CIN患者血清HLA-E和HLA-G水平與臨床病理特征的關(guān)系

CIN患者血清HLA-E和HLA-G水平隨CIN分級(jí)增加和高危HPV感染轉(zhuǎn)陽(yáng)明顯升高(P<0.05)，年齡、孕次和產(chǎn)次等其他臨床病理資料不同的患者血清HLA-E和HLA-G水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 CIN患者血清HLA-E和HLA-G水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 CIN患者病灶HLA-E和HLA-G水平與臨床病理特征的關(guān)系

CIN患者病灶中HLA-E和HLA-G水平隨CIN分級(jí)增加和高危HPV感染轉(zhuǎn)陽(yáng)明顯升高(P<0.05)，年齡、孕次和產(chǎn)次等其他臨床病理資料不同的患者病灶中HLA-E和HLA-G水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 CIN患者病灶HLA-E和HLA-G水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 CIN患者血清和病灶HLA-E和HLA-G水平與術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

本研究中位隨訪時(shí)間為54(18～72)個(gè)月，結(jié)果顯示492例CIN患者術(shù)后復(fù)發(fā)37例(7.52%)，復(fù)發(fā)組血清和病灶HLA-E和HLA-G水平高于非復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)下頁(yè)表3。

表3 CIN患者血清和病灶HLA-E和HLA-G水平與術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

2.4 血清和病灶HLA-E和HLA-G水平對(duì)CIN術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

血清HLA-E、HLA-G水平及兩者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)CIN術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC分別為0.690、0.709和0.865，病灶HLA-E、HLA-G水平及兩者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)CIN術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC分別為0.849、0.891和0.906，詳見(jiàn)下頁(yè)表4、圖1(見(jiàn)彩插3)。

表4 血清和病灶HLA-E和HLA-G水平對(duì)CIN術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

3 討論

宮頸癌是女性發(fā)病率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤，統(tǒng)計(jì)顯示全球每年新增患者約53萬(wàn)，同時(shí)約27.5萬(wàn)患者因此死亡，在女性癌因性死亡中占比為9%[6]。宮頸癌80%分布于發(fā)展中國(guó)家，其中我國(guó)患病率和死亡率均居于世界前列，且近年來(lái)發(fā)病率逐漸升高并趨于年輕化[7]。近年來(lái)研究表明宮頸癌發(fā)生和進(jìn)展是一個(gè)復(fù)雜的漸變性過(guò)程，癌前病變主要表現(xiàn)為CIN，因此對(duì)CIN進(jìn)行準(zhǔn)確診斷和治療是預(yù)防宮頸癌的有效方法，目前主要依據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)篩查和病理學(xué)檢查對(duì)CIN進(jìn)行診斷，主觀性較強(qiáng)且可重復(fù)性偏低，故積極尋找更為準(zhǔn)確、安全和易行的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)具有重要意義[8]。

機(jī)體免疫功能異常與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，其中HLA-E和HLA-G在介導(dǎo)免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，正常情況下與抑制型受體CD94/NKG2A的親和力較激活型受體CD94/NKG2C更強(qiáng)，因此有利于靶細(xì)胞免除自然殺傷細(xì)胞的殺傷作用，對(duì)維持免疫功能穩(wěn)定和機(jī)體正常生理功能具有重要意義[9]。文獻(xiàn)報(bào)道HLA-E和HLA-G異常表達(dá)對(duì)自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞以及T細(xì)胞的影響大致相近，均可與細(xì)胞表面受體結(jié)合而造成免疫抑制，且兩者還可產(chǎn)生協(xié)同作用，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，此外可溶性HLA-E和HLA-G還可經(jīng)外周血循環(huán)作用于全身各組織器官并引起免疫抑制[10-12]。近年來(lái)研究表明卵巢癌[13]、口腔癌[14]和宮頸癌[15]等惡性腫瘤患者血清HLA-E和HLA-G水平明顯升高，提示HLA-E和HLA-G對(duì)免疫功能的負(fù)性調(diào)控機(jī)制可參與多種惡性腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程。CIN為宮頸癌前病變，張莉等[16]報(bào)道顯示宮頸組織中HLA-E和HLA-G表達(dá)水平隨宮頸癌病變程度增加而升高，且可與HPV感染共同作用，參與宮頸癌發(fā)生和進(jìn)展。本研究分析CIN患者血清和病灶中HLA-E和HLA-G表達(dá)水平，結(jié)果顯示均隨CIN分級(jí)增加和高危HPV感染明顯升高，表明兩者均可能參與CIN發(fā)病，其作用機(jī)制與啟動(dòng)CD8+T細(xì)胞下游信號(hào)并抑制免疫細(xì)胞活化有關(guān)，同時(shí)本研究中CIN患者外周血HLA-E和HLA-G表達(dá)水平與病灶組織具有一致性，因此通過(guò)檢測(cè)血清HLA-E和HLA-G即可為判斷CIN病情嚴(yán)重程度提供參考信息。

HPV感染是宮頸癌重要危險(xiǎn)因素，目前已發(fā)現(xiàn)100多種HPV亞型，且可致病者達(dá)30種以上，其中高危型HPV可將自身DNA整合到宿主基因組中并導(dǎo)致細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性明顯下降，發(fā)生癌變風(fēng)險(xiǎn)大幅度增加[17]。張倩等[18]開(kāi)展的一項(xiàng)包含1997例35～45歲女性的宮頸癌篩查隊(duì)列調(diào)查顯示高危型HPV感染者發(fā)生中度及以上CIN的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高。本研究492例CIN患者中合并高危型HPV感染者319例，合并高危型HPV感染者血清和病灶HLA-E和HLA-G表達(dá)水平明顯升高。Swets等[19]研究認(rèn)為HPV E6蛋白可與p53結(jié)合并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)p53又可參與調(diào)節(jié)HLA-G表達(dá)，從而參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。Tawfeek等[20]等報(bào)道顯示HLA-E可促進(jìn)核因子-κB(NF-κB)靶基因cIAP1和cIAP2表達(dá)，HPV18 E6可參與調(diào)節(jié)NF-κB磷酸化，從而產(chǎn)生抗凋亡作用，可見(jiàn)高危型HPV感染與HLA-E和HLA-G在CIN和宮頸癌的發(fā)病中的作用機(jī)制具有相同之處。

CIN術(shù)后容易復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)患者進(jìn)展為宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高，既往研究表明其危險(xiǎn)因素包括病理分級(jí)、持續(xù)HPV感染及腺體受累等[21]。本研究492例CIN患者中位隨訪時(shí)間為54(18～72)個(gè)月，結(jié)果顯示術(shù)后復(fù)發(fā)37例(7.52%)，且復(fù)發(fā)組血清和病灶HLA-E和HLA-G水平高于非復(fù)發(fā)組，提示HLA-E和HLA-G表達(dá)水平較高的患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高，其原因可能與機(jī)體免疫抑制狀態(tài)有關(guān)，因此檢測(cè)HLA-E和HLA-G可為評(píng)估CIN術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)提供參考信息，從而有利于臨床采取合理治療策略。本研究結(jié)果顯示血清HLA-E、HLA-G水平預(yù)測(cè)CIN術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC分別為0.690和0.709和0.865，相較CIN病灶HLA-E和HLA-G預(yù)測(cè)價(jià)值偏低，可能是因?yàn)椴糠諧IN患者HLA-E和HLA-G在外周血與病灶中表達(dá)水平不完全一致，但兩者聯(lián)合檢測(cè)AUC達(dá)0.865，敏感度和特異度分別為75.68%和84.18%，與病灶HLA-E和HLA-G聯(lián)合預(yù)測(cè)價(jià)值相近，表明通過(guò)檢測(cè)血清HLA-E和HLA-G水平來(lái)預(yù)測(cè)CIN術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)具有良好可行性，且該方法簡(jiǎn)便易行，安全無(wú)創(chuàng)，尤其適用于術(shù)后長(zhǎng)期隨訪。

綜上所述，CIN患者血清和病灶HLA-E和HLA-G表達(dá)水平均與CIN分級(jí)、高危型HPV感染和術(shù)后復(fù)發(fā)存在密切聯(lián)系，且檢測(cè)血清HLA-E和HLA-G能為預(yù)測(cè)CIN術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)提供參考信息。