梁 倩，包濤濤,3，鮮思美,2，楊 倩，李鵬飛，顧慶林，鄭維豪，杜 鵬，青成欣

（1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究所，貴陽 550025；3.貴州省黔東南州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，黔東南 556000）

羊口瘡是由羊口瘡病毒（Orf virus,OrfV）引起的多發(fā)于綿羊和山羊中的一種急性、嗜上皮性的人獸共患傳染病，該病呈高度接觸性傳染，發(fā)病率高，在世界各地均有分布，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，同時嚴重威脅公共衛(wèi)生安全。OrfV隸屬于痘病毒科副痘病毒屬，是基因組龐大的線性雙鏈DNA病毒[1]。F1L蛋白由F1L基因編碼，是OrfV的囊膜蛋白，在病毒吸附和侵入過程中可促進宿主細胞膜與病毒外膜的融合，增強OrfV的傳播，因此研究者常將F1L基因作為檢測OrfV的重要靶標[2]。目前針對OrfV的檢測方法有間接免疫熒光試驗（IFA）、病毒中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、PCR及其衍生技術(shù)等[3]。通常只有活病毒才具有毒力和致病能力，潛在威脅動物安全，但上述方法主要針對OrfV的抗原抗體反應特異性和引物特異性進行，并不能檢測病毒的感染活性。另外，用于病毒分離、增殖的細胞培養(yǎng)技術(shù)，依賴于細胞病變效應（CPE）的觀察，但常因試驗條件、操作人員技術(shù)不規(guī)范，以及某些地區(qū)的弱毒性分離株，導致病毒分離時無CPE現(xiàn)象產(chǎn)生[4]。目前實驗室診斷常用的實時熒光定量PCR技術(shù)是通過實時檢測擴增DNA的熒光信號來定量病原[5]，此類方法常因檢測到環(huán)境或樣品中游離的病毒基因組而導致假陽性，從而誤判樣本的感染性，誤診動物的健康狀況。因此，針對具有感染活性OrfV的快速檢測方法的建立及應用對有效預防羊口瘡的發(fā)生發(fā)展及公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）是一種具有光敏性、高親和力的新型核酸交聯(lián)染料，在光作用下可產(chǎn)生一類氮烯類物質(zhì)與DNA分子共價交聯(lián)，從而抑制病毒核酸的PCR擴增[6]。PMA不能滲透膜結(jié)構(gòu)完整的活病毒，而病毒失活后PMA可透過受損膜有效修飾曝露出的病毒DNA，并與之形成穩(wěn)定共價氮碳鍵，進而阻斷失活病毒DNA分子的PCR擴增，但活病毒的核酸擴增不受抑制，從而實現(xiàn)活病毒與失活病毒的區(qū)分[7]。近年來，PMA與常規(guī)PCR聯(lián)合的檢測方法較多應用于生物醫(yī)學檢測[8]，基于PCR檢測技術(shù)操作簡單、快速、低成本且適于大批樣品檢測等優(yōu)點，本研究利用PMA染料聯(lián)合PCR技術(shù)，以F1L基因為靶標檢測基因，建立活OrfV的PMA-PCR檢測方法，以期為有效評估病毒致病性的相關工作提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

口蹄疫病毒（FMDV）、綿羊痘病毒（SPPV）、山羊痘病毒（GTPV）、羊口瘡病毒大足株（OrfV-DZ，TCID50=10-5.68/0.1 mL）、羔羊睪丸細胞（LT）均由貴州大學預防獸醫(yī)學實驗室保存；病毒基因組提取試劑盒、50×TAE Buffer均購自QIAGEN公司；PMA染料購自Biotium公司；GoldView核酸染料購自Biodee公司；2×Easy Mix和DL2000 DNA Marker均購自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司；FBS和胰蛋白酶均購自Gibco公司；500 W鹵素燈購自Philips公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的OrfV全基因序列（登錄號：HM133903.1），利用軟件Primer Premier 6.0設計1對擴增F1L基因的特異性引物，F(xiàn)1L-F：5′-GCACTTC-TTCACGGACAT-3′；F1L-R：5′-GTCATGTAGG-TCTCCTTGAG-3′，預期擴增長度約為246 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 OrfV病毒懸液的熱處理 取4支各裝有500 μL OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）的離心管，分別置于50、60、70和80 ℃熱水浴中處理10 min后，迅速置冰上冷卻，吸取200 μL病毒懸液接種于6孔板中已培養(yǎng)至單層的LT細胞，吸附1 h后更換含2% FBS的DMEM營養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察是否有CPE出現(xiàn)，比較確定OrfV的最佳熱滅活溫度。

1.2.3 PMA曝光時間優(yōu)化 取6支各裝有500 μL熱滅活OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）的離心管，分別加入PMA溶液使其終濃度為20 μmol/L，樣品振蕩混勻后避光冰上孵育10 min，于距鹵素燈20 cm遠處分別將樣品曝光0、5、10、15、20和25 min，離心管每隔2～3 min進行顛倒混勻。同時設置不加PMA的熱滅活OrfV-DZ病毒懸液為陽性對照組，以ddH2O代替病毒為陰性對照組，經(jīng)PCR檢測選擇最佳曝光時間。以病毒基因組提取試劑盒提取病毒DNA。PCR反應體系25 μL：DNA模板5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Easy Mix 12.5 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 完全抑制熱滅活OrfV PCR擴增的最小PMA濃度確定 取6支裝有500 μL熱滅活OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）的離心管，分別加PMA工作液使其終濃度為0、5、10、15、20、25 μmol/L，振蕩混勻后于暗處孵育10 min；樣品離心管于冰上參照上述優(yōu)化確定的最佳曝光時間經(jīng)鹵素燈照射處理后進行PCR擴增。設置不加PMA溶液的熱滅活OrfV-DZ病毒懸液為陽性對照組，ddH2O代替病毒樣本為陰性對照組，確定完全抑制熱滅活OrfV PCR擴增的最小PMA濃度。

1.2.5 不抑制活OrfV PCR擴增的最大PMA濃度確定 取7支各裝有500 μL活OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）的離心管，分別加入PMA工作液使其終濃度為20、25、30、35、40、45、50 μmol/L，振蕩混勻后暗處孵育10 min；于冰上經(jīng)鹵素燈光照后進行PCR操作。同時設置不加PMA的陽性對照組，ddH2O代替病毒樣本的陰性對照組，確定不抑制活OrfV基因組PCR擴增的最大PMA濃度。

1.2.6 PMA-PCR特異性試驗 分別提取FMDV、SPPV、GTPV基因組，經(jīng)上述優(yōu)化確定的PMA作用條件處理后作為模板，進行常規(guī)PCR擴增，同時設置以OrfV基因組為模板的陽性對照組及以ddH2O為模板的陰性對照組，檢測分析所建立PMA-PCR方法的特異性。

1.2.7 不同比例活/熱滅活OrfV混合樣品的PMA-PCR檢測 設計2組由不同比例熱滅活、活OrfV組成的病毒懸液，混合比例見表1。第1組分別取0.25 mL固定滴度的熱滅活OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）與不同滴度活OrfV病毒懸液等體積混合；第2組分別取0.25 mL固定滴度活OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）與不同滴度熱滅活OrfV病毒懸液等體積混合均勻。按上述優(yōu)化后的PMA工作濃度及最佳曝光時間處理樣本后進行PCR擴增，同時設置不加PMA溶液的陽性對照組和ddH2O代替病毒樣本的陰性對照組。

表1 活/熱滅活OrfV的混合比例Table 1 Mixing ratio of active and heat-inactivated OrfV

2 結(jié) 果

2.1 OrfV熱滅活溫度確定

OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）于不同溫度熱水浴處理后接種LT細胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后觀察，由圖1可知，50 ℃熱水浴處理病毒后接種細胞，細胞變圓、皺縮，而60 ℃以上熱水浴處理病毒后感染細胞，細胞呈長梭形，并未明顯出現(xiàn)CPE。 因此，OrfV-DZ（TCID50=10-5.68/0.1 mL）經(jīng)60 ℃以上溫度水浴處理10 min即被滅活。

A～D，50、60、70、80 ℃圖1 OrfV熱滅活溫度確定（100×）Fig.1 Determination of thermal inactivation temperature of OrfV （100×）

2.2 PMA最佳曝光時間確定

熱滅活OrfV經(jīng)PMA處理，分別曝光0、5、10、15、20、25 min后，提取病毒基因組進行PCR擴增，結(jié)果見圖2。由圖2可知，曝光時間越長，DNA條帶亮度越弱，當曝光15 min時條帶消失，表明DNA擴增完全被抑制，即PMA與熱滅活OrfV的DNA共價交聯(lián)且溶液中游離PMA被完全光解的最佳曝光時間為15 min。

M,DL2000 DNA Marker;1,陽性對照;2,陰性對照;3～7,曝光時間分別為0、5、10、15、20 minM,DL2000 DNA Marker;1，Positive control;2,Negative control;3-7,Exposure time was 0,5,10,15 and 20 min,respectively圖2 PMA最佳曝光時間Fig.2 Best exposure time of PMA

2.3 完全抑制失活OrfV PCR擴增的最小PMA濃度確定

由圖3可知，隨著PMA濃度的增加，PMA與熱滅活OrfV的DNA結(jié)合越多，條帶亮度逐漸變?nèi)?。當PMA濃度達到20 μmol/L時，條帶亮度消失，表明熱滅活OrfV的PCR擴增被完全抑制，即熱滅活OrfV的PCR擴增被完全抑制的最小PMA工作濃度為20 μmol/L。

M,DL2000 DNA Marker;1,陽性對照;2,陰性對照;3～8,PMA濃度分別為0、5、10、15、20和25 μmol/LM,DL2000 DNA Marker;1,Positive control;2,Negative control;3-8,PMA concentrations were 0,5,10,15,20 and 25 μmol/L,respectively圖3 完全抑制OrfV PCR擴增的最小PMA濃度Fig.3 Minimum PMA concentration for complete inhibition of OrfV PCR amplification

2.4 不抑制活OrfV PCR擴增的最大PMA濃度確定

由圖4可知，當PMA濃度為15～35 μmol/mL時，擴增條帶亮度無差異，說明PMA對活OrfV的PCR擴增無明顯的抑制作用；當PMA濃度達到40 μmol/mL時，擴增條帶亮度消失，表明PMA對活OrfV PCR擴增的抑制作用較強。 因此，選擇不抑制活OrfV PCR擴增的最大PMA濃度為35 μmol/L。

M,DL2000 DNA Marker;1,陽性對照;2,陰性對照;3～9,PMA濃度分別為15、20、25、30、35、40和45 μmol/LM,DL2000 DNA Marker;1,Positive control;2,Negative control;3-9,PMA concentrations were 15,20,25,30,35,40 and 45 μmol/L,respectively圖4 不抑制OrfV PCR擴增的最大PMA濃度Fig.4 Maximum PMA concentration did not inhibit the PCR amplification of OrfV

2.5 特異性試驗

由圖5可知，僅OrfV有特異性擴增條帶，其余病毒基因組及陰性對照組均無條帶出現(xiàn)，表明所建立的PMA-PCR檢測方法具有較強的特異性。

M,DL2000 DNA Marker;1,陰性對照;2,羊口瘡病毒;3,山羊痘病毒;4,綿羊痘病毒;5,口蹄疫病毒M,DL2000 DNA Marker;1,Negative control;2,OrfV;3,GTPV;4,SPPV;5,FMDV圖5 PMA-PCR特異性試驗結(jié)果Fig.5 PMA-PCR specificity test results

2.6 不同比例活/熱滅活OrfV混合病毒懸液樣本檢測

應用PCR檢測驗證PMA對活OrfV/熱滅活OrfV混合樣品的影響作用，結(jié)果見圖6、7。當不同數(shù)量的活OrfV與固定數(shù)量的熱滅活OrfV病毒懸液混合時，經(jīng)PMA處理后DNA擴增條帶亮度隨活OrfV濃度減少而漸弱，且活OrfV濃度為10-0.68TCID50/0.1 mL時，條帶亮度完全消失（圖6）；當固定數(shù)量活OrfV與不同數(shù)量的熱滅活OrfV病毒懸液混合時，條帶亮度均勻一致（圖7），說明熱滅活OrfV的擴增被完全抑制，而活OrfV的PCR擴增不受影響。因此，在含有不同比例的滅活、活OrfV的病毒懸液中，20 μmol/L PMA可完全抑制失活OrfV基因組的PCR擴增，且活OrfV不受抑制，檢測的靈敏度達10-1.68TCID50/0.1 mL。

M，DL2000 DNA Marker;1，陽性對照;2，陰性對照,3～9，病毒滴度分別為10-5.68、10-4.68、10-3.68、10-2.68、10-1.68、10-0.68和100 TCID50/0.1 mL。圖7同M，DL2000 DNA Marker;1,Positive control;2,Negative control;3-9,Virus titer was 10-5.68,10-4.68,10-3.68,10-2.68,10-1.68,10-0.68 and 100 TCID50/0.1 mL，respectively.The same as fig.7圖6 固定數(shù)量滅活病毒與變化數(shù)量活病毒混合液PMA-PCR擴增Fig.6 PMA-PCR amplification of a fixed number of inactivated viruses and varying amounts of active virus mixture

圖7 固定數(shù)量活病毒與變化數(shù)量滅活病毒混合液PMA-PCR擴增Fig.7 PMA-PCR amplification of a fixed amount of active virus and varying amount of inactivated virus mixture

3 討 論

由于活病毒具有傳染性并能引起疾病，因此在畜牧獸醫(yī)行業(yè)中，活病毒的檢測才是檢驗衛(wèi)生程序和生物危害防控的關鍵。利用現(xiàn)有的疊氮類染料選擇性檢測活病毒的基礎是其對膜結(jié)構(gòu)不完整的失活病毒具有膜滲透性，從而結(jié)合抑制失活病毒基因組的擴增。囊膜的主要功能是協(xié)助病毒進入宿主細胞，促進病毒在宿主細胞內(nèi)的增殖，提高病毒的致病性[9]；衣殼是病毒的蛋白質(zhì)外殼，其作用是包裹保護病毒核酸，參與協(xié)助病毒感染[10]。單疊氮化乙錠（ethidium monoazide，EMA）和單疊氮化丙錠（propidium monoazide,PMA）作為核酸結(jié)合染料，均可滲透穿過失活病毒受損的囊膜、衣殼，經(jīng)光活化后共價結(jié)合暴露出的病毒DNA與之發(fā)生交聯(lián)反應，從而抑制或消除失活病毒基因組的擴增[11]。但Flekna等[12]研究表明,EMA能部分滲入活病毒內(nèi)，導致病毒DNA分子和EMA之間的交聯(lián)，造成活細胞中病毒基因組及PCR擴增信號的損失，易導致假陰性。PMA由于不能進入完整病毒囊膜或衣殼，可將其作為替代性非膜滲透核酸染料，較EMA更適合用于病毒的活性檢測。常用于OrfV檢測的靶標主要有B2L和F1L基因，B2L基因主要在病毒感染后期編碼免疫原性蛋白，增強病毒毒力，協(xié)助病毒的增殖擴散[13]；F1L基因編碼的F1L蛋白具有肝素受體結(jié)合活性，在病毒吸附及入侵過程中起重要作用[14]，且F1L蛋白在病毒表面具有特異性抗原決定簇，是OrfV單克隆抗體主要結(jié)合位點蛋白，對于OrfV具有重要研究意義[15]。因此，本研究選用F1L基因作為靶標來建立針對活OrfV的PMA-PCR檢測方法。

PMA與病毒基因組共價結(jié)合可能受到病毒本身、與光源的距離、曝光時間、樣本本身性質(zhì)等多種因素的影響，本研究通過優(yōu)化病毒滅活時間、曝光時間和PMA工作濃度來建立具有最佳工作效率的PMA-PCR檢測方法。PMA的濃度影響其與DNA分子的結(jié)合效率，PMA濃度過低，則DNA不能被完全結(jié)合，無法抑制失活病毒的PCR擴增，濃度過高則會影響活病毒的擴增[16]。因此，應用PMA進行檢測要保證PMA的量可以與全部失活病毒的DNA結(jié)合，同時還不會對活病毒產(chǎn)生影響[17]。本研究對PMA作用濃度進行優(yōu)化，得到最佳反應濃度為20 μmol/L，在此工作濃度下PMA可完全抑制失活病毒的PCR擴增，而對活病毒的基因擴增無影響。PMA的作用還受曝光時間影響，于光照作用下未完全與失活病毒DNA結(jié)合的PMA可與水分子充分反應生成羥胺，后者無法與病毒DNA分子結(jié)合，即不抑制活病毒基因組擴增[18]，所以要求試驗過程中PMA染料的添加及孵育均需在避光條件下進行。本研究對曝光時間優(yōu)化，結(jié)果表明將PMA曝光10 min，即可使PMA最大程度抑制失活病毒DNA的PCR擴增，且活病毒基因組有效擴增。

目前，PMA-PCR技術(shù)已廣泛應用于多種類型活病毒的選擇性檢測。Fittipaldi等[19]在110 ℃下進行PMA滅活預處理后，PMA與噬菌體T4病毒的DNA有效結(jié)合，聯(lián)合PCR擴增對熱滅活病毒和活病毒進行區(qū)分，同時通過衣殼損傷監(jiān)測確定了導致病毒失活的因素。Gloria等[20]分別使用PMA和RNase預處理熱滅活病毒樣本，通過實時熒光定量RT-PCR對甲型肝炎病毒做定量檢測，結(jié)果表明，PMA處理在區(qū)分具有感染性的病毒和滅活病毒方面比RNase處理效果顯著。Sandhya等[21]將PMA結(jié)合RT-PCR用于確定腸道RNA病毒在水中的傳染性，有效檢測存在于環(huán)境基質(zhì)中的傳染性脊髓灰質(zhì)炎病毒和非傳染性病毒，較常規(guī)的PCR檢測和細胞培養(yǎng)結(jié)果更具可信性。在某些情況下，失活病原體脂蛋白膜結(jié)構(gòu)仍完整，Nocker等[22]研究結(jié)果表明，紫外線通過誘導DNA損傷而不直接影響膜通透性來影響活力，PMA并不能監(jiān)測紫外照射后病原活力的喪失。因此疊氮類染料檢測在核酸擴增分析中的應用應謹慎，建議僅用于通過損傷細胞壁或改變細胞膜完整性而使微生物細胞失活的方法，而對于不同病毒的適用性仍有待研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)60 ℃熱水浴10 min可完全滅活OrfV；當PMA濃度達20 μmol/L時即可完全抑制熱滅活OrfV的PCR擴增；當PMA濃度超過35 μmol/L即會對OrfV的PCR擴增產(chǎn)生一定的抑制作用；且所建立的PMA-PCR檢測方法只對活OrfV的DNA特異擴增，在不同滴度比例混合的病毒懸液中PMA對活OrfV的檢測靈敏度為10-1.68TCID50/0.1 mL。 本試驗所建立的PMA-PCR檢測方法敏感特異，對活OrfV的檢測有效可行。