梁 倩，包濤濤,3，鮮思美,2，楊 倩，李鵬飛，顧慶林，鄭維豪，杜 鵬，青成欣

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究所，貴陽 550025；3.貴州省黔東南州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，黔東南 556000）

羊口瘡是由羊口瘡病毒（Orf virus,OrfV）引起的多發(fā)于綿羊和山羊中的一種急性、嗜上皮性的人獸共患傳染病，該病呈高度接觸性傳染，發(fā)病率高，在世界各地均有分布，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，同時嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。OrfV隸屬于痘病毒科副痘病毒屬，是基因組龐大的線性雙鏈DNA病毒[1]。F1L蛋白由F1L基因編碼，是OrfV的囊膜蛋白，在病毒吸附和侵入過程中可促進(jìn)宿主細(xì)胞膜與病毒外膜的融合，增強(qiáng)OrfV的傳播，因此研究者常將F1L基因作為檢測OrfV的重要靶標(biāo)[2]。目前針對OrfV的檢測方法有間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、PCR及其衍生技術(shù)等[3]。通常只有活病毒才具有毒力和致病能力，潛在威脅動物安全，但上述方法主要針對OrfV的抗原抗體反應(yīng)特異性和引物特異性進(jìn)行，并不能檢測病毒的感染活性。另外，用于病毒分離、增殖的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，依賴于細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的觀察，但常因試驗(yàn)條件、操作人員技術(shù)不規(guī)范，以及某些地區(qū)的弱毒性分離株，導(dǎo)致病毒分離時無CPE現(xiàn)象產(chǎn)生[4]。目前實(shí)驗(yàn)室診斷常用的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是通過實(shí)時檢測擴(kuò)增DNA的熒光信號來定量病原[5]，此類方法常因檢測到環(huán)境或樣品中游離的病毒基因組而導(dǎo)致假陽性，從而誤判樣本的感染性，誤診動物的健康狀況。因此，針對具有感染活性O(shè)rfV的快速檢測方法的建立及應(yīng)用對有效預(yù)防羊口瘡的發(fā)生發(fā)展及公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）是一種具有光敏性、高親和力的新型核酸交聯(lián)染料，在光作用下可產(chǎn)生一類氮烯類物質(zhì)與DNA分子共價交聯(lián)，從而抑制病毒核酸的PCR擴(kuò)增[6]。PMA不能滲透膜結(jié)構(gòu)完整的活病毒，而病毒失活后PMA可透過受損膜有效修飾曝露出的病毒DNA，并與之形成穩(wěn)定共價氮碳鍵，進(jìn)而阻斷失活病毒DNA分子的PCR擴(kuò)增，但活病毒的核酸擴(kuò)增不受抑制，從而實(shí)現(xiàn)活病毒與失活病毒的區(qū)分[7]。近年來，PMA與常規(guī)PCR聯(lián)合的檢測方法較多應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測[8]，基于PCR檢測技術(shù)操作簡單、快速、低成本且適于大批樣品檢測等優(yōu)點(diǎn)，本研究利用PMA染料聯(lián)合PCR技術(shù)，以F1L基因?yàn)榘袠?biāo)檢測基因，建立活OrfV的PMA-PCR檢測方法，以期為有效評估病毒致病性的相關(guān)工作提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

口蹄疫病毒（FMDV）、綿羊痘病毒（SPPV）、山羊痘病毒（GTPV）、羊口瘡病毒大足株（OrfV-DZ，TCID50=10-5.68/0.1 mL）、羔羊睪丸細(xì)胞（LT）均由貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；病毒基因組提取試劑盒、50×TAE Buffer均購自QIAGEN公司；PMA染料購自Biotium公司；GoldView核酸染料購自Biodee公司；2×Easy Mix和DL2000 DNA Marker均購自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司；FBS和胰蛋白酶均購自Gibco公司；500 W鹵素?zé)糍徸訮hilips公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的OrfV全基因序列（登錄號：HM133903.1），利用軟件Primer Premier 6.0設(shè)計1對擴(kuò)增F1L基因的特異性引物，F(xiàn)1L-F：5′-GCACTTC-TTCACGGACAT-3′；F1L-R：5′-GTCATGTAGG-TCTCCTTGAG-3′，預(yù)期擴(kuò)增長度約為246 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 OrfV病毒懸液的熱處理 取4支各裝有500 μL OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）的離心管，分別置于50、60、70和80 ℃熱水浴中處理10 min后，迅速置冰上冷卻，吸取200 μL病毒懸液接種于6孔板中已培養(yǎng)至單層的LT細(xì)胞，吸附1 h后更換含2% FBS的DMEM營養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察是否有CPE出現(xiàn)，比較確定OrfV的最佳熱滅活溫度。

1.2.3 PMA曝光時間優(yōu)化 取6支各裝有500 μL熱滅活OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）的離心管，分別加入PMA溶液使其終濃度為20 μmol/L，樣品振蕩混勻后避光冰上孵育10 min，于距鹵素?zé)?0 cm遠(yuǎn)處分別將樣品曝光0、5、10、15、20和25 min，離心管每隔2～3 min進(jìn)行顛倒混勻。同時設(shè)置不加PMA的熱滅活OrfV-DZ病毒懸液為陽性對照組，以ddH2O代替病毒為陰性對照組，經(jīng)PCR檢測選擇最佳曝光時間。以病毒基因組提取試劑盒提取病毒DNA。PCR反應(yīng)體系25 μL：DNA模板5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Easy Mix 12.5 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 完全抑制熱滅活OrfV PCR擴(kuò)增的最小PMA濃度確定 取6支裝有500 μL熱滅活OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）的離心管，分別加PMA工作液使其終濃度為0、5、10、15、20、25 μmol/L，振蕩混勻后于暗處孵育10 min；樣品離心管于冰上參照上述優(yōu)化確定的最佳曝光時間經(jīng)鹵素?zé)粽丈涮幚砗筮M(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)置不加PMA溶液的熱滅活OrfV-DZ病毒懸液為陽性對照組，ddH2O代替病毒樣本為陰性對照組，確定完全抑制熱滅活OrfV PCR擴(kuò)增的最小PMA濃度。

1.2.5 不抑制活OrfV PCR擴(kuò)增的最大PMA濃度確定 取7支各裝有500 μL活OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）的離心管，分別加入PMA工作液使其終濃度為20、25、30、35、40、45、50 μmol/L，振蕩混勻后暗處孵育10 min；于冰上經(jīng)鹵素?zé)艄庹蘸筮M(jìn)行PCR操作。同時設(shè)置不加PMA的陽性對照組，ddH2O代替病毒樣本的陰性對照組，確定不抑制活OrfV基因組PCR擴(kuò)增的最大PMA濃度。

1.2.6 PMA-PCR特異性試驗(yàn) 分別提取FMDV、SPPV、GTPV基因組，經(jīng)上述優(yōu)化確定的PMA作用條件處理后作為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，同時設(shè)置以O(shè)rfV基因組為模板的陽性對照組及以ddH2O為模板的陰性對照組，檢測分析所建立PMA-PCR方法的特異性。

1.2.7 不同比例活/熱滅活OrfV混合樣品的PMA-PCR檢測 設(shè)計2組由不同比例熱滅活、活OrfV組成的病毒懸液，混合比例見表1。第1組分別取0.25 mL固定滴度的熱滅活OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）與不同滴度活OrfV病毒懸液等體積混合；第2組分別取0.25 mL固定滴度活OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）與不同滴度熱滅活OrfV病毒懸液等體積混合均勻。按上述優(yōu)化后的PMA工作濃度及最佳曝光時間處理樣本后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時設(shè)置不加PMA溶液的陽性對照組和ddH2O代替病毒樣本的陰性對照組。

表1 活/熱滅活OrfV的混合比例Table 1 Mixing ratio of active and heat-inactivated OrfV

2 結(jié) 果

2.1 OrfV熱滅活溫度確定

OrfV-DZ病毒懸液（TCID50=10-5.68/0.1 mL）于不同溫度熱水浴處理后接種LT細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后觀察，由圖1可知，50 ℃熱水浴處理病毒后接種細(xì)胞，細(xì)胞變圓、皺縮，而60 ℃以上熱水浴處理病毒后感染細(xì)胞，細(xì)胞呈長梭形，并未明顯出現(xiàn)CPE。 因此，OrfV-DZ（TCID50=10-5.68/0.1 mL）經(jīng)60 ℃以上溫度水浴處理10 min即被滅活。

A～D，50、60、70、80 ℃圖1 OrfV熱滅活溫度確定（100×）Fig.1 Determination of thermal inactivation temperature of OrfV （100×）

2.2 PMA最佳曝光時間確定

熱滅活OrfV經(jīng)PMA處理，分別曝光0、5、10、15、20、25 min后，提取病毒基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。由圖2可知，曝光時間越長，DNA條帶亮度越弱，當(dāng)曝光15 min時條帶消失，表明DNA擴(kuò)增完全被抑制，即PMA與熱滅活OrfV的DNA共價交聯(lián)且溶液中游離PMA被完全光解的最佳曝光時間為15 min。

M,DL2000 DNA Marker;1,陽性對照;2,陰性對照;3～7,曝光時間分別為0、5、10、15、20 minM,DL2000 DNA Marker;1，Positive control;2,Negative control;3-7,Exposure time was 0,5,10,15 and 20 min,respectively圖2 PMA最佳曝光時間Fig.2 Best exposure time of PMA

2.3 完全抑制失活OrfV PCR擴(kuò)增的最小PMA濃度確定

由圖3可知，隨著PMA濃度的增加，PMA與熱滅活OrfV的DNA結(jié)合越多，條帶亮度逐漸變?nèi)酢．?dāng)PMA濃度達(dá)到20 μmol/L時，條帶亮度消失，表明熱滅活OrfV的PCR擴(kuò)增被完全抑制，即熱滅活OrfV的PCR擴(kuò)增被完全抑制的最小PMA工作濃度為20 μmol/L。

M,DL2000 DNA Marker;1,陽性對照;2,陰性對照;3～8,PMA濃度分別為0、5、10、15、20和25 μmol/LM,DL2000 DNA Marker;1,Positive control;2,Negative control;3-8,PMA concentrations were 0,5,10,15,20 and 25 μmol/L,respectively圖3 完全抑制OrfV PCR擴(kuò)增的最小PMA濃度Fig.3 Minimum PMA concentration for complete inhibition of OrfV PCR amplification

2.4 不抑制活OrfV PCR擴(kuò)增的最大PMA濃度確定

由圖4可知，當(dāng)PMA濃度為15～35 μmol/mL時，擴(kuò)增條帶亮度無差異，說明PMA對活OrfV的PCR擴(kuò)增無明顯的抑制作用；當(dāng)PMA濃度達(dá)到40 μmol/mL時，擴(kuò)增條帶亮度消失，表明PMA對活OrfV PCR擴(kuò)增的抑制作用較強(qiáng)。 因此，選擇不抑制活OrfV PCR擴(kuò)增的最大PMA濃度為35 μmol/L。

M,DL2000 DNA Marker;1,陽性對照;2,陰性對照;3～9,PMA濃度分別為15、20、25、30、35、40和45 μmol/LM,DL2000 DNA Marker;1,Positive control;2,Negative control;3-9,PMA concentrations were 15,20,25,30,35,40 and 45 μmol/L,respectively圖4 不抑制OrfV PCR擴(kuò)增的最大PMA濃度Fig.4 Maximum PMA concentration did not inhibit the PCR amplification of OrfV

2.5 特異性試驗(yàn)

由圖5可知，僅OrfV有特異性擴(kuò)增條帶，其余病毒基因組及陰性對照組均無條帶出現(xiàn)，表明所建立的PMA-PCR檢測方法具有較強(qiáng)的特異性。

M,DL2000 DNA Marker;1,陰性對照;2,羊口瘡病毒;3,山羊痘病毒;4,綿羊痘病毒;5,口蹄疫病毒M,DL2000 DNA Marker;1,Negative control;2,OrfV;3,GTPV;4,SPPV;5,FMDV圖5 PMA-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 PMA-PCR specificity test results

2.6 不同比例活/熱滅活OrfV混合病毒懸液樣本檢測

應(yīng)用PCR檢測驗(yàn)證PMA對活OrfV/熱滅活OrfV混合樣品的影響作用，結(jié)果見圖6、7。當(dāng)不同數(shù)量的活OrfV與固定數(shù)量的熱滅活OrfV病毒懸液混合時，經(jīng)PMA處理后DNA擴(kuò)增條帶亮度隨活OrfV濃度減少而漸弱，且活OrfV濃度為10-0.68TCID50/0.1 mL時，條帶亮度完全消失（圖6）；當(dāng)固定數(shù)量活OrfV與不同數(shù)量的熱滅活OrfV病毒懸液混合時，條帶亮度均勻一致（圖7），說明熱滅活OrfV的擴(kuò)增被完全抑制，而活OrfV的PCR擴(kuò)增不受影響。因此，在含有不同比例的滅活、活OrfV的病毒懸液中，20 μmol/L PMA可完全抑制失活OrfV基因組的PCR擴(kuò)增，且活OrfV不受抑制，檢測的靈敏度達(dá)10-1.68TCID50/0.1 mL。

M，DL2000 DNA Marker;1，陽性對照;2，陰性對照,3～9，病毒滴度分別為10-5.68、10-4.68、10-3.68、10-2.68、10-1.68、10-0.68和100 TCID50/0.1 mL。圖7同M，DL2000 DNA Marker;1,Positive control;2,Negative control;3-9,Virus titer was 10-5.68,10-4.68,10-3.68,10-2.68,10-1.68,10-0.68 and 100 TCID50/0.1 mL，respectively.The same as fig.7圖6 固定數(shù)量滅活病毒與變化數(shù)量活病毒混合液PMA-PCR擴(kuò)增Fig.6 PMA-PCR amplification of a fixed number of inactivated viruses and varying amounts of active virus mixture

圖7 固定數(shù)量活病毒與變化數(shù)量滅活病毒混合液PMA-PCR擴(kuò)增Fig.7 PMA-PCR amplification of a fixed amount of active virus and varying amount of inactivated virus mixture

3 討 論

由于活病毒具有傳染性并能引起疾病，因此在畜牧獸醫(yī)行業(yè)中，活病毒的檢測才是檢驗(yàn)衛(wèi)生程序和生物危害防控的關(guān)鍵。利用現(xiàn)有的疊氮類染料選擇性檢測活病毒的基礎(chǔ)是其對膜結(jié)構(gòu)不完整的失活病毒具有膜滲透性，從而結(jié)合抑制失活病毒基因組的擴(kuò)增。囊膜的主要功能是協(xié)助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，促進(jìn)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖，提高病毒的致病性[9]；衣殼是病毒的蛋白質(zhì)外殼，其作用是包裹保護(hù)病毒核酸，參與協(xié)助病毒感染[10]。單疊氮化乙錠（ethidium monoazide，EMA）和單疊氮化丙錠（propidium monoazide,PMA）作為核酸結(jié)合染料，均可滲透穿過失活病毒受損的囊膜、衣殼，經(jīng)光活化后共價結(jié)合暴露出的病毒DNA與之發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而抑制或消除失活病毒基因組的擴(kuò)增[11]。但Flekna等[12]研究表明,EMA能部分滲入活病毒內(nèi)，導(dǎo)致病毒DNA分子和EMA之間的交聯(lián)，造成活細(xì)胞中病毒基因組及PCR擴(kuò)增信號的損失，易導(dǎo)致假陰性。PMA由于不能進(jìn)入完整病毒囊膜或衣殼，可將其作為替代性非膜滲透核酸染料，較EMA更適合用于病毒的活性檢測。常用于OrfV檢測的靶標(biāo)主要有B2L和F1L基因，B2L基因主要在病毒感染后期編碼免疫原性蛋白，增強(qiáng)病毒毒力，協(xié)助病毒的增殖擴(kuò)散[13]；F1L基因編碼的F1L蛋白具有肝素受體結(jié)合活性，在病毒吸附及入侵過程中起重要作用[14]，且F1L蛋白在病毒表面具有特異性抗原決定簇，是OrfV單克隆抗體主要結(jié)合位點(diǎn)蛋白，對于OrfV具有重要研究意義[15]。因此，本研究選用F1L基因作為靶標(biāo)來建立針對活OrfV的PMA-PCR檢測方法。

PMA與病毒基因組共價結(jié)合可能受到病毒本身、與光源的距離、曝光時間、樣本本身性質(zhì)等多種因素的影響，本研究通過優(yōu)化病毒滅活時間、曝光時間和PMA工作濃度來建立具有最佳工作效率的PMA-PCR檢測方法。PMA的濃度影響其與DNA分子的結(jié)合效率，PMA濃度過低，則DNA不能被完全結(jié)合，無法抑制失活病毒的PCR擴(kuò)增，濃度過高則會影響活病毒的擴(kuò)增[16]。因此，應(yīng)用PMA進(jìn)行檢測要保證PMA的量可以與全部失活病毒的DNA結(jié)合，同時還不會對活病毒產(chǎn)生影響[17]。本研究對PMA作用濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳反應(yīng)濃度為20 μmol/L，在此工作濃度下PMA可完全抑制失活病毒的PCR擴(kuò)增，而對活病毒的基因擴(kuò)增無影響。PMA的作用還受曝光時間影響，于光照作用下未完全與失活病毒DNA結(jié)合的PMA可與水分子充分反應(yīng)生成羥胺，后者無法與病毒DNA分子結(jié)合，即不抑制活病毒基因組擴(kuò)增[18]，所以要求試驗(yàn)過程中PMA染料的添加及孵育均需在避光條件下進(jìn)行。本研究對曝光時間優(yōu)化，結(jié)果表明將PMA曝光10 min，即可使PMA最大程度抑制失活病毒DNA的PCR擴(kuò)增，且活病毒基因組有效擴(kuò)增。

目前，PMA-PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種類型活病毒的選擇性檢測。Fittipaldi等[19]在110 ℃下進(jìn)行PMA滅活預(yù)處理后，PMA與噬菌體T4病毒的DNA有效結(jié)合，聯(lián)合PCR擴(kuò)增對熱滅活病毒和活病毒進(jìn)行區(qū)分，同時通過衣殼損傷監(jiān)測確定了導(dǎo)致病毒失活的因素。Gloria等[20]分別使用PMA和RNase預(yù)處理熱滅活病毒樣本，通過實(shí)時熒光定量RT-PCR對甲型肝炎病毒做定量檢測，結(jié)果表明，PMA處理在區(qū)分具有感染性的病毒和滅活病毒方面比RNase處理效果顯著。Sandhya等[21]將PMA結(jié)合RT-PCR用于確定腸道RNA病毒在水中的傳染性，有效檢測存在于環(huán)境基質(zhì)中的傳染性脊髓灰質(zhì)炎病毒和非傳染性病毒，較常規(guī)的PCR檢測和細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果更具可信性。在某些情況下，失活病原體脂蛋白膜結(jié)構(gòu)仍完整，Nocker等[22]研究結(jié)果表明，紫外線通過誘導(dǎo)DNA損傷而不直接影響膜通透性來影響活力，PMA并不能監(jiān)測紫外照射后病原活力的喪失。因此疊氮類染料檢測在核酸擴(kuò)增分析中的應(yīng)用應(yīng)謹(jǐn)慎，建議僅用于通過損傷細(xì)胞壁或改變細(xì)胞膜完整性而使微生物細(xì)胞失活的方法，而對于不同病毒的適用性仍有待研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)60 ℃熱水浴10 min可完全滅活OrfV；當(dāng)PMA濃度達(dá)20 μmol/L時即可完全抑制熱滅活OrfV的PCR擴(kuò)增；當(dāng)PMA濃度超過35 μmol/L即會對OrfV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一定的抑制作用；且所建立的PMA-PCR檢測方法只對活OrfV的DNA特異擴(kuò)增，在不同滴度比例混合的病毒懸液中PMA對活OrfV的檢測靈敏度為10-1.68TCID50/0.1 mL。 本試驗(yàn)所建立的PMA-PCR檢測方法敏感特異，對活OrfV的檢測有效可行。