顧先哲，侯 寧，呂曉萍，高雪麗,劉超男，吳文杰，鄭世民

（東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室，哈爾濱 150030）

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）是引起禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生?。╮eticuloendotheliosis disease，RE）的病原，該病毒于1958年在美國被首次發(fā)現(xiàn)[1]。REV常見的宿主有雞、鴨、鵝、火雞等，一些野生鳥類也會成為其宿主，攜帶病毒在自然界和養(yǎng)殖場之間交叉?zhèn)鞑?，使得該病預防難上加難[2-4]。REV感染的宿主會產(chǎn)生以淋巴-網(wǎng)狀細胞增生為主要特征的一系列病理綜合征，常見有生長抑制綜合征、急性網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞瘤、免疫器官萎縮、淋巴細胞分化成熟受阻等，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失[5-7]。REV的傳播方式多種多樣，既能通過糞便、精液在禽類群體之間直接傳播，也能通過受污染人員、物品甚至疫苗進行間接傳播[8]。畢研麗等[9]證實，REV還可通過反轉(zhuǎn)錄將病毒的DNA插入宿主DNA中，進行垂直傳播。禽類動物被REV感染之后，其法氏囊、胸腺等免疫器官發(fā)生不同程度的萎縮，使淋巴細胞的發(fā)育成熟受阻，導致患禽產(chǎn)生免疫抑制。國內(nèi)外已有大量研究報道指出，這與REV感染后調(diào)控了家禽的免疫細胞發(fā)生凋亡有關(guān)[8,10-12]，盡管國內(nèi)外學者作了大量研究工作，但REV調(diào)控細胞凋亡過程的詳細機制迄今仍不十分清楚。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡相關(guān)蛋白中研究最充分的，目前已鑒定出20多種[13]。多數(shù)成員對細胞凋亡起到促進作用，但也有部分成員可抑制細胞凋亡，Bcl-2蛋白就是其中之一。C-myc是原癌基因，隸屬于核蛋白類調(diào)控基因家族，在細胞增殖、分化、惡性轉(zhuǎn)化及凋亡等過程中起重要調(diào)節(jié)作用[14]。Hatzl等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2和C-myc之間存在著協(xié)同作用，可共同誘導腫瘤產(chǎn)生和免疫抑制。因此，推斷REV可能通過調(diào)控Bcl-2與C-myc基因，進而影響家禽法氏囊內(nèi)淋巴細胞凋亡，降低其免疫反應。本研究基于上述科學問題展開試驗，以期為進一步探索REV的免疫發(fā)生機制和免疫抑制途徑完善理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 1日齡SPF雛雞100只，購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF試驗動物中心。

1.1.2 病毒 REV-T毒株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，菌種號為：CVCC No.CACCAV107。經(jīng)9～11胚齡SPF雞胚增毒后使用，使用時將之稀釋105倍。

1.1.3 主要試劑及儀器 APES購自武漢博士德生物工程有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；Oligo（dT）15購自天根生化科技（北京）有限公司；Axy Prep DNA 凝膠回收試劑盒和Axy Prep質(zhì)粒 DNA小量試劑盒均購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司；Bcl-2和C-myc抗體均購自Abcam公司；5×First Strand Buffer、0.1 mol/L DTT和M-MLV Reverse Transcriptase均購自Invitrogen公司；DL2000 DNA Marker、RNA 酶抑制劑、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、TaqDNA聚合酶和pMD18-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司。LightCycler 2.0熒光定量PCR儀購自羅氏公司；H600L顯微病理切片成像系統(tǒng)購自Nikon公司；ELx808酶標儀購自伯騰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 REV復蘇及病毒50%組織細胞感染量（TCID50）測定 取10胚齡SPF雞胚，消毒后于超凈臺內(nèi)敲開蛋殼氣室，取出胚胎，除去頭、四肢及內(nèi)臟，PBS沖洗3次洗去紅細胞。剩余組織在無菌平皿中剪碎，PBS沖洗3次后棄去液體。使用5 mL 0.25%的胰酶在錐形瓶中37 ℃水浴消化25 min，加入等量37 ℃預熱的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，經(jīng)過8層無菌紗布過濾后分裝入玻璃試管中，1 100 r/min離心10 min，棄上清液。以 1 mL含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，并吹打均勻以計數(shù)。 用培養(yǎng)液稀釋到1×106/mL，然后分裝于細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶5 mL細胞懸浮液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞匯合度為80%～90%時用于接毒。

接毒前棄掉細胞培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，每個細胞瓶中接種100 μL稀釋后的病毒液，37 ℃恒溫箱感作1 h。棄掉感作液，換入5 mL 2%胎牛血清的細胞維持液，重新放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。維持培養(yǎng)7 d，然后取出，于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)反復凍融3次，收集細胞及上清液。將病毒原液稀釋105倍，用于正式試驗。

1.2.2 試驗動物處理及樣品采集 將100只SPF雛雞隨機分為2組，即對照組和感染組。其中感染組雛雞經(jīng)腹腔注射途徑感染REV稀釋液，500 μL/只，對照組雛雞經(jīng)相同途徑注射等量經(jīng)高壓滅菌的生理鹽水。于病毒感染雛雞后第1、7、14、21、28和42天，從感染組和對照組分別隨機抽取5只雛雞，心臟采血處死后，迅速摘取法氏囊，做如下處理。一部分置于4 ℃預冷的 10%中性福爾馬林固定液中固定，用于凋亡細胞數(shù)量、細胞核漿比值與Bcl-2、C-myc陽性細胞數(shù)量的檢測。 另一部分于液氮中迅速冷凍后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，用于Bcl-2與C-myc基因mRNA 表達檢測。剩余部分與裂解液按每100 mg組織與900 μL預冷的裂解液混合，用玻璃勻漿器在低溫下充分研磨，將得到的組織勻漿液放入1.5 mL預冷的離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心5 min。將上清液放入新的離心管中，置于-80 ℃冰箱中保存，用于Bcl-2與C-myc蛋白含量檢測。

1.2.3 測定指標及方法

1.2.3.1 法氏囊凋亡細胞數(shù)量 制作組織石蠟切片[16]并按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行染色，于油鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)凋亡細胞陽性數(shù)。

1.2.3.2 法氏囊細胞核漿比 雛雞心臟釆血處死后，快速釆取法氏囊，經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖液固定后的組織塊，常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片（3 μm），HE染色，光學顯微鏡下觀察。利用病理切片成像系統(tǒng)軟件NIS-Elements BR 3.0計算細胞核與細胞漿的面積比[17]。

1.2.3.3 法氏囊Bcl-2與C-myc陽性細胞數(shù)量 應用組織石蠟切片[16]及免疫組織化學染色法（DAB顯色），將法氏囊組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，PBS漂洗3次后滴加3% H2O2+甲醇，濕盒內(nèi)避光反應20 min。于組織切片上滴加1%的胰酶，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)消化30 min。將正常山羊血清稀釋20倍后滴加于載玻片上，封閉20 min。滴加50倍稀釋的兔抗鼠Bcl-2或C-myc多克隆抗體，切片置于濕盒內(nèi)，于37 ℃恒溫箱孵育1 h，PBS洗3次，5 min/次。結(jié)束后滴加按1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，于37 ℃恒溫箱中孵育1 h。PBS洗3次，5 min/次，滴加DAB，室溫下避光顯色5 min，再用蘇木素復染5 min。鹽酸+乙醇分化、逐級乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，于油鏡下隨機取5個視野，統(tǒng)計Bcl-2或C-myc陽性細胞數(shù)。

1.2.3.4 法氏囊Bcl-2和C-myc蛋白含量及mRNA表達測定 取法氏囊組織裂解上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測Bcl-2和C-myc含量，每個樣本設3個重復，同時設空白對照組孔。以空白對照組孔調(diào)零，用酶標儀測定D490 nm值。應用實時熒光定量PCR法[17]測定法氏囊Bcl-2和C-myc蛋白含量及mRNA表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)均應用SPSS 16.0軟件處理，進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）及LSD多重比較，結(jié)果以平均值±標準誤表示，再應用GraphPad Prism 9.0.2作圖。P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 REV感染SPF雛雞法氏囊凋亡細胞數(shù)量變化

SPF雛雞感染REV后21和28 d，其法氏囊中凋亡細胞數(shù)量均極顯著高于相應對照組雛雞（P<0.01），在病毒感染后42 d，凋亡細胞數(shù)量依然顯著高于對照組雛雞（P<0.05）（圖1）。

①A，感染后21 d REV感染組凋亡細胞陽性染色（TUNEL染色，40×，箭頭所指）；B，感染后21 d對照組凋亡細胞陽性染色（TUNEL染色，40×）；C，凋亡細胞密度隨時間變化柱形圖。②與對照組相比，*，差異顯著（P<0.05）;**,差異極顯著（P<0.01）。下同①A，Positive staining of apoptotic cells of REV infection group 21 days after infection （TUNEL staining，40×，Pointed by arrows）；B，Positive staining of apoptotic cells of control group 21 days after infection （TUNEL staining，40×）；C，Histogram of apoptotic cell density over time.②Compared with control group,*,Significant difference （P<0.05）;**,Extremely significant difference （P<0.01）.The same as below圖1 雛雞法氏囊細胞凋亡數(shù)量變化Fig.1 Changes of the number of cells apoptosis in bursa of Fabricius of chickens

2.2 REV感染SPF雛雞法氏囊細胞核漿比的變化

由圖2可知，REV感染SPF雛雞后，其法氏囊細胞核漿比與對照組雛雞相比均不同程度減小，其中21和28 d顯著低于對照組雛雞（P<0.05）。

圖2 雛雞法氏囊細胞核漿比變化Fig.2 Changes of nucleoplasm ratio in bursa of Fabricius of chikens

2.3 REV感染SPF雛雞法氏囊Bcl-2和C-myc陽性細胞數(shù)量變化

2.3.1 REV感染SPF雛雞法氏囊Bcl-2陽性細胞數(shù)量變化 由圖3可知，REV感染SPF雛雞后21和28 d，其法氏囊中Bcl-2陽性細胞數(shù)量較對照組雛雞顯著增加（P<0.05）。

A，感染后21 d REV感染組法氏囊Bcl-2陽性細胞染色（IHC染色，100×，箭頭所指）；B，感染后21 d對照組法氏囊Bcl-2陽性細胞染色（IHC染色，100×，箭頭所指）；C，Bcl-2陽性細胞密度隨時間變化柱狀圖A，Positive staining of Bcl-2 positive cells in bursa of REV infection group 21 days after infection（IHC staining，100×，Pointed by arrows）；B，Positive staining of Bcl-2 positive cells in bursa of control group 21 days after infection（IHC staining，100×，Pointed by arrows）；C，Histogram of Bcl-2 positive cell density over time圖3 雛雞法氏囊中Bcl-2陽性細胞數(shù)量變化Fig.3 Changes of the number of Bcl-2 positive cells in bursa of Fabricius of chickens

2.3.2 REV感染SPF雛雞法氏囊中C-myc陽性細胞數(shù)量變化 由圖4可知，與對照組雛雞相比，REV感染SPF雛雞后，其法氏囊中C-myc陽性細胞數(shù)量不同程度的增加，其中，在病毒感染后21和28 d， C-myc陽性細胞數(shù)量顯著高于對照組雛雞（P<0.05）。

A，感染后21 d REV感染組法氏囊C-myc陽性細胞染色（IHC染色，100×，箭頭所指）；B，感染后21 d對照組法氏囊C-myc陽性細胞染色（IHC染色，100×，箭頭所指）；C，C-myc陽性細胞密度隨時間變化柱狀圖A，Positive staining of C-myc positive cells in bursa of REV infection group 21 days after infection （IHC staining，100×，Pointed by arrows）；B，Positive staining of C-myc positive cells in bursa of contorl group 21 days after infection （IHC staining，100×，Pointed by arrows）；C，Histogram of C-myc positive cell density over time圖4 雛雞法氏囊中C-myc陽性細胞數(shù)量變化Fig.4 Changes of the number of C-myc positive cells in bursa of Fabricius of chickens

2.4 REV感染SPF雛雞法氏囊細胞Bcl-2和C-myc基因mRNA表達變化

由圖5可知，REV感染SPF雛雞后，其法氏囊細胞Bcl-2和C-myc基因mRNA表達量均不同程度高于對照組雛雞，其中，病毒感染后21和28 dBcl-2基因mRNA表達量極顯著高于對照組雛雞（P<0.01）；病毒感染后21 d，C-myc基因mRNA表達量極顯著高于對照組雛雞（P<0.01）；28 d時顯著高于對照組雛雞（P<0.05）。

A，Bcl-2；B，C-myc。下同A，Bcl-2；B，C-myc.The same as below圖5 雛雞法氏囊細胞Bcl-2和C-myc基因mRNA表達變化Fig.5 Changes of Bcl-2 and C-myc genes mRNA expression in bursa of Fabricius of chickens

2.5 REV感染SPF雛雞法氏囊細胞Bcl-2和C-myc蛋白含量變化

REV感染SPF雛雞后，其法氏囊細胞Bcl-2含量較對照組雛雞均不同程度增加。其中，病毒感染后21和28 d分別極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）增高（圖6A）。REV感染SPF雛雞后，其法氏囊細胞C-myc蛋白含量均不同程度高于對照組雛雞。在病毒感染后21～42 d極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）高于對照組雛雞（圖6B）。

圖6 雛雞法氏囊細胞Bcl-2和C-myc蛋白含量變化Fig.6 Changes of the content of Bcl-2 and C-myc protein in bursa of Fabricius of chickens

3 討 論

凋亡是細胞最主要的死亡方式之一，其與壞死、自噬、脹亡和焦亡是近年來的研究重點。病毒在感染細胞后會對細胞的凋亡起調(diào)控作用，如編碼Caspase抑制物，通過抑制Caspase活性阻止宿主細胞凋亡；抑制p53轉(zhuǎn)錄為p53腫瘤抑制基因，細胞由于缺乏p53進入無限增殖狀態(tài)；上調(diào)FasL/Fas和TNF-α/TNFR-1的表達，增強死亡受體通路，進而間接誘導細胞凋亡。細胞凋亡后，主要表現(xiàn)為細胞核濃縮、染色質(zhì)邊集，胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高，雙鏈DNA被核酸內(nèi)切酶切割而斷裂，最終形成凋亡小體，導致細胞的核漿比明顯減小。因此，檢測細胞核漿比變化在一定范圍內(nèi)可較客觀地說明細胞死亡方式，且間接反映細胞凋亡程度。本研究發(fā)現(xiàn)，SPF雛雞感染REV后，其法氏囊細胞出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡現(xiàn)象，法氏囊細胞核漿比與對照組雛雞相比明顯縮小，說明REV感染SPF雛雞后會導致法氏囊細胞凋亡，該試驗結(jié)果與相關(guān)文獻報道一致[18]。與對照組相比，SPF雛雞感染REV后，雛雞法氏囊凋亡細胞數(shù)在1～28 d逐步增加，細胞核漿比亦不同程度減小。劉暢[17]研究證實，凋亡越明顯的細胞，其細胞核漿比減小越顯著。發(fā)生上述變化可能與免疫器官內(nèi)的病毒載量先升高后降低有關(guān)[19]。上述研究結(jié)果表明，REV感染使SPF雛雞免疫器官細胞發(fā)生凋亡，免疫活性細胞數(shù)量明顯減少，間質(zhì)結(jié)締組織顯著增加，免疫器官萎縮導致雛雞免疫力下降，無論是先天性免疫還是后天性免疫都被嚴重抑制，繼而使受REV感染的雛雞對其他病原，尤其是生物性致病因素的易感性增強，易出現(xiàn)混合感染或繼發(fā)感染。

Bcl-2蛋白主要位于部分亞細胞器（胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）的生物膜上，通過細胞凋亡的線粒體途徑發(fā)揮作用[20]。Bcl-2可在3個水平上調(diào)控細胞凋亡：①通過調(diào)控谷胱甘肽的外泄和降低線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)，以控制線粒體外膜電位從而影響細胞凋亡；②介導線粒體外膜通透轉(zhuǎn)運孔的孔道復合體開放，抑制細胞色素C和凋亡誘導因子（AIF）等促凋亡蛋白的釋放阻止凋亡進程；③Bax是Bcl-2活性的主要調(diào)控因子，二者間的比率是決定細胞命運的關(guān)鍵因素。Bcl-2可與Bax等結(jié)合形成異構(gòu)二聚體抑制細胞凋亡，Bax表達增加可頡頏Bcl-2的作用，促進細胞凋亡[21]。在某些情況下，該基因表達過量可保護細胞延長壽命，而有些老化細胞未按時凋亡，其基因發(fā)生突變導致腫瘤發(fā)生。本研究從mRNA表達和蛋白含量兩個層面研究了REV感染對法氏囊細胞Bcl-2的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，REV感染SPF雛雞后21和28 d，其法氏囊細胞Bcl-2 mRNA表達及其蛋白含量均顯著高于對照組雛雞，二者呈現(xiàn)高度一致性，Bcl-2陽性細胞數(shù)量也明顯增加。分析產(chǎn)生上述現(xiàn)象的主要原因可能與Bcl-2調(diào)控因子Bax有關(guān)。Bcl-2家族成員之間或與其他凋亡調(diào)控分子之間共同構(gòu)成極其復雜的相互作用網(wǎng)絡調(diào)控細胞凋亡過程。Brooks等[22]指出，Bax表達增加可對Bcl-2起到頡頏作用，其與Bcl-2結(jié)合形成的異構(gòu)二聚體抑制細胞凋亡。佟美嬌[23]研究發(fā)現(xiàn)，SPF雛雞感染傳染性法氏囊病病毒（IBDV）后，其法氏囊中Bcl-2、Bax陽性細胞和Bcl-2基因mRNA表達高于對照組雛雞，且法氏囊細胞凋亡數(shù)量亦高于對照組雛雞。IBDV感染SPF雛雞后，免疫器官高表達Bcl-2與IBDV所致細胞凋亡密切相關(guān)，雖然Bcl-2表達上調(diào)，但法氏囊細胞卻依然發(fā)生了凋亡，且在一定程度上代表了免疫器官病理損傷和免疫抑制的程度，本研究中REV感染SPF雛雞法氏囊病變程度與其研究結(jié)果基本一致，故推測REV感染SPF雛雞后，雖然Bcl-2表達上升，但法氏囊Bax表達亦上調(diào)，Bax上升幅度超過Bcl-2可調(diào)控的閾值，導致依然有過多的Bax形成同源二聚體，最終引發(fā)了細胞凋亡。雛雞感染REV后，Bax是否通過表達量超過Bcl-2調(diào)控閾值來引起細胞凋亡將是未來研究需解決的問題。

原癌基因C-myc是myc家族中研究最為廣泛的一種轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡、增殖、分化、代謝和血管生成等多種病理和生理過程，具有高度保守性[24]。C-myc基因可誘導腫瘤細胞、成纖維細胞、淋巴細胞及其他細胞發(fā)生凋亡。楊莉潔等[25]發(fā)現(xiàn)，在B細胞淋巴瘤組織中，細胞凋亡與C-myc表達呈正相關(guān)。過表達的C-myc可引起無血清培養(yǎng)的Rat-1纖維細胞和早期鼠胚胎成纖維細胞凋亡[26]。C-myc基因誘導細胞凋亡的確切機制尚未完全闡明，H?fner等[27]指出，C-myc可通過抑制NF-κB活性，使細胞對腫瘤壞死因子（TNF）介導的凋亡更敏感，進而促進細胞凋亡。還可通過生長素響應因子（ARF）間接激活轉(zhuǎn)錄因子p53，進而調(diào)控凋亡。C-myc與Bcl-2在正常細胞發(fā)育、成熟中存在密切聯(lián)系。在細胞增殖、轉(zhuǎn)化、致癌過程中，Bcl-2與C-myc具有協(xié)同作用，而在誘導細胞凋亡過程中，Bcl-2阻礙C-myc誘導細胞凋亡功能的發(fā)揮。本研究發(fā)現(xiàn)，SPF雛雞感染REV后，其法氏囊中C-myc mRNA表達在病毒感染后21和28 d顯著或極顯著高于對照組雛雞。經(jīng)ELISA法對其蛋白含量進行了檢測，進一步發(fā)現(xiàn)，REV感染雛雞法氏囊中C-myc蛋白含量均高于對照組雛雞，兩者結(jié)果雖不完全同步，但在病毒感染后，引起的變化趨勢基本呈正相關(guān)。從REV致病機制已有的研究資料看，REV在感染禽類后，會將病毒剪切和變異基因插入宿主的C-myc基因中，從而使其致瘤。REV可能通過破壞禽類免疫細胞的DNA，從而引發(fā)細胞的凋亡過程。還有研究顯示，C-myc可激活Bax，前者與后者形成同源二聚體，通過線粒體途徑，促進細胞色素C及其他凋亡相關(guān)因子釋放到細胞漿中使細胞凋亡，Bax若與Bcl-2結(jié)合形成異構(gòu)二聚體則可阻止這一過程，抑制細胞凋亡，除非二者比例失調(diào)[28]，王黎霞等[29]指出在Bcl-2與Bax比值較高時，凋亡因子的濃度也更高，引發(fā)細胞凋亡。這也進一步解釋了為何Bcl-2表達上升卻無法抑制細胞凋亡。

4 結(jié) 論

REV感染SPF雛雞導致法氏囊細胞核漿比降低、Bcl-2和C-myc基因mRNA表達量及其蛋白含量升高，細胞凋亡增加是REV感染導致雛雞免疫機能抑制的病理學基礎(chǔ)。