侯曉紅，王 蒙，武 博，龍憲榮，趙孝民，高 靜，戴培強(qiáng)，柴同杰

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271000；2.泰安市中心醫(yī)院，泰安 271000；3.泰安市泰山區(qū)中科生物研究所，泰安 271000）

H9N2亞型禽流感病毒（Avian infuenza virus，AIV）于1966年在美國首次發(fā)現(xiàn)，屬于低致病性禽流感病毒，致死率較低。但當(dāng)其與其他病原體混合感染時(shí)，會導(dǎo)致家禽發(fā)病率和死亡率大幅度升高[1-2]。Bi等[3]研究表明,從2016年開始，中國家禽群中H9N2亞型AIV已成為雞群和鴨群中的優(yōu)勢流感病毒亞型。目前，H9N2亞型AIV已可突破種間屏障，感染豬、犬、水貂、蝙蝠及人等哺乳動物[4-7]。

2009-2013年，中國出現(xiàn)了許多包含H9N2原始基因的新亞型AIV，如H7N9和H10N8亞型AIV等[8-9]。2005-2011年，報(bào)告了4例人類感染病例，而在2012-2019年，人類感染H9N2亞型AIV的病例已增加到28起，說明H9N2亞型AIV的跨種傳播能力正在慢慢發(fā)生改變[10]。Sang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，2010年分離的2株病毒雖具有與α-2,6-唾液酸受體結(jié)合的能力，但病毒在感染豚鼠中不能通過直接接觸傳播。Chen等[12]研究了2016-2019年間從家禽體內(nèi)分離到的21株H9N2亞型AIV在哺乳動物中的適應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)約有50%的毒株可在小鼠肺臟中良好復(fù)制。這說明H9N2亞型AIV的致病性、宿主范圍及傳染方式正在發(fā)生變化，部分H9N2亞型AIV毒株已可感染哺乳動物并使其產(chǎn)生臨床癥狀。因此，本研究首先在養(yǎng)雞場采集病料分離H9N2亞型AIV，對分離鑒定的H9N2亞型AIV進(jìn)行豚鼠致病性及氣溶膠感染試驗(yàn)來驗(yàn)證H9N2亞型AIV的致病性及傳播方式的變化，這對評估流感大流行趨勢及對公共衛(wèi)生的危害風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而制定有效的防控措施具有重要的指導(dǎo)意義。

目前研究主要針對H9N2亞型AIV對人肺上皮細(xì)胞的致病機(jī)理，對AIV感染支氣管上皮細(xì)胞研究較少[13-14]。本研究將分離到的H9N2亞型AIV感染人支氣管上皮細(xì)胞后檢測病毒在人支氣管上皮細(xì)胞上的復(fù)制能力及誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)情況，從而有利于加深對人類支氣管上皮細(xì)胞中H9N2亞型AIV致病機(jī)理的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物、細(xì)胞及病料

4周齡SPF清潔級Hartley雌性豚鼠購自山東省青島市康大生物科技有限公司；9日齡SPF雞胚購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所。犬腎細(xì)胞系（MDCK，BNCC239717）、人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B，CRL-9609）均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室保存。病料（肺臟、肝臟、肛拭子等）于2018年采集于山東部分規(guī)模化養(yǎng)雞場，均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室保存。所有動物試驗(yàn)均按照山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物福利和使用委員會（SDAUA-2016-004）的指導(dǎo)進(jìn)行。

1.2 主要試劑及儀器

FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit、HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、AceQ?Universal U+ Probe Master Mix V2探針法熒光定量試劑盒、FastPure?Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Toll樣受體3（TLR3）、TLR7、抗黏病毒蛋白（MX）、2′,5′-腺苷酸激酶（OAS） ELISA檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TPCK-胰酶購自Sigma公司；PBS緩沖液、4%組織細(xì)胞固定液均購自北京索萊寶科技有限公司；0.25% EDTA胰酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco公司；A型流感病毒HA鼠單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；免疫染色一抗、二抗稀釋液購自碧云天生物科技有限公司。

超高速離心機(jī)（CP100WX）購自日立公司；豚鼠肺部液體定量霧化器（HRH-MAG4）購自北京慧榮和科技有限公司；清潔級鼠隔離器（1 000 mm×600 mm×900 mm）（PR-22）購自蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司；熒光定量7500 Real-time PCR儀（4351104）購自ABI公司；酶標(biāo)儀（Thermo K3）購自Thermo公司；熒光顯微鏡（Ti2-U）購自日本尼康公司；空氣樣品收集器AGI-30（ZR-B01）購自青島眾瑞智能儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)GenBank中相關(guān)基因序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)所需引物，引物信息見表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.2 病毒分離鑒定及生物學(xué)特性研究 將采集的病料進(jìn)行研磨過濾后接種9日齡SPF雞胚進(jìn)行分離純化病毒，通過血凝及血凝抑制（HA-HI）試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）對病毒亞型進(jìn)行鑒定。PCR產(chǎn)物送青島擎科公司進(jìn)行測序。

接種病毒的9日齡SPF雞胚37 ℃溫箱內(nèi)孵育72 h后無菌收取雞胚尿囊液，于-80 ℃保存，通過Reed-Muench法計(jì)算病毒的雞胚半數(shù)感染量（50% egg infectious dose，EID50）[15]。將長勢良好的MDCK細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)將病毒液按10-1至10-9倍比稀釋后接種到細(xì)胞板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄掉細(xì)胞板中的病毒液，加入維持液繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，根據(jù)公式計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（50% tissue culture infective dose，TCID50）[15]。

將病毒液以300 μL/只 （107EID50）的劑量經(jīng)滴鼻途徑接種5只豚鼠，在接種后的第6天取豚鼠脾臟、氣管、肺臟、腎臟組織進(jìn)行研磨離心后取上清液，上清液經(jīng)過濾后按照10-1至10-9倍比稀釋接種至SPF雞胚中，收集尿囊液根據(jù)Reed-Muench法測定各組織的病毒滴度。

1.3.3 SPF豚鼠感染試驗(yàn) 將豚鼠隨機(jī)分為3組:滴鼻組、肺遞送組和對照組，每組各15只。滴鼻組將豚鼠用干冰麻醉后通過滴鼻途徑接種H9N2亞型AIV，接種劑量為300 μL/只（107EID50）；肺遞送組采用肺部液體定量霧化器接種豚鼠，接種劑量為300 μL/只（107EID50）;對照組通過滴鼻途徑接種等量無菌PBS。在攻毒后第3、6、9、12、15天，每組分別隨機(jī)取3只豚鼠，采集豚鼠口腔和肛門棉拭子，根據(jù)FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit操作說明提取棉拭子RNA，并根據(jù)HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）試劑盒操作說明將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。通過探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR對排毒開始和終止時(shí)間及排毒量進(jìn)行檢測，引物信息見表1。反應(yīng)體系20 μL：AceQ?Universal U+ Probe Master Mix V 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，TaqMan Probe 0.2 μL,ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)2 min；95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸10 s，共45個(gè)循環(huán)。利用建立好的H9標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（y=-3.117x+38.4971）測定病毒的拷貝數(shù)[16]。按照ELISA試劑盒檢測分離株感染豚鼠后肺臟組織中先天性免疫應(yīng)答相關(guān)蛋白TLR3、TLR7、MX、OAS的表達(dá)水平。采集豚鼠全血，離心后收集血清，參照OIE（2008）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HA-HI試驗(yàn)，測定豚鼠血清中抗體效價(jià)。

1.3.4 H9N2亞型AIV在豚鼠間的氣溶膠發(fā)生、傳播與感染試驗(yàn) SPF豚鼠放置在2個(gè)正負(fù)壓隔離器A、B中，2個(gè)隔離器間用長180 cm、直徑8 cm的密閉管連接，外界空氣經(jīng)HEPA濾膜進(jìn)入隔離器A，再經(jīng)密閉塑膠管流到隔離器B中，對從隔離器B排出的氣體經(jīng)過消毒過濾處理，風(fēng)速為0.05～0.2 m/s，溫度為20～24 ℃、濕度為40%～60%。試驗(yàn)動物分為4組：接種組、直接接觸組、飛沫組和氣溶膠感染組。 在隔離器A中飼養(yǎng)21只SPF豚鼠：其中接種組7只豚鼠經(jīng)麻醉后鼻腔內(nèi)接種300 μL病毒液（107EID50）；在接種24 h后，將剩余14只豚鼠放入隔離器A中，其中7只豚鼠為直接接觸組，另外7只為飛沫傳播組。直接接觸組和接種組在一個(gè)籠子里，飛沫傳播組在另一個(gè)籠子內(nèi)，2個(gè)籠子距離相隔約為20 cm。在隔離器B中，放入10只SPF豚鼠，為氣溶膠感染組。嚴(yán)格按照清潔級豚鼠的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。

在豚鼠接種病毒第2、4、6、8、10、12、14、16天，每組分別采集7只豚鼠的鼻洗液樣品，將過濾好的鼻洗液接種于3枚9日齡SPF雞胚，孵化器內(nèi)37 ℃恒溫孵育，無菌收取24～72 h的雞胚尿囊液，用HA試驗(yàn)鑒定豚鼠排毒情況。在豚鼠接種病毒后第3、6、9、12、15天，用空氣樣品收集器AGI-30（All Glass Impinger）收集2個(gè)隔離器內(nèi)的空氣樣品，收集時(shí)間為30 min，AGI-30的流量調(diào)節(jié)為12.5 L/min，樣品收集介質(zhì)為25 mL含有10%青鏈霉素的無菌PBS。將采集液經(jīng)4 ℃、10 000×g離心70 min后取上清液，棄去沉淀除掉細(xì)菌和塵埃，將上清液再經(jīng)4 ℃、100 000×g離心120 min以獲得病毒粒子沉淀，用700 μL滅菌PBS將病毒粒子沉淀重懸。提取病毒的RNA，進(jìn)行探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測豚鼠排毒情況，引物信息見表1。在接種感染后的第0、7、14、21天每組取3只豚鼠經(jīng)心臟采血離心后收集血清，參照OIE（2008）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HA-HI試驗(yàn),測定抗體效價(jià)。

1.3.5 H9N2亞型AIV感染BEAS-2B細(xì)胞 將長勢良好的BEAS-2B細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1的量接種病毒，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后棄去病毒液,加入含有1%胎牛血清的細(xì)胞維持液，在攻毒后12、24和36 h進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞維持液棄掉，用PBS洗滌后每孔加入200 μL 4%組織細(xì)胞固定液，室溫固定10 min后用PBS沖洗。使用0.1% Tritonx-100通透細(xì)胞，室溫下靜置10 min后棄去，并用PBS洗滌。在每孔中依次加入200 μL稀釋好的HA鼠單克隆抗體，于37 ℃恒溫箱中孵育60 min，隨后用PBS洗滌細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔依次加入200 μL稀釋好的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，于37 ℃恒溫箱中避光孵育45 min，加入適量的PBS洗滌細(xì)胞培養(yǎng)板后通過熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

將BEAS-2B細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入稀釋好的病毒液0.5 mL以及1.5 mL無血清的DMEM原液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后棄掉病毒液并加入2 mL細(xì)胞維持液。在攻毒后的6、12、18、24和36 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TLR3、TLR7、MX、OAS、白介素-6（IL-6）、IL-8和干擾素-β（IFN-β）基因的相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并使用GraphPadPrism 6.0可視化。使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著;P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 H9N2亞型AIV的鑒定及生物學(xué)特性研究

由圖1可知，對分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，H9為383 bp，N2為281 bp，擴(kuò)增條帶大小位置與預(yù)期相符，通過膠回收將目的片段測序，結(jié)果顯示為H9N2亞型AIV，將該株病毒命名為A/Chicken/Shandong/07/2018（縮寫為SD18）。

M，DL2000 DNA Marker；1，H9目的片段；2，N2目的片段；3，陰性對照M,DL2000 DNA Marker,1,H9 target fragment,2,N2 target fragment,3,Negative control圖1 SD18株P(guān)CR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of SD18 strain

SD18株接種雞胚及MDCK細(xì)胞后，將收獲的病毒液進(jìn)行HA-HI檢測。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒的EID50為10-8.68/0.2 mL，TCID50為10-6.69/0.1 mL。

SD18株感染豚鼠6 d后可在豚鼠的氣管和肺臟組織中檢測到病毒，病毒滴度分別為4.30 lg EID50/g、4.75 lg EID50/g，差異不顯著（P<0.05）（圖2）。

ND,無數(shù)據(jù)。下同ND,No data.The same as below圖2 攻毒后第6天豚鼠各組織病毒滴度檢測結(jié)果Fig.2 Results of virus titer detection in guinea pig tissues on the 6th day after infection

2.2 SPF豚鼠感染效果

2.2.1 排毒情況 在整個(gè)試驗(yàn)周期過程中，SPF豚鼠未出現(xiàn)死亡情況，但出現(xiàn)體重減輕，食欲減退等臨床癥狀。由圖3A可知，滴鼻組豚鼠的咽拭子和肺遞送組的排毒規(guī)律基本相同，在接種病毒后第3天，均可在體內(nèi)增殖復(fù)制且檢測到病毒，且排毒量最高，病毒拷貝數(shù)均為103.56拷貝/μg。由圖3B中可知，2組豚鼠的肛拭子排毒趨勢也基本相同。在整個(gè)排毒過程中，肺遞送組豚鼠的咽拭子和肛拭子排毒量均高于滴鼻組。

①A，咽拭子；B，肛拭子。②同一時(shí)間點(diǎn)，*,差異顯著（P<0.05）；**,差異極顯著（P<0.01）；無*,差異不顯著（P>0.05）。下同①A，Throat swab;B，Anal swab.②At the same time point,*,Significant difference （P<0.05）;**,Extremely significant difference （P<0.01）；No *,No significant difference （P>0.05）.The same as below圖3 豚鼠排毒情況Fig.3 Virus excretion of guinea pigs

2.2.2 豚鼠肺臟組織的抗病毒蛋白及受體的表達(dá) SD18株病毒感染SPF豚鼠的3～9 d內(nèi)，滴鼻組和肺遞送組的TLR3、TLR7受體含量均顯著或極顯著高于對照組（P<0.05；P<0.01）。2組豚鼠肺臟中TLR3受體的含量都在第6天達(dá)到高峰，TLR7受體的含量在第3天上調(diào)至最高，但肺遞送組誘導(dǎo)的TLR3和TLR7受體的含量與滴鼻組差異不顯著（P>0.05）（圖4A、4B）。在感染后3～15 d內(nèi)，2組誘導(dǎo)的抗病毒蛋白MX、OAS的表達(dá)量均上調(diào)，在第9天上調(diào)至最大倍數(shù)，與對照組相比差異極顯著（P<0.01），隨后上調(diào)幅度降低。在第15天，肺遞送組MX表達(dá)量與滴鼻組相比顯著增加（P<0.05）（圖4C、4D）。

圖4 肺臟組織模式識別受體及抗病毒蛋白表達(dá)情況Fig.4 Expression of pattern recognition receptor and antiviral protein in lung tissue

2.2.3 豚鼠血清AIV抗體檢測結(jié)果 接種病毒前在豚鼠體內(nèi)未檢測到AIV抗體，在攻毒后第6天滴鼻組和肺遞送組都可檢測到AIV抗體存在，且抗體水平呈上升趨勢，且肺遞送組豚鼠比滴鼻組豚鼠產(chǎn)生的抗體水平高，攻毒后第6和15天2組豚鼠抗體效價(jià)差異顯著（P<0.05）。

圖5 豚鼠抗體水平檢測Fig.5 Results of antibody detection in guinea pig

2.3 H9N2亞型AIV氣溶膠發(fā)生、傳播與傳染驗(yàn)證

2.3.1 排毒檢測結(jié)果 由表2可知，在接種病毒后第2天，各試驗(yàn)組均未檢測到排毒，從第4天開始，接種組和直接接觸組的豚鼠鼻洗液中可檢測到病毒存在，病毒分離率分別為57.14%和28.57%（表2），在第8天，接種組和直接接觸組都達(dá)到排毒高峰期，分離率為100%，排毒時(shí)間一直持續(xù)到第16天；飛沫傳播組從第6天開始可檢測到排毒，分離率為42.86%，在第10天，飛沫傳播組達(dá)到排毒高峰期；氣溶膠感染組在整個(gè)試驗(yàn)周期中均未能從豚鼠鼻洗液中檢測到病毒存在。

表2 SD18株感染豚鼠排毒檢測結(jié)果Table 2 Results of detection virus excretion after SD18 strain inoculated guinea pigs %

2.3.2 流感病毒氣溶膠檢測結(jié)果 在豚鼠接種病毒后3～15 d內(nèi)，在隔離器的空氣中均未能檢測到病毒，尚未確認(rèn)該株病毒的氣溶膠傳染。

2.3.3 血清抗體水平檢測結(jié)果 SD18株感染豚鼠后，在7～21 d，接種組、直接接觸組和飛沫傳播組都可檢測到AIV抗體存在，說明SD18株可在豚鼠間通過直接接觸和飛沫傳播的方式傳播病毒并感染豚鼠使其產(chǎn)生抗體（圖6）。

圖6 SD18株感染豚鼠后血清抗體檢測結(jié)果Fig.6 Results of antibody titer of guinea pigs after inoculated with SD18 strain

2.4 H9N2亞型AIV感染BEAS-2B細(xì)胞效果

2.4.1 H9N2亞型AIV在BEAS-2B細(xì)胞的增殖 BEAS-2B細(xì)胞接種病毒后在熒光顯微鏡下觀察，12 h時(shí)能檢測到病毒，視野下有少量細(xì)胞呈現(xiàn)熒光（圖7B），24 h時(shí)視野下熒光增多，且熒光強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)（圖7C），到36 h時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢（圖7D）。

A,陰性對照：B～D,BEAS-2B細(xì)胞感染SD18株后12、24 和36 hA,Negative control;B-D,BEAS-2B cells infected with SD18 strain for 12,24 and 36 h,respectively圖7 BEAS-2B細(xì)胞感染SD18株后間接免疫熒光檢測結(jié)果（200×）Fig.7 Indirect immunofluorescence assay result of BEAS-2B cells infected with SD18 strain （200×）

2.4.2 BEAS-2B感染后相關(guān)免疫因子及受體表達(dá) SD18株感染BEAS-2B細(xì)胞后，與對照組相比，TLR3和TLR7基因表達(dá)量在整個(gè)過程中均極顯著上調(diào)（P<0.01），且分別在24和36 h達(dá)到高峰（圖8A、8B）。抗病毒蛋白MX和OAS基因表達(dá)量在整個(gè)過程中均極顯著上調(diào)（P<0.01），且分別在36和24 h時(shí)達(dá)到高峰（圖8F、8G）。 炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8和IFN-β基因表達(dá)量也出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)，其中IL-6和IL-8基因表達(dá)量在36 h時(shí)均極顯著上調(diào)（P<0.01，圖8C、8D）；IFN-β基因表達(dá)量在24 h時(shí)達(dá)到高峰（P<0.01，圖8E）。

圖8 SD18株感染BEAS-2B細(xì)胞后細(xì)胞因子表達(dá)情況Fig.8 Expression of cytokines in BEAS-2B cells infected with SD18 strain

3 討 論

近年來，H9N2亞型AIV已在全球范圍內(nèi)從不同種類的畜禽中分離出來[17-18]。H9N2亞型AIV最初出現(xiàn)在亞洲，隨后非洲、歐洲和美國等地也開始出現(xiàn)，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[19-21]。Peacock等[22]個(gè)別分支的H9N2亞型AIV已具有感染人類的能力，這對全球家禽業(yè)生產(chǎn)及人類健康構(gòu)成了威脅。研究表明，源自哺乳動物的H9N2亞型AIV對小鼠毒性更高，且可在小鼠全身復(fù)制并具有神經(jīng)毒性[23-24]。對山東省從事家禽養(yǎng)殖業(yè)的工人進(jìn)行H9N2亞型AIV抗體檢測發(fā)現(xiàn)約有2.3%的家禽養(yǎng)殖從業(yè)者血清抗體呈陽性[25]。因此，必須注意H9N2亞型AIV在哺乳動物中的適應(yīng)性進(jìn)化。Lina等[26]用2017年分離出的H9N2亞型AIV進(jìn)行豚鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),其可感染豚鼠，但感染的豚鼠不能通過直接接觸傳播病毒。本研究結(jié)果表明,SD18株不僅可通過直接接觸感染豚鼠，而且還可通過飛沫傳播感染豚鼠。這說明H9N2亞型AIV的跨種傳播能力正在變強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺遞送攻毒方式感染的豚鼠比滴鼻方式感染的豚鼠排毒量、抗體水平及抗病毒蛋白表達(dá)量更高，肺遞送儀器依靠遞送管和噴霧裝置可直接插入到動物氣管內(nèi)部再發(fā)生氣溶膠，其真實(shí)模擬了日常的吸入狀態(tài)，產(chǎn)生的病毒氣溶膠可到達(dá)肺部深處，導(dǎo)致肺部大量免疫細(xì)胞的驅(qū)化、聚集，甚至形成“細(xì)胞風(fēng)暴”，使宿主產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，這表明病毒氣溶膠對機(jī)體產(chǎn)生的危害更大，可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答來抵抗病毒。近年來，已有研究證明TLR7受體可識別病毒的單鏈RNA（ssRNA），其中包括對甲型流感病毒的識別，因此，TLR7在誘導(dǎo)針對RNA病毒的抗病毒應(yīng)答中起著重要作用[27]。而TLR3在識別病毒的雙鏈RNA（dsRNA）后，可激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和核因子-κB（NF-κB）的信號傳導(dǎo)，啟動先天免疫應(yīng)答反應(yīng)，抵御病原體的侵入[28]。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)感染SD18株后豚鼠肺部抗病毒蛋白MX、OAS表達(dá)顯著增高，并持續(xù)表達(dá)約2周。OAS是由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白，在哺乳動物的抗病毒機(jī)制中起著重要作用[29]。病毒侵入機(jī)體后，OAS可誘導(dǎo)病毒RNA在受感染的細(xì)胞內(nèi)衰變，從而有效抑制病毒的進(jìn)一步復(fù)制[30]。由Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗黏病毒蛋白MX是一種功能強(qiáng)大的抗病毒蛋白，它可抑制正黏病毒的復(fù)制[31]。MX蛋白是已知的細(xì)胞內(nèi)阻止甲型流感病毒復(fù)制的因子，其可保護(hù)哺乳動物免受流感病毒侵襲，還為抵抗流感病毒的跨種傳播提供了強(qiáng)大的屏障[32]。因此，豚鼠肺部抗病毒蛋白及受體表達(dá)量的變化說明豚鼠先天性免疫系統(tǒng)被激活并發(fā)揮抗感染的作用。

流感病毒主要通過與污染物的直接接觸、消化道及氣溶膠進(jìn)行傳播，其中病毒氣溶膠可在空氣中懸浮較長時(shí)間并能進(jìn)入呼吸器官的深部，傳播快、距離遠(yuǎn)，這使得控制更加困難。研究表明，流感病毒的氣溶膠傳播是人與人之間傳播的一種主要方式[33]。流感病毒顆?？稍跉馊苣z內(nèi)保持傳染性，并可在房間內(nèi)傳播[34]。Blachere等[35]在醫(yī)院的急診科檢測出空氣中存在流感病毒RNA。有許多指標(biāo)表明，H9N2亞型AIV可能直接或間接地參與下一次流感大流行的發(fā)生[36]。本研究結(jié)果表明，H9N2亞型AIV SD18株接種豚鼠后能使豚鼠感染，在豚鼠的肺臟組織和氣管內(nèi)可檢測到病毒復(fù)制，且肺臟組織內(nèi)病毒滴度更高。SD18株還可通過直接接觸和飛沫傳播的方式感染豚鼠，致使豚鼠排毒并產(chǎn)生獲得性免疫反應(yīng)。本研究通過對直接接觸組和飛沫傳播組進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，直接接觸組的豚鼠比飛沫傳播組的豚鼠排毒時(shí)間更早、抗體水平更高，這說明與患病動物直接接觸時(shí)病毒傳播速度最快，風(fēng)險(xiǎn)最大，飛沫傳染的發(fā)生是由其距離和病毒含量決定的。隔離器B中的氣溶膠感染組豚鼠體內(nèi)既未排毒也未產(chǎn)生抗體，在隔離器中也沒有檢測到病毒氣溶膠，這說明未發(fā)生SD18株AIV氣溶膠的形成，即豚鼠間的氣溶膠傳染未能獲得驗(yàn)證。以上結(jié)果表明，SD18株可通過直接接觸和飛沫傳播的方式傳播病毒感染豚鼠，但目前還不具備通過氣溶膠傳播病毒感染豚鼠的能力。

由于人呼吸道上皮細(xì)胞中存在α-2,6或α-2,3唾液酸受體，所以流感病毒更易與上皮細(xì)胞結(jié)合[37-39]。Xing等[40]研究表明，TLR3、TLR7是在H9N2亞型AIV感染原代人支氣管上皮細(xì)胞后誘導(dǎo)的主要受體。SD18株感染BEAS-2B細(xì)胞后的12 h時(shí)能檢測到病毒，在24 h時(shí)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制能力最強(qiáng)。相關(guān)的免疫因子與對照組相比顯著上調(diào)，這表明SD18株可在人支氣管上皮細(xì)胞中復(fù)制并誘導(dǎo)其免疫因子高水平表達(dá)，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。本研究分離到的SD18株AIV無需提前適應(yīng)就可感染豚鼠并使其排毒及產(chǎn)生免疫反應(yīng)，且還可通過直接接觸及飛沫傳播感染豚鼠并使其產(chǎn)生抗體。這表明近年來H9N2亞型AIV的致病性及跨種傳播能力正在慢慢變強(qiáng)。提示應(yīng)加強(qiáng)對H9N2亞型AIV致病性、傳播能力及在哺乳動物上的適應(yīng)性進(jìn)化的研究，有助于盡早對H9N2亞型AIV可能帶來的危害風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行防控，防止出現(xiàn)重大損失。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型AIV具有不經(jīng)適應(yīng)性傳代便可直接感染豚鼠的能力，且可通過飛沫傳播感染豚鼠并使其產(chǎn)生抗體。另外，通過肺遞送攻毒方式誘導(dǎo)的豚鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)更強(qiáng)烈，排毒量更高，SD18株可感染BEAS-2B細(xì)胞，并在24 h達(dá)到復(fù)制高峰。