申 祥，陳伶慧，姚競杰，王三虎，白躍宇，張曉建

（1.河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000；2.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，鄭州 410100）

CC趨化因子（CC chemokines）又稱為β-趨化因子（β-chemokines），是指28種具有N-端CC結(jié)構(gòu)域的趨化細(xì)胞因子[1]，所有的趨化因子都會特異性地與10個趨化因子受體（1-10）相結(jié)合，在淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用，對免疫系統(tǒng)細(xì)胞行使正常功能至關(guān)重要[2]。CC趨化因子受體7（CC chemokine receptor 7，CCR7）屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，對于正常免疫功能和多種炎癥性疾病中的白細(xì)胞募集起著關(guān)鍵的作用[3-4]。CCR7在不同類型的白細(xì)胞中表達(dá)，與趨化因子結(jié)合并發(fā)出信號，調(diào)節(jié)白細(xì)胞對趨化因子表達(dá)量較高部位的黏附和趨化。趨化因子配體和CCR7在一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中相互作用，大多數(shù)趨化因子可以激活多個趨化因子受體，而CCL19和CCL21是CCR7僅有的配體[5]。CCR7在T細(xì)胞的運(yùn)輸中起著關(guān)鍵的作用，有助于正常的T細(xì)胞選擇，增強(qiáng)機(jī)體對病毒感染的免疫反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)。此外，CCR7還會促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[6-8]和干細(xì)胞分化[9-11]。目前，國內(nèi)外針對CCR7的研究主要集中在免疫和癌癥等方面，與牛炎癥相關(guān)的報(bào)道較少。本研究以中國荷斯坦奶牛為研究對象，使用PCR方法擴(kuò)增并克隆牛CCR7基因CDS區(qū)序列，通過生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行分析和預(yù)測，利用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測CCR7基因在健康奶牛和患乳腺炎奶牛乳腺組織中的表達(dá)差異，以期為奶牛乳腺炎中CCR7基因的分子機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 選取河南省某規(guī)模化養(yǎng)殖場內(nèi)4歲左右的健康和金黃色葡萄球菌感染的中國荷斯坦奶牛各3頭，采集乳腺組織放入液氮中保存。

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶（NdeⅠ和XhoⅠ）、Taq酶、DL2000 DNA Marker均購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒、細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒、FastSuper RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；胰蛋白陳、酵母提取物均購自O(shè)XOID公司；瓊脂粉、氨芐青霉素、X-Gal、IPTG均購自Solarbio公司。其他試劑如無特殊說明均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI中牛CCR7基因編碼序列（GenBank登錄號：NM_001024930.3）和GAPDH內(nèi)參基因序列（登錄號：NM_001034034.2），利用NCBI中的Primer-BLAST設(shè)計(jì)特異性引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成 按RNA提取試劑盒說明書提取奶牛乳腺組織RNA，瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop分光光度計(jì)檢測RNA質(zhì)量及濃度。 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 克隆 PCR擴(kuò)增體系25 μL：cDNA模板1 μL，PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，64.7 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，將回收得到的目的條帶與pMD18-T載體進(jìn)行連接。連接體系10 μL：酶切產(chǎn)物1 μL，酶切質(zhì)粒6 μL，Buffer 2 μL，T4連接酶1 μL。4 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物與100 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞在冰上混合，30 min后42 ℃水浴90 s，立刻冰水浴2 min；加入900 μL無AMP+培養(yǎng)基，37 ℃、160 r/min搖菌1 min，180 r/min搖1 h；7 000 r/min離心2 min，棄去800 μL，余下的混勻涂板，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證及測序，測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對分析。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用NCBI獲取不同物種CCR7基因序列：牛（登錄號：NM_001024930.3）、犬（登錄號：XM_038676552.1）、馬（登錄號：XM_001500181.5）、貓（登錄號：XM_003996833.4）、雞（登錄號：NM_001198752.1）、人（登錄號：NM_001301714.2）、小鼠（登錄號：NM_001301713.1）、綿羊（登錄號：XM_004012868.4）、豬（登錄號：NM_001001532.3），并運(yùn)用軟件DNAStar中MegAlign進(jìn)行相似性比對，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用ProtParam程序分析蛋白基本理化性質(zhì)；利用ProtScale程序分析蛋白親/疏水性；利用SOPMA和SWISS-MODEL程序預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；利用PSORT Ⅱ軟件預(yù)測亞細(xì)胞定位；利用預(yù)測蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（https:∥www.genecards.org/）；利用SignalP-4.1軟件預(yù)測蛋白信號肽剪切位點(diǎn)；利用TMHMM 2.0軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)域，具體網(wǎng)址如表2所示。

表2 生物信息學(xué)分析軟件Table 2 Bioinformatics analysis softwares

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測CCR7基因的表達(dá) 利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對CCR7基因在健康和炎性奶牛乳腺組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，RNase-free ddH2O 6.4 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。結(jié)果用2-ΔΔCt相對定量分析方法進(jìn)行分析，采用IBM SPSS Statistics 24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著;P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牛CCR7基因CDS區(qū)的克隆

以奶牛乳腺組織cDNA為模板進(jìn)行CCR7基因CDS區(qū)擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶清晰明亮，序列長度為1 325 bp（圖1），與目的片段大小一致。用TA克隆方法對CCR5基因PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行分析后顯示，成功克隆了牛CCR7基因的CDS區(qū)域序列。

圖1 牛CCR7基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of CDS region of bovine CCR7 gene

2.2 相似性比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索收集到9個物種CCR7基因編碼序列，利用MegAlign軟件進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，牛與綿羊之間相似性較高，為95.2%；與雞相似性較低，為56.4%（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，牛與綿羊之間的遺傳距離最近，而與雞最遠(yuǎn)（圖3），與相似性分析結(jié)果一致。

圖2 CCR7基因核苷酸序列相似性比對Fig.2 Similarity alignment of nucleotide sequences of CCR7 gene

圖3 CCR7基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CCR7 gene

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì) 牛CCR7蛋白編碼379個氨基酸，分子質(zhì)量為14.56 ku，分子式為C1970H3112N486O521S27，有6 116個原子，理論等電點(diǎn)為8.89，預(yù)測不穩(wěn)定系數(shù)為31.29，表明該蛋白理化性質(zhì)穩(wěn)定。在組成牛CCR7基因編碼氨基酸的20種氨基酸中，亮氨酸含量最多，纈氨酸含量次之，組氨酸和色氨酸的含量最低（表3），其中，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為24個，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為34個。

表3 牛CCR7蛋白氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of bovine CCR7 protein

2.3.2 信號肽和跨膜螺旋結(jié)構(gòu) SignalP-4.1軟件預(yù)測結(jié)果顯示，牛CCR7蛋白信號肽切割位點(diǎn)可能存在于第24和25位氨基酸之間（圖4）。 TMHMM 2.0軟件預(yù)測結(jié)果顯示，牛CCR7蛋白存在6個跨膜結(jié)構(gòu)，分別位于第63-85、97-116、131-150、171-190、229-251及264-286位氨基酸處（圖5）。

圖4 牛CCR7蛋白信號肽預(yù)測Fig.4 Signal peptide prediction of bovine CCR7 protein

圖5 牛CCR7蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 Transmembrane domain prediction of bovine CCR7 protein

2.3.3 親/疏水性分析 親/疏水性分析結(jié)果顯示，牛CCR7蛋白整個多肽中第269位纈氨酸分值最高（3.844），疏水性最強(qiáng)；第256位苯丙氨酸分值最低（-2.478），親水性最強(qiáng)。平均親水系數(shù)（GRAVY）為0.640，表明該基因編碼蛋白為疏水性蛋白（圖6）。

圖6 牛CCR7蛋白疏水性預(yù)測Fig.6 Hydrophobicity prediction of bovine CCR7 protein

2.3.4 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu) 牛CCR7蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、 β-轉(zhuǎn)角、 延長鏈及無規(guī)則卷曲構(gòu)成，占比分別為51.72%、1.85%、14.78%和31.65%（圖7）。CCR7蛋白三級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲（圖8）。蛋白互作分析顯示，牛CCR7蛋白可能與CCL19、CCL21、CD247等蛋白之間存在互作（圖9）。

最短豎線，無規(guī)則卷曲；較短豎線，β-轉(zhuǎn)角；較長豎線，延伸鏈；最長豎線，α-螺旋The shortest vertical line，Random coil;The shorter vertical line,Beta turn;The longer vertical line,Extended chain;The longest vertical line,Alpha helix圖7 牛CCR7蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Secondary structure prediction of bovine CCR7 protein

圖8 牛CCR7蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Tertiary structure prediction of bovine CCR7 protein

圖9 牛CCR7蛋白相互作用分析Fig.9 Interaction analysis of bovine CCR7 protein

2.3.5 亞細(xì)胞定位 亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，牛CCR7蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中（66.7%），線粒體（22.2%）和細(xì)胞外（11.1%）也有分布，推測其可能是一種跨膜蛋白。

2.4 CCR7基因在健康和炎性奶牛乳腺組織中的表達(dá)量

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，CCR7基因在健康奶牛乳腺組織中的表達(dá)量極顯著低于炎癥奶牛乳腺組織（P<0.01，圖10）。

**，差異極顯著（P<0.01）**，Extremely significant difference （P<0.01）圖10 CCR7基因在健康和炎性奶牛乳腺組織中的表達(dá)差異Fig.10 The expression difference of CCR7 gene in breast tissues between healthy and inflammatory dairy cows

3 討 論

20世紀(jì)末，Birkenbach等[12]使用愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr virus，EBV）感染B細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)了一種新的產(chǎn)物并把它命名為EBI-1，之后Yashida等[13]將其改名為CCR7，CCR7逐漸成為趨化因子受體中的熱門研究對象之一。CCR7主要通過淋巴細(xì)胞表達(dá)[14-15]，在與其配體CCL21結(jié)合后，可使細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白聚合，引起鈣離子向細(xì)胞內(nèi)流動，細(xì)胞形成偽足[16]，調(diào)控淋巴細(xì)胞歸巢，啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖，但如果這些調(diào)節(jié)出現(xiàn)問題時，會導(dǎo)致一些慢性炎癥性疾病和腫瘤疾病的發(fā)生[17]。據(jù)報(bào)道，在黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、食管癌、乳腺腫瘤、肺癌等疾病中都發(fā)現(xiàn)了CCR7蛋白的表達(dá)出現(xiàn)異常[9,18-21,22-23]。 CCR7在腫瘤患者中的表達(dá)與CCL21水平呈顯著正相關(guān)，CCR7趨化因子軸由CCR7-CCL21和CCR7-CCL19組成，其對于癌癥來說有2個重要的作用：一是該軸明顯與多個效應(yīng)細(xì)胞的運(yùn)輸過程有關(guān)，這些效應(yīng)細(xì)胞會對生長中的腫瘤產(chǎn)生免疫應(yīng)答作用，說明阻止癌癥蔓延的治療過程中可能會涉及到增強(qiáng)該軸的作用；二是CCR7軸在腫瘤細(xì)胞向淋巴系統(tǒng)的遷移和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，其會導(dǎo)致癌癥的擴(kuò)散和加重，說明如果減少CCR7軸信號傳導(dǎo)的話，可能會有利于癌癥的預(yù)防和治療[24]。研究表明，CCR7-CCL21軸通過激活JAK2/STAT3信號通路調(diào)控上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，增加口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）的細(xì)胞干性，推測CCR7-CCL21可能會作為OSCC預(yù)防和治療過程中的一個有效靶點(diǎn)[11]。CCR7在腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防及治療等方面存在巨大的潛力，其可作為腫瘤標(biāo)記物，通過檢測CCR7及其相關(guān)蛋白和因子的表達(dá)來預(yù)測腫瘤的診斷和轉(zhuǎn)移方向，從而對腫瘤的臨床治療提供一定的指導(dǎo)。本試驗(yàn)預(yù)測了CCR7編碼蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，對將CCR7用于腫瘤的防治提供一定的參考。

CCR7通過多種途徑參加了許多炎性疾病的發(fā)生，利用抗體或藥物來控制CCR7基因的表達(dá)可能會是今后治療這些炎癥疾病的一個重要策略。研究發(fā)現(xiàn)，在人類哮喘疾病中，CCR7與CCL21之間的相互作用會導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞成熟并向T細(xì)胞遞呈抗原，從而促使T細(xì)胞活化產(chǎn)生氣道炎癥反應(yīng)，患者血清及大鼠肺臟組織中CCR7基因表達(dá)量明顯增高，經(jīng)過藥物治療后模型小鼠體內(nèi)的CCR7基因表達(dá)水平明顯下降[25]，風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織中CCR7基因表達(dá)量明顯升高，患者血漿中CCR7基因表達(dá)量也會升高[26]；CCR7與CCL21的相互作用還會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向著分泌IL-6和IL-23的M1細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而M1細(xì)胞又會讓T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成，加劇患者的病情[27]。Kawashima等[28]研究發(fā)現(xiàn)，慢性腸炎患者腸系膜淋巴結(jié)中CCR7基因mRNA高表達(dá)，推測CCL21和CCR7+T細(xì)胞可能會產(chǎn)生Th1優(yōu)勢免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而形成慢性腸炎的一種免疫反應(yīng)機(jī)制。綜上所述，CCR7基因在炎性疾病的發(fā)生中起著重要的作用，抑制CCR7基因表達(dá)可以對炎癥疾病的治療產(chǎn)生積極的作用。本試驗(yàn)中，實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，在炎性乳腺上皮細(xì)胞中CCR7基因表達(dá)量極顯著增高，與上述研究結(jié)果具有一致性。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)成功克隆了牛CCR7基因，其CDS區(qū)片段全長1 325 bp，編碼379個氨基酸，屬于疏水性跨膜蛋白，與綿羊相似性較高，親緣關(guān)系較近，其二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)均主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。定量結(jié)果顯示，CCR7基因在健康牛乳腺組織中的表達(dá)量極顯著低于炎性牛乳腺組織。