付思齊，任冰冰，劉勇，姚志偉，王博，孫大慶

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院小兒外科，天津 300052

慢傳輸型便秘（STC）屬于功能性便秘的一種，是指一類由結腸傳輸減慢，內(nèi)容物通過延遲導致的頑固性便秘，主要表現(xiàn)為排便困難，排便次數(shù)減少，排便不盡感。最新資料顯示，我國總體慢性便秘的患病率為10.9%，歐美患病率為10.1%，兒童和青少年高達30%，且便秘癥狀隨年齡進行性加重，但其發(fā)生機制未明。大量研究表明，腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）功能紊亂、神經(jīng)遞質(zhì)分泌失調(diào)與STC 的發(fā)病機制相關［1-2］。ENS 分為肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢，前者主要調(diào)控腸道平滑肌運動功能，后者調(diào)節(jié)腸道血流及黏膜分泌［3］。消化道全層鋪片技術可直觀地觀察腸道肌間神經(jīng)叢的變化，但目前相關的研究較少［4-5］。2021 年 4 月—11 月，本研究采用洛哌丁胺誘導的STC 小鼠模型，通過改良腸神經(jīng)鋪片技術和免疫熒光染色觀察STC 模型小鼠結腸肌間神經(jīng)元變化。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級8 周齡雄性C57BL/6J 小鼠20只，體質(zhì)量為20~23 g，均購于北京維通利華實驗動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學總醫(yī)院普外科研究所恒溫動物房內(nèi)，保證充足的進食和飲水，并嚴格遵守天津醫(yī)科大學相關的動物使用規(guī)定。主要試劑儀器有：洛哌丁胺（美國Sigma-Aldrich 公司）、神經(jīng)元特異性標志物HuC/D 抗體（Thermo Fisher Scientific 公司，1∶500）、神經(jīng)纖維標志物 PGP9.5 抗體（Novus Biologicals 公司，1∶500）、神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）抗體（Thermo Fisher Scientific 公司，1∶300）及 Caspase3 抗體（Cell Signaling Technology 公司，1∶300）、山羊抗兔紅色熒光二抗（上海生工生物工程股份有限公司，1∶500）、山羊抗小鼠綠色熒光二抗（上海愛必信生物科技有限公司，1∶300）、驢抗雞綠色熒光二抗（上海愛必信生物科技有限公司，1∶300），解剖顯微鏡（S7/OPMISensera，德國蔡司公司）、顯微手術器械（中國美斯諾醫(yī)療器械有限公司）、正置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 動物分組及模型構建 將20 只8 周齡雄性C57BL/6J 小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后隨機分為對照組（CON 組）、慢傳輸型便秘組（STC 組），每組10 只。STC 組給予洛哌丁胺溶液（10 mg/kg）灌胃，每日2次，持續(xù)12 d；CON 組給予等量生理鹽水灌胃，每日2次，持續(xù)12 d［6-7］。

1.3 小鼠一般情況、糞便性狀觀察 每天觀察小鼠皮毛色澤、精神狀態(tài)及活動度，并對小鼠體質(zhì)量、攝食量進行監(jiān)測。造模結束后禁食不禁水16 h，次日收集每只小鼠6 h 內(nèi)糞便，記錄粒數(shù)，然后對其稱重并記錄為糞便濕重。將糞便置于50 ℃恒溫箱烘烤后稱糞便干重，計算糞便含水量，糞便含水量（%）=（糞便濕重-糞便干重）/糞便濕重×100%。

1.4 腸道傳輸時間檢測 造模結束后禁食不禁水16 h，次日將每只小鼠分單籠，給予印度墨水0.2 mL灌胃。每10 min 觀察1 次，記錄首粒黑便的排出時間，用于評估腸道傳輸時間。

1.5 改良腸神經(jīng)全層鋪片制備 糞便性狀觀察及腸道傳輸時間檢測完成后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，留取長約4 cm 的近端、遠端結腸組織，使用生理鹽水反復沖洗腸腔直至無殘存糞便。取10 cm 培養(yǎng)皿在其底部鋪放硅膠墊，將清潔后的結腸使用昆蟲針固定其兩端，使腸管稍有張力，加入冰生理鹽水浸沒腸管。在解剖顯微鏡下去除腸系膜緣殘留的脂肪組織，從結腸任意端開始，使用兩個眼科鑷輕輕鉗夾腸管漿膜及系膜緣，仔細輕柔的分離，使黏膜和縱行肌撕裂，但環(huán)形肌及內(nèi)部的黏膜完整，緩慢的剝?nèi)〗Y腸外縱行肌層。剝?nèi)⊥瓿梢院蠹舫蛇m當大小結腸全層鋪片于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.6 結腸HuC/D+、PGP9.5+和nNOS+神經(jīng)元數(shù)目檢測 采用免疫熒光染色法。將制備好的結腸全層鋪片標本在0.5% Triton X-100 溶液中，室溫破膜1 h，用 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；5%BSA 室溫封閉2 h，降低非特異性染色；滴加適宜濃度的一抗，分別為HuC/D抗體（1∶500）、PGP9.5抗體（1∶500）、nNOS抗體（1∶300），4 ℃過夜；次日用PBS 漂洗3 次，每次5 min，滴加二抗，分別為山羊抗小鼠綠色熒光二抗（1∶300）、驢抗雞綠色熒光二抗（1∶300）、山羊抗兔紅色熒光二抗（1∶500），室溫避光孵育1 h；再次用PBS漂洗3次，每次5 min，將鋪片組織用眼科鑷緩慢平鋪于載玻片上，滴加含DAPI抗熒光衰減封片劑進行封片，室溫放置30 min，于正置熒光顯微鏡下進行觀察。HuC/D+信號、PGP9.5+信號均顯綠色，nNOS+信號顯紅色。每張標本隨機取5個不重合的高倍視野，分別計數(shù)HuC/D+和nNOS+神經(jīng)元的數(shù)目（個/高倍鏡視野），取平均值。每張標本隨機取5 個不重合的高倍視野，測定PGP9.5熒光強度（AU/H），取平均值。

1.7 結腸HuC/D+神經(jīng)元凋亡檢測 采用免疫熒光共定位法。按上述步驟處理好標本，同時滴加HuC/D抗體（1∶500）和Caspase3抗體（1∶300），4 ℃過夜，次日用PBS漂洗3次，每次5 min，滴加山羊抗小鼠綠色熒光二抗（1∶300）、山羊抗兔紅色熒光二抗（1∶500），余下步驟同免疫熒光染色法，于正置熒光顯微鏡下進行觀察。HuC/D+信號顯綠色，Caspase3+信號顯紅色，雙陽性信號顯黃色。每張標本隨機取5個不重合的高倍視野，分別計數(shù)HuC/D+神經(jīng)元、Caspase3+細胞及Casepase3+HuC/D+神經(jīng)元的數(shù)目（個/H），取平均值。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般情況 洛哌丁胺灌胃后，STC 組小鼠立即出現(xiàn)明顯的進食量下降，第3天進食量達最低，之后稍恢復，與CON 組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。見圖1。隨著洛哌丁胺處理不斷進行，STC組小鼠皮毛開始變暗，精神萎靡，活動減少，在第6天出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量減輕，與CON 組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。見圖2。

圖1 兩組食物攝入量變化

圖2 兩組體質(zhì)量變化

2.2 兩組糞便性狀及腸道傳輸時間 與CON 組比較，STC 組糞便粒數(shù)減少、濕重減輕、含水量降低、黑便排出時間明顯延長，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜ 0.05）。見表1。

表1 兩組糞便性狀及腸道傳輸時間比較（）

表1 兩組糞便性狀及腸道傳輸時間比較（）

注：與CON組比較，*P＜0.05。

腸道傳輸時間（min）85.80±16.92 189.30±28.10*組別CON組STC組n 6 h糞便粒數(shù)（個）37.70±5.24 13.70±3.30*10 10濕重（mg）420.93±43.43 121.28±24.41*含水量（%）44.14±6.31 29.99±5.09*

2.3 兩組結腸肌間神經(jīng)元數(shù)目變化 與CON 組比較，STC 組全結腸肌間HuC/D+神經(jīng)元數(shù)目減少，神經(jīng)纖維熒光強度減弱（P均＜0.05），而兩組nNOS+神經(jīng)元數(shù)目比較未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組結腸肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元比較（）

表2 兩組結腸肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元比較（）

注：與CON組比較，*P＜0.05。

組別CON組STC組n遠端5.4±1.74 4.9±1.87遠端26.2±4.28 14.5±3.96*PGP9.5熒光強度（AU/H）近端122.8±9.52 86.3±6.68*10 10 HuC/D+神經(jīng)元（個/高倍鏡視野）近端23.9±5.59 16.3±3.44*遠端129.5±9.69 85.9±6.69*nNOS+神經(jīng)元（個/高倍鏡視野）近端5.0±1.86 5.4±1.66

2.4 兩組結腸肌間神經(jīng)元凋亡情況 與CON 組比較，STC 組 Casepase3+和 Casepase3+HuC/D+神經(jīng)元數(shù)目增多（P均＜0.05），結腸肌間神經(jīng)元凋亡增加。見表3。

表3 兩組結腸肌間Casepase3+和Casepase3+HuC/D+神經(jīng)元數(shù)目比較（個/高倍鏡視野，）

表3 兩組結腸肌間Casepase3+和Casepase3+HuC/D+神經(jīng)元數(shù)目比較（個/高倍鏡視野，）

注：與CON組比較，*P＜0.05。

組別CON組STC組Casepase3+HuC/D+神經(jīng)元9.1±2.06 13.6±2.77*n 10 10 Casepase3+神經(jīng)元12.3±2.80 26.0±3.70*

3 討論

STC 是以腸道傳輸時間延長為特點的功能性便秘，嚴重者出現(xiàn)急性腸梗阻、腸壞死穿孔，可危及生命［8-9］。結腸推動力不足是STC 的主要表現(xiàn)，結腸傳輸試驗是檢測結腸推動力最重要的檢查方式［10-11］。本研究使用洛哌丁胺誘導成功建立STC 小鼠模型，小鼠進食量下降，體質(zhì)量減輕，皮毛變暗，精神萎靡，活動減少，且腸道傳輸時間延長，這些癥狀和體征明顯符合STC的特點。

腸道動力調(diào)控的關鍵是ENS、平滑肌細胞和Cajal 間質(zhì)細胞（ICC）［3］。ENS 是胃腸道特有的自主神經(jīng)系統(tǒng)，可獨立于交感神經(jīng)系統(tǒng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)腸道運動、分泌、新陳代謝等功能，故有“腸腦”之稱。腸道平滑肌運動功能主要由ENS 肌間神經(jīng)叢調(diào)控，因此本研究主要關注肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)元變化。HuC/D 屬于Hu 蛋白家族，是特異性神經(jīng)元標志物，可標記腸道所有的神經(jīng)元，而不是特定的亞群，因此被稱為泛神經(jīng)元標記物［12］。PGP9.5是一種存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中的神經(jīng)元特異性蛋白，在細胞質(zhì)和細胞核中均表達。PGP9.5能精準定位于神經(jīng)元細胞質(zhì)，用于分析神經(jīng)纖維形態(tài)、分布和密度狀況。相比于PGP9.5，HuC/D的優(yōu)勢在于適合標記和量化單個神經(jīng)元。本研究發(fā)現(xiàn)，STC 小鼠全結腸肌間HuC/D+神經(jīng)元數(shù)目減少，PGP9.5熒光強度降低，提示結腸肌間總神經(jīng)元數(shù)目減少，神經(jīng)纖維密度降低。腸道平滑肌收縮舒張受ENS 支配，腸神經(jīng)元的減少可直接導致腸道平滑肌運動功能紊亂。

有研究顯示，左半結腸傳輸時間延遲是STC 患者主要特征，尤其是降結腸和乙狀結腸［13］。在STC患者中，始于結腸近端的高振幅傳播收縮大多終止于橫結腸中部［14］；STC 患者結腸近端對膽堿能刺激的節(jié)段性收縮反應嚴重受損，并且常規(guī)收縮頻率較正常人群降低約一半（即＜3%）［15］。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)HuC/D+神經(jīng)元數(shù)目和PGP9.5熒光強度在STC小鼠近端和遠端結腸均減少及降低，且近端和遠端比較無統(tǒng)計學差異；證實近端和遠端結腸均有腸神經(jīng)元減少，可導致全結腸動力異常。目前大部分研究將遠端結腸動力紊亂作為STC 的主要特征，可能是由于遠端結腸的收縮活動較明顯、易觀察。

氮能神經(jīng)元在ENS 肌間神經(jīng)叢中密集分布。一氧化氮（NO）是ENS 氮能神經(jīng)元最主要的抑制性遞質(zhì)，可舒張胃腸道平滑肌，使胃腸運動減弱［16］。nNOS 是腸神經(jīng)系統(tǒng)NO 合成過程中的關鍵限速酶，在神經(jīng)發(fā)育和突觸可塑性中發(fā)揮重要作用，nNOS標志物常用來研究氮能神經(jīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在STC患者結腸肌間神經(jīng)叢中 NOS+神經(jīng)元占比升高［17］，STC 患者結腸受NOS+神經(jīng)元支配也較正常人結腸明顯增強［18］。但也有報道STC患兒環(huán)形肌中的NOS+神經(jīng)纖維密度并沒有顯著改變［19］。本研究顯示，STC小鼠結腸肌間nNOS+神經(jīng)元數(shù)目無明顯變化，但HuC/D+神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，這可能與本研究的樣本量較少有關。目前STC小鼠結腸肌間nNOS+神經(jīng)元變化研究成果存在差異，說明nNOS+神經(jīng)元可能不是影響STC結腸動力的唯一因素。

有研究證實，嚴重STC 患者結腸肌間神經(jīng)叢中神經(jīng)節(jié)細胞、膠質(zhì)細胞和ICC 明顯減少，Bcl-2 的表達顯著降低，可能存在凋亡［20］。Caspase-3 是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族的一員，被認為是神經(jīng)元凋亡的關鍵媒介［21-23］。我們通過免疫熒光共定位結腸肌間神經(jīng)叢Caspase-3和HuC/D 標志物，發(fā)現(xiàn)STC小鼠結腸肌間神經(jīng)叢中Casepase3+細胞數(shù)目增多，且Casepase3+HuC/D+神經(jīng)元數(shù)目增多，證實STC 小鼠結腸肌間神經(jīng)元凋亡增加，提示結腸肌間神經(jīng)元的減少由凋亡導致。腸神經(jīng)元凋亡造成ENS 神經(jīng)元減少，神經(jīng)網(wǎng)絡稀疏，導致腸道平滑肌收縮舒張障礙，進而引發(fā)腸道傳輸功能紊亂。

綜上所述，本研究成功建立洛哌丁胺誘導STC小鼠模型，通過改良腸神經(jīng)全層鋪片技術，證實STC小鼠結腸肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元數(shù)目減少，神經(jīng)纖維密度降低，且出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡，這可能是STC小鼠結腸慢傳輸?shù)闹匾颉?/p>