徐琳琳，白瓊瓊，張金鵬，焦陽，殷德輝

徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221004

近年來，人獸共患傳染病呈現(xiàn)全球蔓延的趨勢，如布魯氏菌病，不僅對人類健康造成巨大威脅，也給世界各國經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失［1］。布魯氏菌感染雌性動(dòng)物后，會(huì)造成動(dòng)物流產(chǎn)；且人群對布魯氏菌普遍易感，人類通過直接接觸感染布魯氏菌的羊、牛、豬等牲畜及其分泌物或排泄物以及進(jìn)食被布魯氏菌污染的食品等感染［2］。由于人類布魯氏菌病的臨床表現(xiàn)多樣，缺乏特異度，因此診斷十分困難，易被誤診為登革熱、瘧疾、病毒性出血疾病等［3-5］。因而改進(jìn)現(xiàn)有的診斷方法，選擇合適的診斷抗原十分必要。2015 年 8 月—2018 年 10 月，本研究利用生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)設(shè)計(jì)一種新的布魯氏菌多表位融合蛋白（rMEP），并利用該蛋白構(gòu)建間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA），以實(shí)現(xiàn)對牛、羊等家畜血清的檢測，旨在探索一種新的布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 93份羊血清、74份牛血清，經(jīng)試管凝集試驗(yàn)（SAT）和玫瑰紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）確認(rèn)為布魯氏菌病陽性樣本；66份羊血清、79份牛血清樣本，經(jīng)SAT 和RBPT 確認(rèn)為布魯氏菌病陰性樣本。牛、羊血清樣本由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心（青島）提供。大腸桿菌BL21［DE3，生工生物工程（上海）股份有限公司］，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，美國Sigma 公司），PBS 緩沖液［生工生物工程（上海）股份有限公司］，96孔板（美國Corning公司），卵清蛋白（TCI，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社），HRP-重組蛋白G（美國Thermo 公司），SDS-PAGE 試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），EL-TMB 顯色試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，脂多糖（LPS，中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心），HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國Bioworld 公司），兔血清（天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司）；酶標(biāo)儀（BioTek，美國伯騰儀器有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），電泳儀（Bio-Rad，美國伯樂公司）。

1.2 外膜蛋白選擇 根據(jù)文獻(xiàn)［6-8］選擇4 個(gè)布魯氏菌外膜蛋白（OMP），即 OMP16、OMP31、OMP2b、BP26為目標(biāo)蛋白，在美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站 https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/下載所選蛋白的氨基酸序列，使用蛋白質(zhì)序列搜索算法工具（https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）進(jìn)行氨基酸序列比對，根據(jù)比對結(jié)果選擇布魯氏菌中的保守氨基酸序列。

1.3 OMP 表位預(yù)測 利用 ABCpred（http：//www.imtech.res.in/raghava/abcpred/）［9］、Bepipred（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred/0）［10］和 COBEpro（http：//scratch.proteomics.ics.uci. edu/）［11］三種表位預(yù)測工具，預(yù)測線性B細(xì)胞表位，并選擇三種預(yù)測工具重疊的B 細(xì)胞表位作為候選表位，利用IEDB（http：//tools.iedb.org/main/tcell/）表位預(yù)測工具預(yù)測T細(xì)胞表位。

1.4 rMEP 制備 采用原核表達(dá)系統(tǒng)制備rMEP，用linke‘rGGGS’串聯(lián)候選B、T 細(xì)胞表位，以免形成鉸鏈區(qū)。根據(jù)得到的氨基酸序列推斷出密碼子，并利用優(yōu)化網(wǎng)站（http：//www.jcat.de/）對原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的序列由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因合成，同時(shí)加入6 ×His 標(biāo)簽，以便隨后進(jìn)行純化和鑒定。將合成的基因片段與表達(dá)載體pGEM-T 連接，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21（DE3）中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng) OD600值達(dá)到 0.6時(shí)，用0.5 mmol的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，并在37 ℃下培養(yǎng)4 h。12 000 r/min 離心1 min，離心半徑 9.5 cm，收集細(xì)菌，用超聲破碎后SDS-PAGE 分離，出現(xiàn)目的條帶，即確定rMEP表達(dá)。

1.5 rMEP純化 采用鎳瓊脂糖親和色譜法。用超聲破碎菌體：將收集的細(xì)菌菌體用破碎buffer溶解，冰浴中超聲破碎菌體，功率400 W，20 min（超聲2 s、暫停6 s為1個(gè)循環(huán)）。超聲完畢，4 ℃下12 000 r/min離心20 min，離心半徑9.5 cm，棄上清液。沉淀用包涵體溶解Buffer進(jìn)行溶解，冰浴中用超聲破碎，功率400 W，20 min（2 s、暫停6 s 為1 個(gè)循環(huán)）。超聲完畢，4 ℃下12 000 r/min 離心20 min，離心半徑9.5 cm，上清做下一步純化。鎳瓊脂糖親和層析：取5 mL Ni-NTA，用10 倍柱床體積的Binding buffer 清洗平衡柱子，流速5 mL/min；上柱，流速為2 mL/min，收集穿透液；10 倍柱床體積的Binding buffer 清洗，流速10 mL/min；Wash buffer 洗雜，流速 5 mL/min，收集洗脫液；Elution buffer 洗脫，流速 2 mL/min，收集洗脫液。各洗脫組分經(jīng)SDS-PAGE 分離后，將純度較好的洗脫組分透析到buffer 中，4 ℃過夜后進(jìn)行陰離子交換層析。陰離子交換層析：取10 mL Q Sefinose FF填料，用10倍柱床體積的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5 mL/min；樣品上柱，流速為3 mL/min，收集穿透液；5 倍柱床體積的Wash buffer 清洗柱子，流速 2 mL/min；Elution buffer 洗脫，流速 2 mL/min，收集洗脫液。各洗脫組分經(jīng)SDS-PAGE 分離后，將高純度組分透析到buffer中，4 ℃透析過夜，0.45μm濾膜過濾分裝，-80 ℃保存。

1.6 牛、羊血清中抗布魯氏菌抗體檢測 采用iELISA。純化的rMEP 用PBS 緩沖液稀釋至濃度10 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃過夜。PBST 洗滌4次，然后每孔加入1%卵清蛋白封閉液300 μL，37 ℃孵育1.5 h，PBST再次洗滌4次，羊和牛血清用PBS稀釋（1∶400）后，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌4 次，加入1∶5 000 稀釋的HRP-重組蛋白G（PBST 稀釋），在室溫下孵育25 min。PBST洗滌4次，根據(jù)EL-TMB顯色試劑盒說明書進(jìn)行顯色，每孔加入顯色溶液100 μL，室溫下將酶標(biāo)板置于黑暗處，顯色5~15 min，加入終止液50μL。酶標(biāo)儀檢測OD450值，所有樣品設(shè)有復(fù)孔。

1.7 rMEP在布魯氏菌病診斷中的特異性檢測 采用特異性試驗(yàn)。為了驗(yàn)證rMEP 在布魯氏菌病診斷中的特異性，使用已建立的iELISA 來檢測其他常見病原菌免疫的兔子血清（耶爾森菌O9、大腸桿菌O157∶H7、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和沙門氏菌），二抗使用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶20 000稀釋），其他步驟按1.6中iELISA，計(jì)算陽性血清OD450值（P）與陰性血清OD450值（N）的比值。P/N＞2.1判定為陽性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism6.05 軟件，繪制受試者工作特征（ROC）曲線，用曲線下面積評價(jià)rMEP 的診斷效能，利用約登指數(shù)計(jì)算cut-off 值，同時(shí)分析在cut-off值下的靈敏度和特異度。

2 結(jié)果

2.1 rMEP制備和純化結(jié)果 預(yù)測并選擇了25個(gè)重疊的表位作為候選表位，將選擇的表位使用linke‘rGGGS’串聯(lián)后，共獲得532 個(gè)氨基酸。根據(jù)構(gòu)建的rMEP 氨基酸序列，對原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，然后連接到表達(dá)載體pET-28b上，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）細(xì)胞中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、純化。制備的rMEP相對分子質(zhì)量約為6×104，純化后濃度為1.39 mg/mL。

2.2 rMEP 的診斷效能 用iELISA 測試了159份羊血清樣本，用rMEP 作為診斷抗原時(shí)，ROC 曲線下面積 為 0.998（95%CI：0.993~1.002），cut-off 值 為0.595 5，診斷靈敏度為96.97%（95%CI：0.894 8~0.996 3）、特異度為98.92%（95%CI：0.941 5~0.999 7）。在此cut-off值下，93 份陽性樣本中有92 份診斷為陽性，陽性診斷符合率為98.92%；66 份陰性樣本中有64 份診斷為陰性，陰性診斷符合率為96.97%。用LPS 作為診斷的對照抗原時(shí)，ROC 曲線下面積為0.995（95%CI：0.987~1.002），cut-off 值為 0.716 5，診斷靈敏度為100%（95%CI：0.945 6~1.000 0）、特異度為 95.7%（95%CI：0.893 5~0.988 2）。在此cut-off值下，只有4例陰性樣本被誤診為陽性。見表1。

用 rMEP 檢測了 153 份牛血清樣本，用 rMEP 作為診斷抗原時(shí)，ROC 曲線下面積為 0.997（95%CI：0.994～1.001），cut-off 值為0.772 5，診斷靈敏度為98.65%（95%CI：0.927 0～0.999 7）、特異度為96.20%（95%CI：0.893 0～0.992 1）。在此 cut-off值下，74 份陽性樣本中有73 份診斷為陽性，陽性診斷符合率為98.65%；79 份陰性樣本中76 份診斷為陰性，陰性診斷符合率為96.20%。用LPS作為診斷的對照抗原時(shí)，ROC 曲線下面積為 0.987（95%CI：0.973~1.001），cut-off 值為 0.969 5，診斷靈敏度為95.65%（95%CI：0.878 2~0.990 9）、特 異 度 為97.47%（95%CI：0.911 5~0.996 9）。在此 cut-off 值下，有3 例陽性樣本被誤診為陰性，2 例陰性樣本被誤診為陽性。見表1。

表1 rMEP診斷的陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值

2.3 rMEP 在布魯氏菌病診斷中的特異度 rMEP作為抗原與所選血清無交叉反應(yīng)，見表2。

表2 rMEP作為抗原診斷的特異性

3 討論

在布魯氏菌病流行地區(qū)，建立快速準(zhǔn)確的診斷方法是預(yù)防和控制該疾病的前提條件。血清學(xué)抗體檢測常被用來診斷動(dòng)物的布魯氏菌?。?2］。由于B 細(xì)胞表位是抗體識別的分子位點(diǎn)［13］，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有多種細(xì)胞表位在線預(yù)測工具。本研究使用生物信息學(xué)工具對主要布魯氏菌OMP的優(yōu)勢抗原表位進(jìn)行了預(yù)測。然而，使用單一的生物信息學(xué)工具預(yù)測免疫原性B細(xì)胞表位的成功率很低。因此，本研究中使用了三種不同的B 細(xì)胞預(yù)測工具（ABCpred、Bepipred 和 COBEpro）和 T 細(xì)胞表位預(yù)測工具。布魯氏菌的各種OMP 具有高度的免疫活性，可用于疾病的血清學(xué)診斷。而當(dāng)前常用的LPS抗原，存在交叉反應(yīng)問題［14］，OMP 有作為候選診斷抗原的潛力。同時(shí)，隨著原核蛋白表達(dá)技術(shù)的發(fā)展，蛋白制備對實(shí)驗(yàn)室安全級別要求相對較低，而LPS制備則需要培養(yǎng)布魯氏菌進(jìn)行提取，對實(shí)驗(yàn)室的要求相對較高［15］。當(dāng)前，疫苗的許多研究將熱點(diǎn)集中在了布魯氏菌的OMP 抗原上。這些研究表明，使用布魯氏菌的OMP 免疫動(dòng)物后，可以產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)反應(yīng)［16-20］。我們前期的研究結(jié)果也表明，這種融合蛋白可以在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的Th1、Th2型免疫反應(yīng)［21］。

在前期研究的基礎(chǔ)上，將rMEP 作為診斷抗原建立了牛羊布魯氏菌病iELISA 診斷方法。利用新建的診斷方法對159 份羊血清樣本進(jìn)行評估，結(jié)果顯示其陽性和陰性診斷符合率分別為98.92%、96.97%；對153 份牛血清樣本進(jìn)行評估，結(jié)果顯示其陽性和陰性診斷符合率分別為98.65%、96.20%。這表明rMEP 作為一種蛋白抗原在診斷牛羊布魯氏菌病中準(zhǔn)確率很高。本研究結(jié)果還表明，rMEP在區(qū)分布魯氏菌患病動(dòng)物和健康動(dòng)物方面與LPS幾乎不相上下，rMEP與一些常見的食源性病原體如沙門氏菌及大腸桿菌O157：H7 等也不存在交叉反應(yīng)，表明該診斷方法具有較高的靈敏度和特異度，即布魯氏菌OMP 結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)和iELISA 技術(shù)在疾病血清學(xué)診斷中應(yīng)用價(jià)值較高，具有將理論研究應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中布魯氏菌病血清學(xué)檢測的潛力。

總之，本研究用新設(shè)計(jì)的rMEP 建立了檢測牛、羊布魯氏菌病的iELISA方法。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)過量表達(dá)了由布魯氏菌4個(gè)主要OMP優(yōu)勢抗原表位組成的重組蛋白，滿足了在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量診斷性抗原的需要，不僅節(jié)省了時(shí)間，而且避免了LPS抗原的制備，使診斷過程更加安全方便，為疾病的感染提供了一種安全簡便的診斷方法。此外，這種基于rMEP 的布魯氏菌病診斷方法可以為其他傳染病的診斷提供新的思路。然而，我們建立的診斷方法尚不能區(qū)分動(dòng)物所感染的布魯氏菌類型以及區(qū)分接種疫苗、未接種疫苗的動(dòng)物，這些還需深入研究。