陳少英, 晏平△, 梁慶, 梁子敬, 劉榮, 李燕, 許啟鋒

廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 1急診科，3神經內科(廣東廣州 510120)；2廣東省中醫(yī)院急診科(廣東廣州 510120)

在我國,銀環(huán)蛇咬傷占各類毒蛇咬傷的8.2%，居第5位，而其致死亡的人數卻居蛇傷的首位[1]。銀環(huán)蛇咬傷后，多數患者在1～4 h后出現全身中毒癥狀，常表現為全身骨骼肌無力，此癥狀出現的一般順序為先見四肢無力，繼而出現眼瞼下垂、吞咽困難、流涎、四肢癱瘓、呼吸困難，嚴重者可因呼吸肌麻痹，出現呼吸衰竭死亡，呼吸肌麻痹占一半以上[2]。臨床上銀環(huán)蛇咬傷的救治按照毒蛇咬傷程序化綜合救治法方法搶救，主要包括：盡早局部清創(chuàng)破壞毒素，盡早足量使用抗銀環(huán)蛇毒血清，糾正毒效危象(氣管插管、機械通氣、血液凈化等)，防治并發(fā)癥，預防感染等[1，3]。蛇咬傷多發(fā)生于農村及山區(qū)，有效的抗銀環(huán)蛇毒及機械通氣治療，難以及時提供。研究既可以盡早、便捷、安全、廣泛使用的藥物，可以為銀環(huán)蛇咬傷患者爭取救治時間，是醫(yī)生和患者迫切想得到的。在被銀環(huán)蛇咬傷的患者身上進行藥物臨床試驗，風險較大。2013年12月至2017年4月，本實驗組通過應用KM小鼠檢測所用銀環(huán)蛇毒的毒力；采用不同劑量銀環(huán)蛇干毒給予SD大鼠皮下注射，觀察SD大鼠運動、呼吸等情況，確定模擬銀環(huán)蛇咬傷早期肌無力所需模型的銀環(huán)蛇干毒最佳劑量。為驗證模型SD大鼠肌電圖的變化，將模型SD大鼠與對照組SD大鼠行重復神經電刺激檢查，并于建模后3 h取SD大鼠膈肌、腓腸肌行HE染色，了解肌肉細胞情況。通過本實驗，模擬臨床表現建立穩(wěn)定、可重復性的，而又廉價的銀環(huán)蛇干毒相關性早期肌無力的動物模型，為進一步研究提供基礎，以促進銀環(huán)蛇毒致肌無力機制和救治研究的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 KM小鼠(18～22 g/20～30 d)，許可證號：SCXK(粵)2008-0002，50只，雌雄各半，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心。SD大鼠(200～220 g/60～70 d)，許可證號：SCXK(粵)2008-0002，60只，雌雄各半，SPF級，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.2 主要試劑和儀器 銀環(huán)蛇干毒(南昌農大特種動物蛇類養(yǎng)殖場，批號：20130920)，美國Nicolet viking肌電圖/誘發(fā)電位儀(美國Nicolet公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗方案 本實驗根據文獻，銀環(huán)蛇毒的KM小鼠半數致死量(LD50)為0.09 mg/kg，為檢測本實驗所用的銀環(huán)蛇干毒的KM小鼠LD50，建立穩(wěn)定的動物模型，按照其倍數將小鼠分為不同劑量組[1]，測定本實驗銀環(huán)蛇干毒KM小鼠LD50，根據公式換算[4]為銀環(huán)蛇毒的SD大鼠LD50；按銀環(huán)蛇毒的SD大鼠的LD50倍數，予SD大鼠皮下注射，建立銀環(huán)蛇毒致SD大鼠肌無力模型，確定模擬臨床的最佳銀環(huán)蛇干毒劑量；用低頻重復神經電刺激檢測銀環(huán)蛇毒致SD大鼠肌無力模型的腓腸肌電改變；解剖模型大鼠，觀察膈肌及腓腸肌病理改變。實驗流程見圖1。

圖1 銀環(huán)蛇毒的KM小鼠LD50的測定

1.3.2 測定銀環(huán)蛇毒的LD50(1)分組：實驗分為5組，將體重為(20±2)g的KM小鼠50只，雌雄不限，隨機分為不同的劑量組，每組10只。第1組為按體重皮下注射0.03 mg/kg銀環(huán)蛇干毒組。第2組為按體重皮下注射0.09 mg/kg銀環(huán)蛇干毒組。第3組為按體重皮下注射0.12 mg/kg銀環(huán)蛇干毒組。第4組為按體重皮下注射0.15 mg/kg銀環(huán)蛇干毒組。第5組為皮下注射生理鹽水組。(2)操作方法：實驗小鼠從醫(yī)學實驗動物中心送來后，在實驗室室溫下飼養(yǎng)7 d。實驗前小鼠禁食12 h，不禁水。稱重，根據分組計算所需銀環(huán)蛇干毒劑量，給予小鼠皮下注射已配置好濃度的銀環(huán)蛇毒溶液(濃度1 μg/mL)。將小鼠按照不同分組放置于標記劑量的飼養(yǎng)籠中，恢復飲食。24 h后，記錄各組小鼠死亡數量。

1.3.3 建立銀環(huán)蛇毒致SD大鼠肌無力的中毒動物模型

1.3.3.1 確定銀環(huán)蛇毒致SD大鼠肌無力模型的劑量 (1)分組：按銀環(huán)蛇毒的SD大鼠的LD50倍數，分A、B、C、D、E、F共6組，每組10只，雌雄各半，稱重，采用不同劑量給SD大鼠皮下注射已配置的銀環(huán)蛇毒溶液(濃度10 μg/mL)，A組為給予2倍SD大鼠LD50的銀環(huán)蛇毒溶液；B組為給予3倍SD大鼠LD50的銀環(huán)蛇毒溶液；C組為給予4倍SD大鼠LD50的銀環(huán)蛇毒溶液；D組為給予10倍SD大鼠LD50的銀環(huán)蛇毒溶液；E組為皮下注射生理鹽水的對照組；F組為最佳中毒劑量模型組。(2)操作方法：注毒后觀察中毒SD大鼠肌力、呼吸等情況，且未出現大鼠死亡，記錄出現癥狀時間，確定本實驗所需模型的最佳劑量，按最佳劑量建設模型組F組，并行重復神經電刺激檢查。

按Lennon等[5]的分級法將肌無力癥狀分為4級：0級，沒有肯定肌無力表現；1級，嘶咬無力，四肢力量較差，在光滑地面上前肢打滑，活動減少；2級，明顯無力，休息時脊背呈隆起姿勢，頭尾下垂、前肢彎曲，動作不協(xié)調；3級，嚴重無力表現，無嘶咬動作，肌肉震顫，呼吸困難，瀕死或死亡。其他癥狀描述參照文獻[6]。

1.3.3.2 低頻重復神經電刺激(RNS)檢測 將F組SD大鼠10只用10%的水合氯醛(0.03 mL/kg)麻醉后固定于自制的解剖板上，將刺激電極放置于大鼠腹股溝處，橫跨坐骨神經。記錄電極置于腓腸肌內側頭(跟腱附著處)，參考電極插入腓腸肌肉內，地線插入刺激電極與記錄電極之間，采用RNS軟件進行操作。設置參數如下：增益1 mV/D，掃描速度2 ms/D，刺激強度20 mV，刺激頻率分別采取1、3、5 Hz。實驗大鼠在每一刺激頻率中給予6次電刺激，記錄腓腸肌肌電位。用第4個電位對第1個電位的變化百分比D表示衰減值。記錄麻醉后大鼠腓腸肌的肌電圖波幅衰減值后，予皮下注射銀環(huán)蛇毒致SD大鼠肌無力模型的所需劑量，記錄中毒后10 min及1、2、3 h肌電圖衰減值。

1.3.3.3 SD大鼠的膈肌與腓腸肌細胞形態(tài) E組和F組大鼠實驗3 h后，放血處死，解剖，取膈肌、腓腸肌行HE染色，了解肌肉細胞形態(tài)情況。

2 結果

2.1 銀環(huán)蛇毒LD50的確定 本實驗中40只實驗KM小鼠按照不同的劑量濃度皮下注射銀環(huán)蛇毒溶液，24 h后觀察各劑量組，觀察KM小鼠死亡情況，0.03 mg/kg組小鼠全部存活，0.09 mg/kg組有50%小鼠死亡，0.12 mg/kg組有50%小鼠死亡，0.15 mg/kg組有90%小鼠死亡，生理鹽水對照組全部存活。見表1。銀環(huán)蛇毒的KM小鼠LD50為0.12 mg/kg，其95%可信區(qū)間為0.082～0.132。根據公式，換算成銀環(huán)蛇毒的SD大鼠LD50為0.08 mg/kg。

表1 銀環(huán)蛇毒劑量與小鼠死亡率

2.2 銀環(huán)蛇毒致SD大鼠肌無力模型的劑量 實驗中觀察到大鼠中毒后，先出現易激惹，活動增多，后出現活動減少，動作減慢，之后出現口腔分泌物增多，喉鳴，張口呼吸，活動進一步減少。在C組和D組中可見，大鼠臨終前出現口鼻、四肢、尾部發(fā)紺。A組3 h左右出現張口呼吸；B組2 h左右出現張口呼吸；C組和D組1 h左右出現張口呼吸，并于3 h內死亡；E組觀察至27 h，未出現肌力減退和張口呼吸，全部存活。見表2。B組SD大鼠于1.5 h左右出現呼吸困難，模擬臨床1～4 h出現呼吸衰竭，用于早期救治銀環(huán)蛇干毒相關性早期肌無力的基礎研究，所需模型的銀環(huán)蛇毒最佳劑量是3倍SD大鼠LD50，為0.24 mg/kg。

表2 銀環(huán)蛇毒劑量與中毒后肌無力、呼吸困難、死亡時間

2.3 RNS檢查結果 F組SD大鼠為給予0.24 mg/kg銀環(huán)蛇毒注射的SD大鼠，行RNS檢查，中毒后，可見肌電遞減改變；E組SD大鼠肌電檢查無變化。F組SD大鼠所采集圖形見圖2。RNS檢查的采集數值見表3。

表3 模型組與對照組SD大鼠RNS檢查的采集衰減值[M(P25，P75)]%

注：A：RNS麻醉后；B：毒后10 min；C：毒后1 h；D：毒后2 h；E：毒后3 h

2.4 病理結果 高倍鏡(×200)下模型組膈肌及腓腸肌細胞腫脹、核排列紊亂。對照組的膈肌與腓腸肌細胞形態(tài)未見異常。見圖3。

圖3 兩組大鼠腓腸肌與膈肌細胞圖(HE，×200)

3 討論

既往也有很多銀環(huán)蛇致動物咬傷的模型構建，用豬或兔子的模型太貴。本實驗組曾用小鼠的膈肌肌條[7]、小雞的頸肌雞條[8]構建銀環(huán)蛇毒中毒模型，但屬于離體的實驗，無法模擬經體循環(huán)后的中毒改變。銀環(huán)蛇為劇毒蛇，一次排出毒量為4.6 mg，僅1 mg干毒就可置人于死地。關于蛇毒毒性強度的數據受多種因素的影響，如蛇的產地、采毒季節(jié)、飼養(yǎng)條件；蛇毒的處理情況、保持時間長短、保存方法等，均可影響其毒性。另外給藥的途徑不同，也可影響蛇毒毒性強度，其LD50的值也不一樣[9]。根據文獻銀環(huán)蛇毒致小鼠皮下注射的LD50是0.09 mg/kg[1]。本實驗所用銀環(huán)蛇干毒取自人工飼養(yǎng)的銀環(huán)蛇，為驗證不同飼養(yǎng)條件對其毒力的影響，同時為建立穩(wěn)定的動物模型，首先需要測定本批次銀環(huán)蛇干毒的小鼠LD50，根據銀環(huán)蛇毒致小鼠LD50，設定不同藥物濃度梯度，給藥方式采用皮下注射，24 h后確定小鼠死亡情況。通過實驗結果顯示，本批次通過人工飼養(yǎng)的銀環(huán)蛇，處理所得的干毒的毒性強度為0.12 mg/kg。

銀環(huán)蛇毒包括三指毒素(包括α-神經毒素)、磷脂A2(包括β-銀環(huán)蛇毒素)等，銀環(huán)蛇咬傷后，表現為前和突觸后神經毒性[10]，多數患者在1～4 h后出現全身中毒癥狀，主要表現為肌無力，嚴重者可因呼吸肌麻痹，出現呼吸衰竭死亡。銀環(huán)蛇咬傷最佳的救治時機是咬傷后2 h[11]，為觀察到未及時處理的SD大鼠中毒情況，建模成功后，本實驗的觀察時間設置為中毒后3 h。在預實驗中，根據由銀環(huán)蛇毒致KM小鼠半數致死量，換算為SD大鼠的LD50為0.08 mg/kg，按其不同劑量倍數，予SD大鼠行皮下注射。觀察注毒后大鼠肌力及呼吸改變情況，能自行恢復及死亡的劑量，不符合本實驗要求。實驗結果顯示2～3倍LD50，在觀察時間內出現了呼吸衰竭，且能保持存活，但2倍LD50致毒的大鼠在3 h左右出現張口呼吸，6 h恢復正常呼吸，為避免實驗中個體差異，影響實驗結果，予排除。給予SD大鼠注射4倍以上LD50，大鼠于2 h內死亡，不符合本實驗要求。用3倍LD50致毒大鼠，1.5 h出現呼吸困難，并逐漸加重，但存活時間可超過12 h。

重復神經電刺激技術是用于評估可疑神經肌肉傳遞障礙的最廣泛的電診斷方法[12]，最常用來研究神經肌肉傳導障礙性疾病。神經肌肉傳遞阻滯時，在低頻刺激時出現異常的遞減反應[13-14]。本實驗予3倍銀環(huán)蛇毒LD50復制動物模型，行RNS檢測，可見肌電呈遞減改變，符合突觸前異常，所致神經肌肉傳遞阻滯的重復神經電刺激改變。RNS檢測方法，可在實驗中檢測肌力變化，從而提供客觀的肌力分級指標。

銀環(huán)蛇毒致SD大鼠中毒后，SD大鼠出現呼吸困難，從而導致組織缺氧，細胞氧供不足。當細胞氧供不足時，細胞酸中毒，細胞內線粒體呼吸和氧化磷酸化功能障礙，細胞內ATP不足使ATP酶依賴的各離子泵功能喪失，以及細胞膜功能障礙等改變，導致細胞水腫[15]。本實驗觀察膈肌及腓腸肌細胞，鏡下可見細胞腫脹、核排列紊亂，與銀環(huán)蛇咬傷后，病理解剖形態(tài)相符[1]。

本批次通過人工飼養(yǎng)的銀環(huán)蛇，處理所得的干毒的SD大鼠的LD50為0.12 mg/kg。銀環(huán)蛇咬傷致SD大鼠肌無力模型所需的干毒劑量為0.24 mg/kg，3倍SD大鼠銀環(huán)蛇毒LD50。銀環(huán)蛇毒致大鼠肌無力模型是穩(wěn)定，具有可重復性的。銀環(huán)蛇毒中毒大鼠行重復神經電刺激檢測，表現為肌電遞減改變；RNS檢測方法可作為銀環(huán)蛇咬傷后肌力檢測的客觀方法。

利益相關聲明：所有作者無任何利益沖突。

作者貢獻說明：陳少英：醞釀和設計實驗、實施研究、采集數據、分析及解釋數據、統(tǒng)計數據、撰寫論文；晏平：指導和設計實驗、實施研究、對論文的知識性內容作批評性審閱；梁慶：指導實驗、研究經費支持；梁子敬：指導和設計實驗、研究經費支持、對論文的知識性內容作批評性審閱；劉榮：指導統(tǒng)計分析；李燕：醞釀和設計實驗。許啟鋒：協(xié)助實施研究。