王 平 范瑞強(qiáng) 柏彩英

近年來，隨著廣譜抗生素、激素等在臨床的廣泛使用，侵入性檢查和治療手段的廣泛開展，由白念珠菌導(dǎo)致的真菌感染性疾病不斷出現(xiàn)。究其原因，白念菌株對(duì)唑類藥物如氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)CZ)可穩(wěn)定遺傳的耐藥性是這一治療瓶頸的主要原因。從天然化合物中發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)現(xiàn)有抗真菌藥物敏感性的藥物應(yīng)用于臨床，是解決這一困境的可行之路。實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐都證實(shí)[1-3]，由廣東省中醫(yī)院范瑞強(qiáng)教授的經(jīng)驗(yàn)方制成的香連外洗液具有抗菌、增效作用。

本研究就香連外洗液對(duì)氟康唑抗耐藥菌株的增效作用進(jìn)行研究，并采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，對(duì)差異基因進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究香連外洗液對(duì)氟康唑抗耐藥菌株的增效機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物氟康唑原藥粉末：購自華邁科生物科技有限公司，有效期2022年12月，純度99%。香連外洗液：含生藥濃度100%，120 ml/瓶，批號(hào)190921，批準(zhǔn)文號(hào)：粵藥制字Z20071446，原液濃度為1000 mg/ml，有效期至2020年9月18日

1.2 菌株克柔念珠菌ATCC6258、白念珠菌ATCC10231 (由廣東省中醫(yī)院贈(zèng)送)。其中，ATCC6258為質(zhì)控菌株。

1.3 培養(yǎng)基96孔板、SDA平板(均購自廣東省廣州市威佳科技有限公司)、RPM1640培養(yǎng)基(購自廣東省江門市凱琳貿(mào)易有限公司)。

1.4 儀器天根多酚試劑盒(TIANGEN公司)、Touch q-PCR System CFX96(BIO-RAD公司)、Novaseq 6000測(cè)序平臺(tái)(Illumina公司)等。

2 方法

2.1 質(zhì)量控制以克柔念珠菌ATCC6258為質(zhì)量控制菌株按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的M27-A3方案，進(jìn)行MIC值的判定。

2.2 氟康唑 香連外洗液對(duì)白念珠菌ATCC10231MIC值的測(cè)定采用微量液基稀釋法測(cè)定單一使用香連外洗液或氟康唑時(shí)，對(duì)白念珠菌ATCC10231的MIC。

2.3 氟康唑與香連外洗液聯(lián)合抗菌作用的研究采用棋盤微量稀釋法觀察氟康唑與香連外洗液的聯(lián)合抗菌作用。聯(lián)合應(yīng)用的效果通過計(jì)算抑菌濃度分?jǐn)?shù)指數(shù)(Fractional Inhibitory Concentration Index，F(xiàn)ICI)來確定。

2.4 結(jié)果判定按照CLSI的M27-A3方案進(jìn)行。

2.5 白念珠菌總RNA的提取采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取白念珠菌的總RNA樣品。濃度、純度的檢測(cè)采用NanoPhotometer Spectrophotometer進(jìn)行。完整性的檢測(cè)采用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行。

2.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾mRNA。之后，以被打斷的、片段化的mRNA為模版，合成cDNA第一條鏈，隨后以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，最終獲得文庫。文庫構(gòu)建完成后，進(jìn)行定量，并對(duì)文庫的insert size進(jìn)行檢測(cè)。庫檢合格后，采用Novaseq 6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，獲得主要包含測(cè)序片段的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息fastq格式文件。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后，得到clean reads，并對(duì)clean data進(jìn)行Q20、Q30和GC含量計(jì)算。從基因組網(wǎng)站下載參考基因組和基因模型注釋文件，采用HISAT2 V 2.0.5進(jìn)行與參考基因組的比對(duì)及分析；根據(jù)基因的長度計(jì)算每個(gè)基因的FPKM，并計(jì)算映射到該基因的讀數(shù)。根據(jù)基因的表達(dá)量(FPKM)再計(jì)算該基因的差異表達(dá)倍數(shù)。對(duì)差異基因的分析采用edgeR(Robinson et al, 2010)進(jìn)行，以表達(dá)倍數(shù)差異log2|fold change|>0，顯著性p-value<0.05作為篩選條件。差異基因GO富集分析和KEGG分析通過ClusterProfiler(3.4.4)軟件進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 香連外洗液 氟康唑?qū)TCC10231的MIC香連外洗液、氟康唑?qū)Π啄钪榫鶤TCC10231的MIC值分別為15.63 mg/ml、64 μg/ml，表明菌株ATCC10231為氟康唑耐藥株。

3.2 氟康唑與香連外洗液聯(lián)合抗菌作用的研究聯(lián)合使用時(shí)，香連外洗液、氟康唑?qū)Π啄钪榫鶤TCC10231的MIC值分別為3.906 mg/ml、4 μg/ml。據(jù)計(jì)算得出，F(xiàn)ICI值為0.31，表明氟康唑與香連外洗液對(duì)耐藥白念珠菌ATCC10231有聯(lián)合抗菌作用。

3.3 白念珠菌ATCC10231總RNA提取的結(jié)果經(jīng)NanoPhotometer、Spectrophotometer檢測(cè)，2種不同處理后， ATCC10231總RNA的濃度分別為754 ng/μl、1576 ng/μl; 經(jīng)NanoPhotometer、Spectrophotometer檢測(cè)，兩種不同處理后，ATCC10231總RNA的OD260/280值分別為1.89、2.08，表明提取所得RNA純度高，污染??；經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)，2種不同處理后，ATCC10231總RNA的RIN(RNA Integrity Number)值分別為7.40、8.30，表明樣品總RNA完整性好。

3.4 與參考基因組比對(duì)的結(jié)果將得到的clean reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，2種不同處理后，ATCC10231與參考基因組的比對(duì)結(jié)果分別為：90.75%、92.02%。說明所測(cè)物種與參考基因組一致，相關(guān)實(shí)驗(yàn)無污染。

3.5 差異基因篩選以FPKM值作為基因表達(dá)量，進(jìn)行差異基因的篩選。2種不同處理后相比較，香連外洗液+氟康唑作用后白念珠菌ATCC10231有547個(gè)基因的FPKM值的上調(diào)，963個(gè)基因的FPKM值下調(diào)。

3.6 差異基因富集分析

3.6.1 差異基因的GO分析GO分析是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫，可分為生物過程(Biological Process，BP)和細(xì)胞組成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)3個(gè)部分。

2種不同處理后相比較，香連外洗液+氟康唑作用后ATCC10231差異表達(dá)基因的BP主要富集在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物代謝過程、刺激應(yīng)答、生物合成過程的調(diào)控、蛋白代謝過程等。這些基因的CC主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞膜的組成成分、細(xì)胞膜的固有成分、膜組件、細(xì)胞器等。這些基因的MF主要富集在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原酶活性、ATP 結(jié)合活動(dòng)、轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶活性等。

3.6.2 差異基因的KEGG分析ATCC10231差異表達(dá)基因主要富集在MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族、代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的合成、糖酵解與糖異生等。

4 qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)量的變化

經(jīng)采用qRT-PCR對(duì)挑選的5個(gè)差異基因進(jìn)行檢測(cè)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果基本一致(P<0.05)。見圖1。

圖1 5個(gè)差異基因qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

5 討論

GO(Gene Ontology)是國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系。根據(jù)香連外洗液+氟康唑作用后ATCC10231差異表達(dá)基因富集的生物過程(Biological Process，BP)、細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)等推測(cè)，香連外洗液作用下，細(xì)胞膜及細(xì)胞器成分發(fā)生了變化，其增效機(jī)制可能與代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、酶活性增強(qiáng)等相關(guān)。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)又稱京都基因與基因組百科全書。根據(jù)香連外洗液+氟康唑作用后白念珠菌ATCC10231差異基因富集的信號(hào)通路及代謝途徑，推測(cè)香連外洗液引起了耐藥相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá),同時(shí)影響了細(xì)胞基礎(chǔ)物質(zhì)代謝。

白念珠菌細(xì)胞膜成分的改變是白念珠菌耐藥的主要機(jī)制之一。其中，編碼細(xì)胞膜重要成分麥角甾醇相關(guān)基因ERG11的突變及過度表達(dá)是研究最多的，本研究發(fā)現(xiàn)，在香連外洗液+氟康唑作用后，ATCC10231轉(zhuǎn)變?yōu)榉颠蛎舾兄?，轉(zhuǎn)錄組研究顯示，與類固醇生物合成這一通路相關(guān)的基因ERG24、ERG251均出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)。這一結(jié)果與Su等[4]研究是相同的。同時(shí)，未見其他類固醇生物合成相關(guān)基因包括ERG11的異常表達(dá)。

目前已知與藥物外排有關(guān)的多藥耐藥相關(guān)蛋白有2類:①ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。主要由CDR1和CDR2編碼，兩者的過度表達(dá)是由TAC1基因編碼的CDR基因轉(zhuǎn)錄激活因子l(Transcriptional Activator of CD Rgene l，Tac1)介導(dǎo)的。②易化載體超家族蛋白(Major Facilitator Superfamily，MFS)。MDR1又稱為CaMDR1，是白念珠菌最重要的MFS家族多藥耐藥相關(guān)基因。鋅簇家族中與MDR1轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的最主要的基因是多耐藥調(diào)節(jié)基因(Multidrug Resisitance Regular 1，MRR1)。MRR1出現(xiàn)的功能獲得性突變，可導(dǎo)致MDR1高表達(dá)引發(fā)MDR1外排功能上調(diào)出現(xiàn)耐藥[5]。本研究中，經(jīng)氟康唑+香連外洗液作用，Tac1、MRR1出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)。此外，白念珠菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因CDR1、CDR2出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)，未見其他ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的異常表達(dá)；MFS家族基因TPO3、TPO2、TPO4等均出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)，未見既往研究報(bào)道最多的MFS家族多藥耐藥相關(guān)基因MDR1的異常表達(dá)。

在白念珠菌的致病過程中，黏附功能起了關(guān)鍵的作用。白念珠菌黏附基因主要包括以下幾種：①菌絲壁蛋白相關(guān)基因：菌絲壁蛋白1(Hyphal wall protein l，Hwp1)及菌絲壁蛋白2(hyphal wall protein l，Hwp2)是白念珠菌重要的毒力因子，同時(shí)也與白念珠菌的黏附相關(guān)，其是由鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Bcr1調(diào)控表達(dá)的[6]。本研究中，經(jīng)香連外洗液+氟康唑作用后，氟康唑耐藥株轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾兄辏瑫r(shí)，發(fā)現(xiàn)Hwp1、Hwp2出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)。推測(cè)，經(jīng)香連外洗液+氟康唑作用后，菌株恢復(fù)了對(duì)氟康唑的敏感性，Hwp1、Hwp2的下調(diào)表達(dá)可能是香連外洗液對(duì)氟康唑抗白念珠菌增效機(jī)制之一。除此以外，生物膜相關(guān)基因RBT1也出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)，這一點(diǎn)與以往的研究是相同的[7]。②聚苯乙烯黏附增強(qiáng)蛋白相關(guān)基因(Enhanced Adherence to Polystyrene 1,Eap1)Eap1p有助于生物膜形成，其不同區(qū)域介導(dǎo)了白念珠菌對(duì)上皮細(xì)胞、聚苯乙烯等不同底物的黏附。研究顯示，Eap1缺失的白念珠菌黏附力及持續(xù)時(shí)間明顯減少[8]。本研究中，經(jīng)香連外洗液+氟康唑作用后，Eap1出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)，同時(shí)出現(xiàn)了YWP1的上調(diào)表達(dá)，后者認(rèn)為與白念珠菌黏附能力的維持相關(guān)[8]。與黏附相關(guān)的基因Eap1下調(diào)表達(dá)，而與黏附維持相關(guān)的基因YWP1出現(xiàn)上調(diào)，這一結(jié)果與一項(xiàng)關(guān)于BDSF抗白念珠菌的研究是相同的[9]。

氧化應(yīng)激是白念珠菌耐受藥物打擊的重要生理活動(dòng)，過氧化物酶是一類氧化還原酶，它們能催化很多反應(yīng)，是白念珠菌細(xì)胞中重要的抗氧化酶之一[10]。經(jīng)香連外洗液+氟康唑作用后的菌株，與過氧化物酶相關(guān)的CTN1、PXP2、CTN3、IDP2、POX18、POT1基因均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。其中，PXP2、IDP2、POX18、POT1基因功能尚未確定，可能與白念珠菌氧化應(yīng)激所介導(dǎo)的耐藥機(jī)制有關(guān)。根據(jù)以上內(nèi)容推斷，過氧化物酶通路相關(guān)基因也是香連外洗液作用的靶點(diǎn)之一。

綜上所述，香連外洗液對(duì)氟康唑抗耐藥白念珠菌的增效作用是一個(gè)多基因參與、多個(gè)生物過程協(xié)同調(diào)控的過程。其作用的靶點(diǎn)與既往文獻(xiàn)中出現(xiàn)的耐藥基因相關(guān)，但文獻(xiàn)報(bào)道最多的基因并沒有出現(xiàn)異常表達(dá)，有些甚至是文獻(xiàn)報(bào)道較少或功能尚未確定的，這說明香連外洗液有其獨(dú)特的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)。這一發(fā)現(xiàn)為香連外洗液良好的臨床療效提供了佐證，同時(shí)也為下一步的研究提供了方向。