梁梓雯， 胡雪靈， 鐘文強(qiáng)， 羅冰潔， 潘 琪， 林 青， 李小云， 王攀攀，朱曉峰， 蔡 宇， 張榮華△， 楊 麗△

（1暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；2暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632）

肥胖是一種慢性代謝性疾病，以體內(nèi)脂肪細(xì)胞的體積和數(shù)量增加、體內(nèi)脂肪尤其是甘油三酯（triglyceride，TG）在某些局部積聚過多為主要表現(xiàn)。肥胖即是獨(dú)立疾病，又是2 型糖尿病、高血壓以及各種癌癥的重要誘因［1］。肥胖可由多種因素引起，其中一個(gè)重要誘因是雌二醇（estradiol，E2）水平的降低。

在正常狀態(tài)下，E2可以通過調(diào)節(jié)脂蛋白脂肪酶的合成、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的 表達(dá)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 的表達(dá)等方式［2］，維持不同部位的脂代謝穩(wěn)態(tài)。因此，內(nèi)源性E2水平降低的狀態(tài)下，脂代謝的狀態(tài)也會(huì)受到嚴(yán)重影響。有研究表示，與絕經(jīng)前女性相比，絕經(jīng)后女性具有更高的總脂肪量、脂肪百分比和中心脂肪積累［3］。另外一份研究報(bào)告則表示，絕經(jīng)前和絕經(jīng)后女性的身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）相似，但絕經(jīng)后女性的腰圍較大［4］。一項(xiàng)基于1 049 919 樣本量的Meta 分析也發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性的腹圍和內(nèi)臟脂肪均顯著高于絕經(jīng)前女性，且脂肪組織趨于向身體中心聚集［5］。這些臨床表現(xiàn)提示，絕經(jīng)后女性體內(nèi)E2的降低，不僅可導(dǎo)致脂肪重量增加，還可促使脂肪重新分布。

雙側(cè)卵巢切除術(shù)（ovariectomy，OVX）因能模擬人體低E2狀態(tài)引發(fā)胰島素抵抗、腹部肥胖和骨質(zhì)疏松等疾病，從而成為模擬人類女性更年期表征最好、報(bào)道最多的動(dòng)物模型［6］。OVX 是研究E2與脂代謝關(guān)系的經(jīng)典造模方法。Shin 等［7］發(fā)現(xiàn)，OVX 小鼠血清E2水平降低，同時(shí)伴隨小鼠體重、內(nèi)臟脂肪、肝臟脂質(zhì)積累和脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤增加，其機(jī)制可能是在E2降低的狀態(tài)下，內(nèi)臟脂肪中PPARα 抑制其下游多個(gè)與脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)A）的β 氧化相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致FA 在內(nèi)臟脂肪中積累［8］。另一項(xiàng)研究表明，OVX 大鼠下丘腦抵抗5-羥色胺的刺激，因此攝食量增加導(dǎo)致肥胖的出現(xiàn)［9］。

中醫(yī)認(rèn)為，絕經(jīng)前后女性天癸將竭，腎氣漸虛，沖任衰少，陰陽失衡，會(huì)出現(xiàn)心悸、煩熱和失眠等癥狀，多為肝腎陰虛所致［10］。因此，中醫(yī)多采用滋陰補(bǔ)腎法治療更年期綜合征。熟地黃（Rehmanniae Radix Praeparata，RR）因其補(bǔ)血滋陰和益精填髓的功能，常用于更年期綜合征的治療，有研究顯示RR 是治療該病中臨床使用率最高的中藥［11］。因此，本研究選用RR 水提液調(diào)節(jié)OVX 大鼠的脂代謝紊亂并探索其作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物分組和造模

1.1 動(dòng)物分組 3月齡SPF 級(jí)Sprague-Dawley 雌性大鼠40 只，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（粵）2018-0034，飼養(yǎng)于SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)（23±2）℃、45%～50%條件下自由飲水和攝食，每籠4只；適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后將大鼠隨機(jī)分成5 組，分別為假手術(shù)（sham）組、OVX 模型組、RR 水提液低劑量（RR-L）組、RR 水提液中劑量（RR-M）組和RR 水提液高劑量（RR-H）組，每組8 只，對(duì)大鼠行假手術(shù)或OVX，藥物灌胃12周后取材。

1.2 大鼠雙側(cè)去卵巢模型的建立與分組 參照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行，大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，手術(shù)前對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，采用3%戊巴比妥鈉1.5 mL/kg 進(jìn)行腹腔注射，麻醉后，將大鼠仰臥位固定，沿腹白線切口打開腹腔約2～3 cm，找到“Y”型子宮，沿每側(cè)子宮找到粉紅色綠豆大小的卵巢，將卵巢周圍的脂肪剝離，在卵巢和子宮交接處結(jié)扎后徹底切除兩側(cè)卵巢，sham 組則僅切除卵巢周圍同等體積脂肪組織，用棉球止血后逐層縫合皮膚。術(shù)后大鼠放回籠中等待蘇醒。

2 藥物鑒定與制備

2.1 RR飲片質(zhì)量鑒定 根據(jù)2020版《中國藥典》中的鑒定方法對(duì)購買的RR飲片進(jìn)行質(zhì)量鑒定。

以地黃苷D（CAS 號(hào)：81720-08-3）為對(duì)照品制備對(duì)照品溶液，按照2020 版《中國藥典》制備樣品溶液，色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸溶液（5：95）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫為30 ℃，上樣量為10 μL。

2.2 RR 水提液的制備 根據(jù)動(dòng)物體重的變化，藥物分3 次制備，每4 周制備1 次，制得濃縮藥液存放于-80 ℃冰箱，剩余飲片存放于4 ℃冷藏。參照文獻(xiàn)［13］，具體制備方法如下：藥物稱量后加入8 倍量的水浸泡30 min，電熱爐100 ℃加熱30 min；第2 次加7倍量的水，電熱爐100 ℃加熱20 min；合并2 次提取液后用濾網(wǎng)過濾藥渣，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至濃度為1 g/mL的浸膏，迅速分裝后于-80 ℃保存。動(dòng)物給藥劑量按照人-動(dòng)物體表面積進(jìn)行換算，參照2020 版《中國藥典》的成人建議給藥量15 g·70 kg-1·d-1換算得大鼠灌胃劑量，RR-L 組為0.45 g·kg-1·d-1，RR-M 組 為1.35 g·kg-1·d-1，RR-H 組 為4.05 g·kg-1·d-1。

3 主要試劑

RR 飲片購自北京深港藥業(yè)有限公司；地黃苷D購自四川維克奇生物科技有限公司；大鼠雌二醇ELISA 試劑盒和大鼠胰島素ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；甘油三酯測(cè)定試劑盒、總膽固醇測(cè)定試劑盒、高密度脂蛋白測(cè)定試劑盒和低密度脂蛋白測(cè)定試劑盒購自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；兔抗大鼠β-actin Ⅰ抗、PPARγ 兔抗大鼠Ⅰ抗、LRP5 兔抗大鼠Ⅰ抗、GSK3β 兔抗大鼠Ⅰ抗和p-GSK3β（Ser 9）兔抗大鼠Ⅰ抗購自CST；TNF-α小鼠抗大鼠Ⅰ抗、CD63 小鼠抗大鼠Ⅰ抗和Alix 兔抗大鼠Ⅰ抗購自Novusbio；CD9 兔抗大鼠Ⅰ抗、SFRP1 兔抗大鼠Ⅰ抗和HRP 標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗購自Abcam；IL-1β 兔抗大鼠Ⅰ抗購自愛必信（上海）生物科技有限公司；HRP 標(biāo)記羊抗小鼠Ⅱ抗購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；ExoQuick ?試劑盒購自SBI；miRNA 第一鏈cDNA 合成試劑盒和引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

4 指標(biāo)檢測(cè)

4.1 大鼠血脂水平 用無添加取血管進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置2 h 后，3 000 r/min 離心15 min，得到大鼠血清；采取臨床全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)檢測(cè)總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平。

4.2 大鼠血清E2和胰島素水平 根據(jù)大鼠雌二醇ELISA 試劑盒及大鼠胰島素ELISA 試劑盒說明書對(duì)大鼠血清樣本進(jìn)行處理并檢測(cè)。向孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品后37 ℃避光孵育30 min；洗滌后加入酶標(biāo)試劑；37 ℃避光孵育30 min；加入顯色劑后37 ℃避光顯色15 min；最后加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度并計(jì)算。

4.3 大鼠肝臟和腹部脂肪組織HE 染色 取材時(shí)，將取出的肝臟和腹部脂肪組織浸入多聚甲醛中，4 ℃下固定，對(duì)組織進(jìn)行適當(dāng)切割后流水下沖洗，去除多聚甲醛；于50%、60%、70%和80%乙醇中分別脫水1 h；95%和100%乙醇中分別脫水40 min，2次；在二甲苯中透明后，對(duì)組織進(jìn)行包埋和切片；依次將切片放入二甲苯中20 min，2 次；無水乙醇5 min，2 次；75%乙醇5 min；自來水洗滌后，將切片放入蘇木素染液中染3～5 min；自來水洗滌；分化液分化；自來水洗滌；返藍(lán)液返藍(lán)；再將切片依次放入85%、95%的梯度乙醇中脫水各5 min 后，放入伊紅染液中染色5 min；依次將切片放入無水乙醇中5 min，3 次；二甲苯中5 min，2 次；使之透明后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

4.4 大鼠肝臟油紅O 染色 取材時(shí)，將取出的肝臟放在干冰中速凍。實(shí)驗(yàn)前將肝臟從-80℃冰箱中取出，用手術(shù)刀將組織修平整；在周圍滴上OCT包埋劑后用冰凍切片機(jī)進(jìn)行速凍包埋；切片后在固定液中固定15 min；油紅染液浸染8～10 min；60%異丙醇分化；蘇木素復(fù)染3～5 min；分化液中分化2～8 s；返藍(lán)液中返藍(lán)1 s；洗滌后鏡下檢查染色效果并在顯微鏡下進(jìn)行圖像采集分析。

4.5 血清外泌體的提取 按照外泌體提取試劑盒說明書，吸取250 μL 血清于新的滅菌EP 管中，并加入63 μL ExoQuick 試劑后上下顛倒離心管，混勻；4 ℃孵育30 min 后，4 ℃，1 500 ×g離心30 min，管底可見白色沉淀，即為外泌體，吸去上清液；1 500 ×g繼續(xù)離心5 min，小心去除殘余的液體組分，加入500 μL PBS重懸沉淀。

4.6 RT-qPCR 檢測(cè)脂代謝相關(guān)基因的表達(dá) 用Trizol 法提取大鼠腹部脂肪組織的總RNA 后，取800 ng 總RNA，加入3 μL 逆轉(zhuǎn)錄試劑（包括1 μL gDNA Clean Reagent 和2 μL 5×gDNA Buffer），并用RNase free water 補(bǔ)足至10 μL，逆轉(zhuǎn)錄后加入上下游引物（各0.4 μL）、SYBR Premix EX Taq Ⅱ10 μL、RNase free water 8.8 μL 后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。進(jìn)行Ploy（A）加尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：2×miRNA RT Solution mix 10 μL、miRNA RT Enzyme mix 2 μL、micro RNA 100 ng、RNase free water 加至20 μL，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA 后再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。利用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平。

4.7 Western blot 檢測(cè)脂代謝相關(guān)蛋白 將大鼠腹部脂肪組織從-80 ℃冰箱取出，剪取適量組織放入液氮中研磨，研磨充分后裝入1.5 mL EP 管中，并向其中加入400 μL 配好的RIPA 裂解液（含1% PMSF 和1%磷酸酶抑制劑）；冰上裂解20 min 后離心，取上清；用BCA法測(cè)定各樣品蛋白濃度后，將蛋白濃度調(diào)至一致，并加入5×蛋白上樣緩沖液混勻后變性。將等量樣品加至10%SDS-PAGE 上進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后于4 ℃孵育Ⅰ抗過夜。次日將條帶從Ⅰ抗取出并用TBST 洗滌后，用相應(yīng)的Ⅱ抗進(jìn)行室溫孵育1 h，取出；TBST 洗滌；超靈敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色；于凝膠成像系統(tǒng)中成像，并用配套軟件Image Lab 進(jìn)行灰度值分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)通過SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間差異采用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，各組多變量之間的比較使用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 熟地黃飲片的質(zhì)量鑒定

使用分析性液相色譜儀對(duì)RR 飲片中的地黃苷D 進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見圖1。對(duì)照品出峰時(shí)間約為39 min，對(duì)照品溶液的濃度分別為16、32、48、64、80 mg/ L，對(duì)應(yīng)峰面積分別為108.65811、226.05743、332.17926、456.75543、591.25354 mAU*s，對(duì)其作標(biāo)準(zhǔn)曲線得y=7.4743x-15.786（R2=0.9982），樣品溶液在該處峰面積為240.0496 mAU*s，代入得飲片中地黃苷D 含量為0.0855%，符合標(biāo)準(zhǔn)，該批飲片可用于水提液的制備及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1. Liquid chromatogram of RR.圖1 RR液相色譜圖

2 各組大鼠血清E2水平及子宮系數(shù)

為了觀察給藥后大鼠體內(nèi)的E2變化，用ELISA法測(cè)定血清E2水平，發(fā)現(xiàn)OVX組顯著低于sham組（P＜0.05），說明雙側(cè)去卵巢手術(shù)使大鼠血清E2顯著減少；給藥后各組的血清E2水平顯著回升（P＜0.05），且RR-L組血清E2水平高于sham 組（P＜0.05），見圖2A。麻醉大鼠后剝離sham、OVX、RR-L、RR-M 及RR-H 組的子宮進(jìn)行稱重和拍照，計(jì)算子宮系數(shù)，結(jié)果如圖2所示，OVX 組大鼠子宮出現(xiàn)明顯萎縮，給藥后依然呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)，OVX 組與給藥組的子宮系數(shù)顯著低于sham組（P＜0.05），與子宮狀態(tài)相符。

3 各組大鼠體重及腹圍變化

在給藥干預(yù)的12 周內(nèi)，每周稱1 次體重，并在第12 周時(shí)測(cè)量腹圍，結(jié)果見圖3。各組體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中OVX、RR-L、RR-M 和RR-H 組的增長(zhǎng)幅度均比sham 組高（P＜0.05）。在第1 周時(shí)，OVX、RR-L和RR-M 組的體重顯著高于sham 組和RR-H 組（P＜0.05），但從第2 周開始，其他4組大鼠的體重均顯著高于sham 組（P＜0.05）。在第12 周時(shí)，OVX 組的腹圍顯著大于sham 組（P＜0.05），而RR-M 組較OVX 組腹圍顯著降低（P＜0.05），但其他兩個(gè)劑量的給藥組則未顯著降低（P＞0.05）。

4 各組大鼠血脂四項(xiàng)和胰島素水平變化

進(jìn)一步對(duì)血清中的血脂四項(xiàng)和胰島素（insulin，INS）進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，OVX 組的INS、TC 和LDL-C 水平均顯著高于sham 組（P＜0.05），但TG 和HDL-C 則無顯著變化（P＞0.05）；與OVX 組相比，RR水提液給藥后可顯著降低INS 和LDL-C 水平（P＜0.05），但并未降低TC水平（P＞0.05），見圖4。

Figure 2. The level of serum E2（A）and the morphology and index（B）of uterus. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖2 血清E2水平、子宮形態(tài)與系數(shù)

Figure 3. The body mass（A）and abdominal circumference（B）in rats. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖3 大鼠的體重及腹圍

Figure 4. Lipid metabolism indicators in serum. The level of INS，TC，TG，HDL-C and LDL-C were detected. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖4 血清中的脂代謝指標(biāo)

5 各組大鼠肝臟組織形態(tài)變化

肝臟作為脂代謝的重要器官，其中的脂質(zhì)積累水平也可反映體內(nèi)的脂代謝水平。為了觀察肝臟的狀態(tài)，對(duì)肝臟進(jìn)行HE 染色發(fā)現(xiàn)，sham 組大鼠肝臟大部分細(xì)胞形態(tài)完好、排列緊密有規(guī)則；而OVX 組有較多脂肪細(xì)胞空泡，并出現(xiàn)較多炎癥浸潤細(xì)胞；RRL、RR-M 和RR-H 組脂肪空泡較OVX 組少，但依然存在部分炎癥浸潤細(xì)胞（圖5A）。進(jìn)一步對(duì)肝臟進(jìn)行油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，OVX 組的脂質(zhì)積累較sham 組增多，給藥后脂質(zhì)積累減少，且RR-M 組減少量較其他兩組明顯（圖5B）。綜上，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用中劑量RR水提液進(jìn)行后續(xù)機(jī)制研究。

Figure 5. Liver metabolic status. HE staining（200×）and Oil red O staining（200×）were used to observe the liver metabolic status in rats.圖5 肝臟代謝狀態(tài)

6 大鼠腹部脂肪細(xì)胞的變化

腹部脂肪HE染色結(jié)果顯示，OVX組大鼠腹部脂肪細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞間排列緊密；給藥后脂肪細(xì)胞體積減小，細(xì)胞間隙增大，見圖6A。對(duì)各組脂肪細(xì)胞面積進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)OVX 組的面積顯著大于sham 組（P＜0.05），RR 組的面積則顯著低于OVX 組；但與sham 組比較無顯著差異（P＞0.05），見圖6B。

Figure 6. HE staining of abdominal adipose in rats（×200）. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖6 腹部脂肪HE染色

腹部脂肪細(xì)胞的形成與脂形成相關(guān)基因PPARγ有關(guān)，其代謝功能與炎癥因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和肥胖相關(guān)因子-糖蛋白非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤蛋白B（glycoprotein non-metastatic melanoma protein B，GPNMB）有關(guān)，因此對(duì)以上基因在腹部脂肪中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

RT-qPCR 結(jié)果顯示，OVX 組大鼠脂肪中的PPARγ、TNF-α、IL-1β 和GPNMB 的mRNA 表達(dá)量均顯著高于sham 組（P＜0.05）；RR 水提液能顯著降低以上基因的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05），見圖7。

Western blot 結(jié)果的趨勢(shì)與RT-qPCR 結(jié)果的趨勢(shì)相似，OVX 組脂肪組織中的PPARγ、TNF-α 和IL-1β蛋白表達(dá)量均顯著高于sham組（P＜0.05）；給藥后該趨勢(shì)被逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），見圖8。

7 血清外泌體的鑒定及其中miR-29a-3p 的差異表達(dá)

通過透射電子顯微鏡觀察到，通過試劑盒提取方法可提取到呈雙層膜結(jié)構(gòu)、直徑小于200 nm 的囊泡（圖9A）。激光納米粒度儀結(jié)果顯示，提取產(chǎn)物的平均直徑為100 nm，且絕大部分不超過200 nm（圖9B）。Western blot 結(jié)果顯示，該產(chǎn)物高表達(dá)CD63、CD9和Alix 蛋白（圖9C）。以上結(jié)果說明該產(chǎn)物為外泌體，使用該提取方法可成功提取血清中的外泌體。

根據(jù)本課題組以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)各組血清外泌體中的miR-29a-3p 的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)OVX組中miR-29a-3p 的表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；給藥后miR-29a-3p 的水平明顯升高（P＜0.05），因此認(rèn)為RR 水提液可能通過調(diào)節(jié)血清外泌體中的miR-29a-3p水平從而對(duì)腹部脂肪代謝起作用（圖9D）。

Figure 7. Relative mRNA expression of PPARγ，TNF-α，IL-1β and GPNMB in abdominal adipose. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖7 腹部脂肪中PPARγ、TNF-α、IL-1β和GPNMB的mRNA表達(dá)

Figure 8. The protein expression of PPARγ，TNF-α and IL-1β in abdominal adipose. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖8 腹部脂肪中PPARγ、TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá)

8 腹部脂肪中的miR-29a-3p 及其靶基因核因子I A（nuclear factor I A，NFIA）的表達(dá)

為了探討RR 水提液是否通過血清外泌體中的miR-29a-3p 對(duì)OVX 大鼠起到調(diào)節(jié)脂代謝的作用，利用RT-qPCR 法對(duì)3 組大鼠的腹部脂肪中的miR-29a-3p 進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，miR-29a-3p 在OVX 組大鼠的腹部脂肪中的表達(dá)量顯著低于sham 組（P＜0.05）；給藥后miR-29a-3p 表達(dá)水平得到顯著提高（P＜0.05），見圖10A。因此說明RR 水提液可通過富集血清外泌體中的miR-29a-3p，從而提高腹部脂肪中的miR-29a-3p水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂代謝。

由于miR-29a-3p 在人與大鼠之間具有高度保守性，因 此 利 用rno-miR-29a-3p 和has-miR-29a-3p 在TargetScan 8.0［14］、miRWalk 3.0［15］和DIANA-microT 5.0［16-17］數(shù)據(jù)庫中檢索與去除重復(fù)值后，篩選得到靶基因NFIA。對(duì)NFIA 在脂肪中的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)OVX 組的NFIA 在腹部脂肪中的mRNA 表達(dá)量均顯著高于sham 組（P＜0.05）；該表達(dá)量在RR 組則顯著低于OVX 組（P＜0.05），表達(dá)趨勢(shì)與miR-29a-3p 相反，說明NFIA 可能是miR-29a-3p 的靶基因，見圖10B。

Figure 9. Identification of serum exosome and the expression of miR-29a-3p in it. Transmission electron microscope（A），laser nanoparticle size analyzer（B）and Western blot（C）were used for exosome identification. The expression of miR-29a-3p in exosome was detected by RT-qPCR（D）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖9 血清外泌體的鑒定及其中miR-29a-3p的表達(dá)

Figure 10. The expression of miR-29a-3p（A）and the mRNA expression of NFIA（B）in abdominal adipose were detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖10 腹部脂肪中miR-29a-3p及NFIA的mRNA表達(dá)

9 miR-29a-3p對(duì)腹部脂肪中Wnt信號(hào)通路的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，NFIA 作為轉(zhuǎn)錄因子，可結(jié)合并促進(jìn)經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路抑制劑-SFRP1 的轉(zhuǎn)錄，因此對(duì)腹部脂肪中的Wnt 信號(hào)通路的關(guān)系進(jìn)行研究［18］。對(duì)腹部脂肪中的SFRP1 mRNA 和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二者趨勢(shì)一致，在OVX 組大鼠中均被顯著提高（P＜0.05），而在RR組大鼠中較OVX組顯著降低（P＜0.05）。Wnt 信號(hào)通路中的下游關(guān)鍵蛋白-LRP5、磷酸化糖原合成酶激酶3β（phospho-glycogen synthase kinase-3β，p-GSK-3β）（Ser 9）和糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）同樣在OVX組中被顯著抑制（P＜0.05），而在RR組中則被顯著促進(jìn)（P＜0.05），說明OVX 組腹部脂肪中經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路被抑制，給藥后可促進(jìn)Wnt 信號(hào)通路的表達(dá)，見圖11。

討論

1 RR 水提液在提高OVX 大鼠血清E2的同時(shí)對(duì)子宮形態(tài)及系數(shù)無明顯影響

對(duì)于絕經(jīng)后女性由于體內(nèi)E2水平低下引起的骨量下降、情緒障礙和脂代謝紊亂等疾病的治療，此前多使用激素療法，但激素療法與子宮內(nèi)膜增生的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［19］，因此更多有效的藥物以及干預(yù)方法有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用RR 水提液對(duì)OVX 大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OVX 大鼠體內(nèi)E2水平和子宮系數(shù)均顯著低于sham 大鼠，子宮發(fā)生萎縮，與此前文獻(xiàn)所述一致［20］，說明造模成功。給藥后大鼠體內(nèi)E2水平顯著提高但子宮形態(tài)、子宮系數(shù)無明顯改變，說明RR 水提液在提高體內(nèi)E2水平的同時(shí)不會(huì)帶來子宮內(nèi)膜增生的風(fēng)險(xiǎn)。由于體內(nèi)E2的循環(huán)水平受下丘腦-垂體-性腺軸控制，體內(nèi)高水平的E2可誘導(dǎo)下丘腦釋放大量促性腺激素釋放激素［21］，因此，RR-L 和RR-M 組的E2水平高于sham 組，可能是觸發(fā)了E2的正反饋?zhàn)饔谩?/p>

Figure 11. The level of Wnt signaling pathway in abdominal adipose. The mRNA expression of SFRP1（A），the protein expression of SFRP1，LRP5，GSK-3β（Ser 9）and GSK-3β（B and C）were detected and quantified. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖11 腹部脂肪的Wnt信號(hào)通路水平

2 RR-M組大鼠腹圍較OVX組大鼠減小

目前針對(duì)絕經(jīng)后女性脂代謝紊亂的治療方法，大多只針對(duì)一個(gè)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)癥治療，或從飲食控制和運(yùn)動(dòng)方式方面進(jìn)行全身脂代謝調(diào)節(jié)，對(duì)于藥物從多方面進(jìn)行脂代謝調(diào)節(jié)的研究仍待進(jìn)一步發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)聚焦于RR 水提液對(duì)OVX 大鼠的脂代謝多項(xiàng)指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，RR-M 組大鼠的腹圍顯著低于OVX 組大鼠，但二者體重卻無明顯差異。此前，大量證據(jù)證明，腹圍是心血管疾病和2 型糖尿病的重要預(yù)測(cè)因子，與BMI 升高的肥胖無關(guān)［22］；較高的腹部脂肪量與所有種族群體中心臟代謝風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)［23］；腹部脂肪的減少與體重減輕后心血管疾病的危險(xiǎn)因素減少顯著相關(guān)［24］。由于不少實(shí)驗(yàn)證明，更年期的發(fā)生導(dǎo)致脂肪組織從四肢向軀干轉(zhuǎn)移［25］；絕經(jīng)后婦女的雌激素替代療法被證明可以有利地調(diào)節(jié)體脂分布，降低心臟代謝風(fēng)險(xiǎn)［26］。因此認(rèn)為RR 水提液可能是通過調(diào)節(jié)體脂分布來改善OVX 大鼠的脂代謝狀態(tài)，降低心臟代謝風(fēng)險(xiǎn)。

3 RR 水提液降低OVX 大鼠的血清INS、LDL-C和肝臟脂質(zhì)積累

肥胖通常伴隨胰島素抵抗。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腹型肥胖者INS 水平較周圍型顯著升高［27］，另外也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明OVX 大鼠血清INS 水平顯著高于對(duì)照組［28］，本實(shí)驗(yàn)亦得到相同結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)給藥后可顯著降低血清INS水平。

在人體內(nèi)，脂類物質(zhì)都需經(jīng)血液運(yùn)轉(zhuǎn)于各組織之間，血脂含量可以反映體內(nèi)脂類代謝的情況。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OVX 組中TC 和LDL-C 水平顯著升高，與接受OVX 手術(shù)后的女性血清中TC 和LDL-C 的趨勢(shì)一致［29］。前瞻性研究的Meta 分析發(fā)現(xiàn)，較高濃度的LDL-C 與冠心病風(fēng)險(xiǎn)較高有關(guān)［30］，降低LDL-C 對(duì)心血管疾病的預(yù)防具有明顯的益處［31］。本實(shí)驗(yàn)中，RR水提液可顯著降低OVX大鼠體內(nèi)升高的的LDL-C的水平，但對(duì)TC 水平?jīng)]有影響，說明RR 水提液對(duì)血脂的調(diào)節(jié)主要是通過降低血清LDL-C 進(jìn)行。肝臟是調(diào)節(jié)全身脂代謝的重要器官。多項(xiàng)臨床研究表明，非酒精性脂肪肝的患病率在絕經(jīng)后女性中顯著高于絕經(jīng)前女性［32-33］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，OVX 組有較多脂肪細(xì)胞空泡，并出現(xiàn)較多炎癥浸潤細(xì)胞和脂質(zhì)積聚；給藥后情況得到改善。

以上結(jié)果說明，RR 水提液可通過降低血清INS和LDL-C 水平、減少肝臟脂質(zhì)積聚來改善OVX 大鼠的全身脂代謝。

4 RR 水提液抑制OVX 大鼠腹部脂肪的形成和炎癥反應(yīng)

我們對(duì)脂肪細(xì)胞分化和脂肪生成的關(guān)鍵基因PPARγ表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OVX 大鼠腹部脂肪中的PPARγ 表達(dá)量顯著提高，而給藥后則降低，提示給藥組腹部脂肪細(xì)胞體積減小與PPARγ 的表達(dá)水平被抑制有關(guān)。脂肪組織的擴(kuò)張和功能障礙還可能伴隨慢性炎癥，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的形成和分泌［34］；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GPNMB 可激活脂肪組織巨噬細(xì)胞中的溶酶體，進(jìn)而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤和炎癥水平升高［35］。因此對(duì)腹部脂肪中的TNF-α、IL-1β和GPNMB表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RR 水提液可顯著降低以上因子在OVX大鼠中的表達(dá)，抑制炎癥水平。

綜上，RR水提液可通過抑制PPARγ的表達(dá)從而減少腹部脂肪組織的擴(kuò)張，并通過降低GPNMB 的表達(dá)，改善腹部脂肪的慢性炎癥狀態(tài)，最終改善腹部脂肪的代謝狀態(tài)。

5 RR 水提液降低OVX 大鼠血清外泌體和腹部脂肪中的miR-29a-3p

外泌體作為直徑為50～150 nm 的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的盤狀囊泡，其中含有蛋白質(zhì)和核酸，在細(xì)胞間的通訊起著重要作用。MicroRNA 是一類17～24個(gè)堿基的小非編碼RNA，它們可通過與靶標(biāo)mRNA 的3'-UTR或開放閱讀框區(qū)域結(jié)合來介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，由于序列很小，因此可穩(wěn)定地存在于體液中，也可富集于外泌體中。研究發(fā)現(xiàn)，減肥手術(shù)可改變患者血清外泌體中的miRNA 譜，這可能與術(shù)后胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的改善有關(guān)［36］；另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，肥胖會(huì)改變小鼠血漿外泌體的miRNA 譜，且肥胖相關(guān)的外泌體miRNA 在葡萄糖不耐受和血脂異常的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用［37］。因此，本實(shí)驗(yàn)從外泌體miRNA的角度入手，進(jìn)一步研究RR 水提液調(diào)節(jié)OVX 大鼠脂代謝的機(jī)制，結(jié)果提示RR 水提液可提高OVX 大鼠血清外泌體中miR-29a-3p含量。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠模型中，過表達(dá)miR-29a-3p可顯著降低血清TC、TG 和LDL-C水平并提高HDL-C 水平，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成［38］。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，楊梅黃酮通過提高miR-29a-3p，靶向降低GAS5，進(jìn)而減弱氧化LDL 誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)［39］?；趍iR-29a-3p 在脂代謝和炎癥中的調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其在大鼠腹部脂肪組織中的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量，發(fā)現(xiàn)在OVX 組中miR-29a-3p水平顯著低于sham 組；給藥后顯著提高，與上述研究結(jié)果一致。此外，各組miR-29a-3p 水平在血清外泌體和腹部脂肪中變化趨勢(shì)一致，提示RR 水提液可能通過提高OVX 大鼠血清外泌體中miR-29a-3p含量進(jìn)而提高腹部脂肪中的miR-29a-3p含量，從而改善腹部脂肪中的脂代謝。

6 RR水提液抑制OVX大鼠腹部脂肪NFIA表達(dá)進(jìn)而激活Wnt信號(hào)通路

對(duì)miR-29a-3p 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其與NFIA 的3’-UTR 區(qū)域存在可能的結(jié)合區(qū)域。此前有實(shí)驗(yàn)證明，在ST2細(xì)胞中，NFIA通過與SFRP1啟動(dòng)子結(jié)合的方式促進(jìn)SFRP1 的表達(dá)來促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化［18］。在本實(shí)驗(yàn)中得到一致結(jié)果，OVX 組大鼠腹部脂肪的NFIA 的mRNA 水平顯著高于正常大鼠，同時(shí)SFRP1 的mRNA 和蛋白水平均顯著提高；給藥后NFIA 和SFRP1 的表達(dá)水平同時(shí)下降。SFRP1 作為Wnt 信號(hào)通路的抑制劑，通過與Wnt 配體結(jié)合，抑制Wnt 信號(hào)通路的激活。Wnt 信號(hào)通路的激活可阻斷PPARγ 對(duì)脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)，抑制脂肪形成。當(dāng)Wnt配體與受體LRP5/6 結(jié)合后，GSK-3β 的Ser 9 殘基的磷酸化程度升高，Tyr 216 殘基的磷酸化程度降低，GSK-3β 活性被抑制，其所在的β-catenin 降解復(fù)合物活性被抑制，因此β-catenin 的降解被抑制，胞漿中穩(wěn)定積累的β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核后啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［40］。因此對(duì)經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路中的LRP5、GSK-3β 和p-GSK-3β（Ser 9）表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在OVX 大鼠中，LRP5 和p-GSK-3β（Ser 9）的活性均被抑制，而給藥后被激活，說明給藥后Wnt 信號(hào)通路被激活。以上事實(shí)說明，RR 水提液可通過提高腹部脂肪中miR-29a-3p 從而抑制其靶基因NFIA 的表達(dá)，進(jìn)而激活Wnt信號(hào)通路。

綜上所述，RR 水提液可改善OVX 大鼠的血清E2、INS、LDL-C 和肝臟脂質(zhì)積累，抑制腹部脂肪細(xì)胞擴(kuò)張和慢性炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能是與血清外泌體中miR-29a-3p 和腹部脂肪中miR-29a-3p 的含量增加后NFIA 表達(dá)量下降，從而激活腹部脂肪中的Wnt 信號(hào)通路有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)僅從RR 水提液對(duì)腹部脂肪細(xì)胞的形成和炎癥反應(yīng)方面進(jìn)行探討，而對(duì)于脂肪細(xì)胞在合成和儲(chǔ)存脂質(zhì)方面的影響則有待更多的研究。