楊 麗， 蔣思怦，3▲， 張 榮， 郭東銘， 張星星， 袁中華△

（1南華大學(xué)心血管疾病研究所，動脈硬化學(xué)湖南省重點實驗室，湖南省動脈硬化性疾病國際科技創(chuàng)新合作基地，湖南 衡陽 421001；2南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院臨床解剖與生殖醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究所，湖南 衡陽 421001；3四川護理職業(yè)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川省第三人民醫(yī)院，四川 成都 610000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是動脈硬化性心血管疾病中最常見最重要的一種，其發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚未完全闡述清楚。在AS 斑塊形成期間，循環(huán)單核細胞進入血管壁的內(nèi)皮下并轉(zhuǎn)化為巨噬細胞，吞噬氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）或其他修飾的脂蛋白變成泡沫細胞，泡沫細胞是AS 病變的標(biāo)志。脂滴（lipid droplet，LD）是胞質(zhì)中脂質(zhì)的主要存在形式，脂肪分化相關(guān)蛋白（adipophilin）作為其中含量較高的一種，在AS 的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［1，2］。脂滴包被蛋白（perilipin 2，PLIN2），也稱為adipophilin，是PAT 家族的成員［3］，可調(diào)節(jié)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和LD 的形成［4］。本課題組前期研究顯示沉默表達PLIN2后，細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積減少，過表達PLIN2時脂質(zhì)蓄積增加［5］。小GTP 結(jié)合蛋白Rab18定位于LD，參與LD 中的脂質(zhì)代謝［6］。過表達Rab18時細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積減少，由此推測Rab18 在減緩AS 斑塊的形成中有重要作用，但具體機制尚未被闡明［7-8］。Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一［9］。在體內(nèi)各類因子的刺激下，JAK2 形成二聚體，通過磷酸化方式被激活［10］。研究表明，p-STAT3 與AS 斑塊穩(wěn)定性成正比［11］。Rab3C過表達時，JAK2 和STAT3 表達增加，提示Rab3C 可調(diào)控JAK2/STAT3 信號通路［12］。RAB3C 與Rab18 均為RAB 家族中成員，由此推測Rab18 或許也可通過JAK2/STAT3 通路來影響脂質(zhì)蓄積。本課題組前期研究證實Rab18 可降低PLIN2 的表達［13］。本研究在此基礎(chǔ)上進一步探討Rab18 是否通過影響JAK2/STAT3 通路調(diào)控PLIN2 的表達，從而影響巨噬細胞脂質(zhì)蓄積，以期闡明Rab18調(diào)節(jié)脂質(zhì)蓄積的機制。

材料和方法

1 主要材料

THP-1人髓細胞白血病單核/巨噬細胞購自上海生物科院細胞生物學(xué)研究所。RPMI-1640 培養(yǎng)液（天津海克隆國際貿(mào)易有限公司）；胎牛血清（BI）；ox-LDL（廣州奕源公司）；JAK2抑制劑AG490（Abcam）；Lipofectamine 2000（Invitrogen）；油紅O（北京鼎國昌盛公司）；甘油三酯（triglyceride，TG）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒和山羊抗兔IgG（CWBIO）；熒光定量檢測試劑盒和第一鏈合成試劑（TIANGEN）；Total RNA Extraction Kit（Promega）；鼠抗Rab18抗體、兔抗PLIN2抗體和山羊抗鼠IgG（Proteintech）；兔抗JAK2、STAT3 和p-STAT3抗體（Affinity）；兔抗p-JAK2抗體（Abcam）；含野生型（wild-type，WT）、活化型（high-activity，HA；Q67L）和失活型（low-activity，LA；S22N）Rab18 的甘油菌（長沙佳和公司）；其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司根據(jù)設(shè)計合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng)與分組 將THP-1 巨噬細胞（人源性）置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，視細胞生長狀態(tài)換液，當(dāng)細胞貼壁率達到80%時傳代。實驗分為5 步。（1）將細胞分為4 組，用ox-LDL 處理不同時間（0、6、12 和24 h），構(gòu)建泡沫細胞模型。（2）將細胞分為4 組：對照（control）組（僅加入ox-LDL）、WT Rab18 組（WT 組）、HA Rab18 組（HA 組）和LA Rab18組（LA 組）。（3）將細胞分為3 組：control 組、Rab18 組（HA 組）和HA+AG490 組。（4）將細胞分為空白對照（blank control）組（僅加入培養(yǎng)液）、control組、HA 組、WT 組、LA 組和HA+AG490 組。（5）將細胞分為control組、HA組、WT組、LA組和HA+AG490組。

2.2 提取與鑒定質(zhì)粒 根據(jù)Ozeki 等［8］的報道，將含Rab18（S22N）、Rab18（Q67L）和Rab18（WT）質(zhì)粒的菌液解凍混勻，用接種環(huán)分別接種在含氨芐西林的瓊脂培養(yǎng)基上，在細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h后挑出陽性單菌落置于含氨芐西林的LC 培養(yǎng)液中，放入搖床震蕩（37 ℃，220 r/min，12 h），收取震蕩12 h 的菌。取一部分菌液提取質(zhì)粒并通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，余下已鑒定的菌液再劃板挑取陽性單菌落接種于200 mL的LC培養(yǎng)液中，通過質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，使用紫外分光光度計測量質(zhì)粒的濃度。

2.3 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染Rab18（S22N）、Rab18（Q67L）和Rab18（WT）質(zhì)粒入THP-1 細胞。轉(zhuǎn)染前1 d 將THP-1 細胞接種于24 孔板中，后放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。用RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋轉(zhuǎn)染試劑，在室溫靜置5 min 混勻，后又置于室溫20 min，將混勻液100 μL 均勻加入24 孔板中。4～6 h 后將孔板取出，鏡下觀察細胞狀態(tài)，噴灑酒精放入操作臺中，吸出每孔的混勻液，PBS 緩沖液清洗3 次（每孔500 μL），加入500 μL 含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，再次將孔板放入無菌箱中（37 ℃，5%CO2），1～2 d后通過Western blot實驗檢測轉(zhuǎn)染效果。

2.4 Western blot 用PMSF 和裂解液處理細胞后，離心（4 ℃，603.72×g，10 min），加上樣緩沖液混勻后，用電爐子煮沸（100 ℃，10 min）變性，冰上冷卻，提取總蛋白。使用BCA試劑盒定量。制備10%分離膠和5%濃縮膠，蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移至PDVF 膜上；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用脫脂牛奶封閉，再分別加入相應(yīng)Ⅰ抗，搖床震蕩孵育6～8 h（4 ℃過夜）；接著加入對應(yīng)的Ⅱ抗，搖床搖動孵育1.5 h（室溫），TBST 洗PVDF膜3次，顯影。

2.5 油紅O 染色 避光下配制油紅O 工作液，使用4%多聚甲醛固定細胞30 min 后使用PBS 洗滌3 次，每次10 min；將油紅O 染液加入24孔板中，每孔至少1 mL，觀察到細胞出現(xiàn)明顯的顆粒狀物體后吸出染液，PBS再洗滌3次，每次10 min；30分鐘后顯微鏡下觀察細胞脂質(zhì)染色情況，PBS 洗滌3 次（每次10 min），后用蘇木素染核5 s，最后用PBS 洗滌3 次。封片后在顯微鏡下拍片并保存。

2.6 細胞免疫熒光 使用4%多聚甲醛（30 min）固定細胞，PBS清洗3次；使用0.1%Trition X-100（每孔1 mL）處理24孔板中的細胞20 min，PBS清洗3次，每次8 min；以VPBS∶V胎牛血清=20∶1 的比例配制適量封閉液，將其加入孔板中封閉1 h后孵育對應(yīng)的Ⅰ抗（4 ℃過夜），PBS 清洗3 次，每次7 min；Ⅱ抗孵育（常溫），PBS 清洗3 次，每次8 min；使用10 mg/L DAPI 加入孔板內(nèi)染核5～10 min，PBS 清洗3 次，每次8 min；使用抗熒光淬滅劑進行封片，最后避光下在熒光顯微鏡下拍攝并保存。

2.7 細胞內(nèi)TG 的檢測（GPO-PAP 酶法） 吹散貼壁細胞后離心（67.08×g，10 min），再重復(fù)一次，最終留細胞沉淀。使用1%～2% Triton X-100［即VTritonX-100∶VPBS=（1～2）∶100］裂解細胞30～40 min，裂解后液體直接測定。準備3 個標(biāo)簽好的試管，根據(jù)說明書加入相應(yīng)的液體，混勻后，孵育10 min，然后測定A值，再根據(jù)Excel表格計算TG濃度。

2.8 RT-qPCR 提取各組THP-1 巨噬細胞中的總RNA，去除混合的DNA和DNA酶，使用Fast King RTPCR 合成試劑盒從總RNA 合成第一鏈cDNA。按照說明書進行循環(huán)，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參照，通過2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

Figure 1. Western blot was used to determine the protein levels of Rab18，JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 and PLIN2 in THP-1 macrophages exposed to 50 mg/L ox-LDL for different time（0，6，12 and 24 h）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 h；＃P＜0.05 vs 6 h；△P＜0.05 vs 12 h.圖1 ox-LDL處理不同時間對Rab18、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和PLIN2蛋白水平的影響

重復(fù)上述實驗3 次以上。采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準差（mean±SD）表示。兩組間比較用t檢驗；多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 ox-LDL 處 理 不 同 時 間 對Rab18、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和PLIN2蛋白水平的影響

將細胞分為4 組，用50 mg/L ox-LDL 與THP-1 巨噬細胞分別共孵育0、6、12 和24 h。Western blot 結(jié)果顯示，Rab18、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 和PLIN2 蛋白水平隨著ox-LDL 處理細胞時間的延長而升高（P＜0.05）；處理24 h 時，Rab18、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 和PLIN2 蛋白水平達到高峰（P＜0.05），見圖1。因此，本研究選擇ox-LDL 孵育細胞時間為24 h。

2 不同活性Rab18 對荷脂巨噬細胞內(nèi)JAK2、STAT3和PLIN2 mRNA的影響

分別轉(zhuǎn)染Rab18（Q67L）、Rab18（WT）和Rab18（S22N）質(zhì)粒入細胞內(nèi)，再加入ox-LDL 孵育細胞24 h。將細胞分成control 組（僅加入ox-LDL）、HA 組、WT 組和LA 組。采用RT-qPCR 測量3 種質(zhì)粒在相應(yīng)細胞中的表達，結(jié)果顯示，HA 組中Rab18（Q67L）、WT 組中Rab18（WT）和LA 組中Rab18（S22N）的mRNA 表達量均顯著增加（P＜0.05），見圖2A。以上實驗證明3 種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。RT-qPCR 結(jié)果還顯示，與control 組相比，HA 組及WT 組JAK2 及STAT3 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05），而PLIN2 的mRNA 表達水平顯著下降（P＜0.05）；與control 組相比，LA 組中JAK2、STAT3 及PLIN2 的mRNA 表達無顯著差異，見圖2B。

Figure 2. The effects of wild-type（WT），high-activity（HA）and low-activity（LA）Rab18 vectors on the mRNA expression of Rab18（WT），Rab18（Q67L）and Rab18（S22N）detected by RT-qPCR（A），and the mRNA expression of PLIN2，JAK2 and STAT3 in the cells of each transfection group detected by RT-qPCR（B）. Control：50 mg/L ox-LDL incubation for 24 h；WT：Rab18（WT）vector transfection+ox-LDL incubation；HA：Rab18（Q67L）vector transfection+ox-LDL incubation；LA：Rab18（S22N）vector transfection+ox-LDL incubation. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs WT group.圖2 轉(zhuǎn)染Rab18（Q67L）、Rab18（WT）和Rab18（S22N）質(zhì)粒后其mRNA 表達情況及不同活性Rab18 對荷脂巨噬細胞內(nèi)JAK2、STAT3和PLIN2 mRNA表達的影響

3 Rab18 對 荷 脂 巨 噬 細 胞 內(nèi)JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，HA 組、WT 組及LA 組中Rab18 的蛋白表達顯著增加（P＜0.05），證明轉(zhuǎn)染成功；而各轉(zhuǎn)染組之間Rab18 蛋白表達水平無顯著差異；與control組相比，HA 組和WT組中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白水平顯著升高，而PLIN2表達顯著減少（P＜0.05），見圖3。

4 Rab18 對荷脂巨噬細胞內(nèi)JAK2/STAT3 信號通路的影響

首先我們用免疫熒光法觀察荷脂巨噬細胞中Rab18 分別與JAK2 和STAT3 的共定位情況，細胞核染為藍色，Rab18 染為紅色，JAK2 和STAT3 染為綠色。如圖4A 所示，在荷脂巨噬細胞中，Rab18 與JAK2 和STAT3 確實均存在免疫熒光共定位現(xiàn)象。在此實驗基礎(chǔ)上，將細胞分為control組和HA 組。通過免疫熒光法檢測p-JAK2和p-STAT3水平和核移位情況。與control 組比，HA 組細胞質(zhì)中p-JAK2 和p-STAT3 發(fā)光程度明顯增加，同時藍色熒光細胞核內(nèi)顯示為綠色熒光的p-STAT3明顯增亮，見圖4B、C。

5 JAK2 抑制劑AG490 對Rab18 荷脂巨噬細胞內(nèi)JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 和PLIN2 蛋白水平的影響

將細胞分為control 組、HA 組和HA+AG490 組，均加入ox-LDL 共孵育24 h。RT-qPCR 結(jié)果顯示，與control組相比，HA組中JAK2和STAT3 mRNA表達顯著增加，PLIN2 表達顯著減少（P＜0.05）；與HA 組相比，HA+AG490 組JAK2 和STAT3 mRNA 表達顯著減少，PLIN2 mRNA表達顯著增加（P＜0.05），見圖5。

Western blot 結(jié)果顯示，與control 組相比，HA 組JAK2、STAT3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平均顯著升高，PLIN2 表達顯著減少（P＜0.05）；與HA 組相比，HA+AG490 組中JAK2、STAT3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平顯著降低，PLIN2 表達顯著增加（P＜0.05），見圖6。

免疫熒光結(jié)果（圖7）顯示，圖中紅色部分為PLIN2，藍色部分為細胞核。與control組相比，HA 組中PLIN2 的紅色熒光強度明顯減弱；與HA 組相比，HA+AG490組PLIN2的紅色熒光強度明顯增強。

Figure 3. Western blot was used to determine the protein levels of JAK2，STAT3，p-JAK2，p-STAT3 and PLIN2 in the cells of each transfection group. Control：50 mg/L ox-LDL incubation for 24 h；WT：Rab18（WT）vector transfection+ox-LDL incubation；HA：Rab18（Q67L）vector transfection+ox-LDL incubation；LA：Rab18（S22N）vector transfection+ox-LDL incubation. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs WT group..圖3 Rab18各轉(zhuǎn)染組細胞中JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3和PLIN2的蛋白水平

6 Rab18 及JAK2 抑制劑AG490 對巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積及TG的影響

將細胞分成6 組：blank control 組、control 組、HA組、WT 組、LA 組和HA+AG490 組。使用50 mg/L ox-LDL孵育后5組細胞，通過油紅O 染色觀察胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，采用GPO-PAP酶法測量細胞內(nèi)TG的含量。

油紅O 染色結(jié)果顯示，與blank control 組相比，control 組中脂質(zhì)蓄積顯著增加（P＜0.05）；與control組相比，HA 組及WT 組脂質(zhì)蓄積顯著減少（P＜0.05）；與HA 組相比，HA+AG490 組中細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積顯著增加（P＜0.05），見圖8。

細胞內(nèi)TG 含量檢測結(jié)果顯示，與control 組相比，WT 組及HA 組TG 含量顯著降低（P＜0.05）；與HA 組相比，HA+AG490 組TG 含量顯著增加（P＜0.05），見圖9。

討論

AS 是心腦血管疾病形成的主要原因之一，它在全世界范圍內(nèi)致死率極高，其復(fù)雜的發(fā)病機制至今尚未完全闡述清楚，其中脂質(zhì)代謝紊亂是AS 發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)之一［14］。LD 是儲存脂質(zhì)的細胞器［15］，其上可檢測到一種小GTP 酶Rab18［16］。Rab18是一種參與囊泡運輸?shù)男TP 酶，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和LD表面［17］，與分泌顆粒的調(diào)節(jié)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運輸、病毒感染和LD 代謝功能有關(guān)［18］。有報道證實，敲除Rab18會干擾LD 分解代謝，導(dǎo)致脂肪酸釋放受損，從而減少脂質(zhì)分解促進脂質(zhì)蓄積［19］。這提示Rab18可能通過減少泡沫細胞形成而抑制AS發(fā)生發(fā)展，但Rab18 減少脂質(zhì)蓄積的具體機制尚不明確。本研究表明，Rab18 能通過JAK2/STAT3 通路調(diào)控PLIN2的表達，從而抑制巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

PLIN2 是一種主要的LD 相關(guān)蛋白，可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和LD 形成。以往研究表明，上調(diào)PLIN2的表達后，細胞內(nèi)LD 的積累增強，促進了泡沫細胞的形成［20］。而下調(diào)PLIN2的表達可以抑制脂質(zhì)蓄積［21］。Ozeki［8］等發(fā)現(xiàn)，Rab18 的過表達導(dǎo)致HepG2和BALB/c 3T3 細胞LD 中脂肪分化相關(guān)蛋白（adipose differentiation-related protein，ADRP）的量減少。這提示Rab18與PLIN2存在相互作用，但其具體機制尚不明確。同時，探索Rab18下調(diào)PLIN2表達的具體機制對于減緩AS 斑塊的形成具有重要作用。既往研究表明，抗AS 作用部分歸因于THP-1 巨噬細胞中JAK2/STAT3 通路的抑制［22］，提示JAK2/STAT3 通路與AS 相關(guān)。高脂血癥是導(dǎo)致AS 進一步發(fā)展最重要的危險因素之一，它可以通過磷酸化JAK2 和隨后的STAT3，激活血管內(nèi)皮細胞的JAK/STAT 信號通路，導(dǎo)致AS 的惡化［23］，但JAK2/STAT3 通路參與AS 發(fā)生發(fā)展的具體機制尚未明確。既往研究發(fā)現(xiàn)，Rab11可激活JAK/STAT 信號通路［24］。Rab18 和Rab11 都是Rab 家族的成員，由此我們推測Rab18 也可能通過JAK2/STAT3 通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)蓄積［25］。有研究表明，JAK2/STAT3 抑制劑增強了PLIN2 的產(chǎn)生［22］，提示Rab18與JAK2/STAT3和PLIN2之間可能存在相互作用，但其具體機制尚不明確。

Figure 4. Colocalization of Rab18（red）and JAK2/STAT3（green）in lipid-lading macrophages observed by immunofluorescence（A；scale bar=10 μm），and the effect of high-activity（HA）Rab18 on p-JAK2/p-STAT3（green）protein level and its nuclear（DAPI，blue）translocation in lipid-lading macrophages observed by immunofluorescence（B and C；scale bar=20 μm）.Control：50 mg/L ox-LDL incubation for 24 h；HA：Rab18（Q67L）vector transfection+ox-LDL incubation.圖4 荷脂巨噬細胞中Rab18與JAK2/STAT3的共定位情況及高活性Rab18對p-JAK2和p-STAT3水平及其核轉(zhuǎn)位的影響

Figure 5. Effect of AG490 on the mRNA expression of PLIN2，JAK2 and STAT3 in lipid-lading macrophages with high-activity（HA）Rab18. Control：50 mg/L ox-LDL incubation for 24 h；HA：Rab18（Q67L）vector transfection+ox-LDL incubation； HA+AG490： Rab18（Q67L）vector transfection+AG490 pretreatment+ox-LDL incubation. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HA group.圖5 AG490 對Rab18 荷 脂 巨 噬 細 胞 中JAK2、STAT3 及PLIN2 mRNA表達的影響

我們的研究結(jié)果顯示，Rab18 各活性轉(zhuǎn)染組mRNA 表達增加，差異具有顯著性，而各轉(zhuǎn)染組中Rab18 蛋白表達水平無顯著差異。但WT Rab18 細胞組和HA Rab18 細胞組中JAK2 和STAT3 的mRNA及蛋白表達量均顯著增加，同時JAK2 和STAT3 的磷酸化水平升高，PLIN2 表達減少，脂質(zhì)蓄積減少，TG含量降低。按照我們對預(yù)期結(jié)果的猜想，LA Rab18組應(yīng)該可以阻礙或抑制胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此JAK2和STAT3的表達應(yīng)下調(diào)，PLIN2的表達與control組相比應(yīng)上升，但我們的結(jié)果顯示LA Rab18 細胞組中JAK2、STAT3 和PLIN2 表達及脂質(zhì)蓄積均無明顯變化。因此，我們推測LA Rab18 可能不發(fā)揮生物學(xué)作用，其中的分子作用機制需要進一步探討。同時，我們觀察到Rab18、JAK2 和STAT3 存在共定位，提示Rab18、JAK2 和STAT3 可能相互影響。HA Rab18 細胞中轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)的p-STAT3 明顯增加，且細胞內(nèi)p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平升高。以上實驗結(jié)果說明，Rab18 能 上 調(diào)JAK2 和STAT3 表 達，且 促 進p-STAT3 轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)。但轉(zhuǎn)入細胞核的p-STAT3 是否會影響其下游基因PLIN2表達尚待進一步研究。

Figure 6. Western blot was used to determine the protein levels of JAK2，STAT3，p-JAK2，p-STAT3 and PLIN2 in lipid-lading macrophages with high-activity（HA）Rab18 treated with AG490. Control：50 mg/L ox-LDL incubation for 24 h；HA：Rab18（Q67L）vector transfection+ox-LDL incubation；HA+AG490：Rab18（Q67L）vector transfection+AG490 pretreatment+ox-LDL incubation. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HA group.圖6 AG490對Rab18荷脂巨噬細胞中JAK2、p-JAK2、PLIN2、STAT3及p-STAT3蛋白水平的影響

Figure 7. Effect of AG490 on the expression of PLIN2（red）in lipid-lading macrophages with high-activity （HA）Rab18（scale bar=20 μm）. Control：50 mg/L ox-LDL incubation for 24 h；HA：Rab18（Q67L）vector transfection+ox-LDL incubation；HA+AG490：Rab18（Q67L）vector transfection+AG490 pretreatment+ox-LDL incubation.圖7 AG490對Rab18荷脂巨噬細胞PLIN2表達的影響

為了進一步研究Rab18 能否通過JAK2/STAT3調(diào)控PLIN2，我們對轉(zhuǎn)染了HA Rab18 的THP-1 巨噬細胞使用JAK2 抑制劑AG490 阻斷JAK2/STAT3 信號通路。結(jié)果顯示，HA Rab18 細胞中JAK2/STAT3 被抑制時，JAK2、STAT3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平降低，PLIN2 表達及熒光強度增加，這說明Rab18 對JAK2/STAT3 信號通路的傳導(dǎo)有促進作用，對PLIN2的表達有顯著抑制作用。以上實驗結(jié)果說明Rab18通過調(diào)控JAK2/STAT3 信號通路下調(diào)PLIN2 表達。研究已證明PLIN2 表達上調(diào)可增加細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積及TG 水平［27］，但Rab18 是否也可通過JAK2/STAT3信號通路影響脂質(zhì)蓄積及TG 的含量呢？Pulido［28］等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)3T3-L1 細胞的能量供應(yīng)不足時，Rab18 會增加細胞內(nèi)脂解的效率，提示Rab18 可能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。本研究結(jié)果顯示，HA Rab18 細胞中JAK2/STAT3 被抑制時，細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積及TG 含量增加，Rab18 抑制PLIN2 的作用進一步減弱。這說明Rab18 促進JAK2 和STAT3 的磷酸化，下調(diào)PLIN2 的表達，降低TG 水平，并抑制脂質(zhì)蓄積。而這個過程中，脂質(zhì)蓄積的減少可能與TG含量的減少有關(guān)。

Figure 8. Effects of Rab18 and AG490 on lipid accumulation in the macrophages（oil red O staining，scale bar=20 μm）. Blank control：without treatment；control：50 mg/L ox-LDL incubation for 24 h；HA：Rab18（Q67L）vector transfection+ox-LDL incubation；WT：Rab18（WT）vector transfection+ox-LDL incubation；LA：Rab18（S22N）vector transfection+ox-LDL incubation；HA+AG490：Rab18（Q67L）vector transfection+AG490 pretreatment+ox-LDL incubation. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs blank control group；#P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs HA group.圖8 Rab18及AG490對巨噬細胞脂質(zhì)蓄積的影響

Figure 9. Effects of Rab18 and AG490 on triglyceride content in the macrophages. Control：50 mg/L ox-LDL incubation for 24 h；HA：Rab18（Q67L）vector transfection+ox-LDL incubation；WT：Rab18（WT）vector transfection+ox-LDL incubation；LA：Rab18（S22N）vector transfection+ox-LDL incubation；HA+AG490：Rab18（Q67L）vector transfection+AG490 pretreatment+ox-LDL incubation. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs WT group；△P＜0.05 vs HA group.圖9 Rab18及AG490對巨噬細胞內(nèi)甘油三酯含量的影響

綜上所述，本研究表明，Rab18 可通過JAK2/STAT3信號通路下調(diào)PLIN2表達，從而抑制THP-1巨噬細胞中的脂質(zhì)蓄積。這一機制的發(fā)現(xiàn)可能為AS的防治提供新的實驗依據(jù)。