關(guān) 欣，陳立梅，初曉丹，張德剛

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

核仁是核糖體RNA基因(rDNA)和核糖體亞基裝配的場所，核仁增大和數(shù)量增多通常被作為鑒別惡性腫瘤的病理標(biāo)志.在電鏡下觀察核仁主要由纖維中心(FC)、致密纖維組分(DFC)和顆粒組分(GC)3種結(jié)構(gòu)組成[1-3].研究[4-6]表明：核仁中rDNA轉(zhuǎn)錄是腫瘤細(xì)胞特有的、在細(xì)胞周期中以高度動態(tài)變化的特異性作用于核仁結(jié)構(gòu)空間分離區(qū)域，調(diào)控核仁組裝、拆卸及相應(yīng)功能.核仁蛋白NPM1(Nucleophosmin)是典型的多功能的核仁蛋白，主要存在于核仁中，作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，可引起核仁形態(tài)大小和數(shù)量的變化[7-8].我們前期研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，核仁結(jié)構(gòu)在間期以兩個動態(tài)時段存在：G1期的FC/DFC是有絲分裂后以核仁組織者區(qū)(NOR)為中心構(gòu)建的結(jié)構(gòu)；G2期的FC/DFC是S期改構(gòu)后重新構(gòu)建的結(jié)構(gòu).本研究將建立細(xì)胞同步化培養(yǎng)體系，結(jié)合電鏡DNA特異性染色方法對HeLa細(xì)胞進(jìn)行觀察，使用免疫熒光抗體標(biāo)記NPM1蛋白，進(jìn)一步探討腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程中S期時段核仁DNA組分及調(diào)節(jié)其表達(dá)核仁蛋白的形態(tài)學(xué)構(gòu)效關(guān)系，為臨床腫瘤診療提供新的靶點.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗細(xì)胞：人宮頸癌HeLa 細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫).

主要試劑：1640培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO公司，美國)；胸腺嘧啶、 吖啶橙染色液(Sigma Aldrich公司，美國)；25%的戊二醛溶液、多聚甲醛溶液和醋酸雙氧鈾(北京新興百瑞技術(shù)有限公司)；Epon812環(huán)氧樹脂包埋劑套裝(SPI公司，美國)；NPM1和FITC標(biāo)記IgG二抗(Cell Signaling Technology公司，美國).

1.2 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞周期同步化

將HeLa細(xì)胞接種于1640新鮮培養(yǎng)基中，加入10%小牛血清在37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育.當(dāng)單層細(xì)胞大約生長到40%時，將2 mmol/L濃度胸腺嘧啶加入培養(yǎng)基中.37 ℃ 孵育18 h后，PBS(pH 7.0)沖洗細(xì)胞，加入新的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)9 h，再次沖洗細(xì)胞加入胸腺嘧啶繼續(xù)培養(yǎng)16 h，沖洗同步化細(xì)胞，繼續(xù)孵育并開始釋放.

1.3 核仁中DNA特異性染色和電鏡超薄切片制備

為了更直接地對核仁中DNA的排布進(jìn)行原位觀察，采用改良的NAMA-Ur方法[11].胸腺嘧啶阻斷后獲取HeLa細(xì)胞，用2.5%戊二醛和4%多聚甲醛室溫固定1 h，離心除去固定液，用PBS充分洗滌.將固定的HeLa細(xì)胞浸泡在NA溶液(NaOH，0.5 mol/L)4 ℃ 過夜處理，雙蒸水充分洗滌后再加入1%冰醋酸洗滌3次，再用雙蒸水充分洗滌.將細(xì)胞團(tuán)浸入MA溶液(V(甲醇)∶V(醋酸酐)=1∶5)中，室溫條件下處理24 h，直到樣品適度漂白.細(xì)胞團(tuán)用2.5%瓊脂糖包裹離心后取前端樣品，再將細(xì)胞樣品團(tuán)塊經(jīng)乙醇-甲醇系列脫水后，由甲醇和Epon812包埋劑混合液室溫浸透、包埋和聚合.在Reicher Jung切片機(jī)上切成厚度為60～80 nm的超薄切片，然后用5%水溶醋酸鈾60 ℃ 染色70 min.室溫冷卻，應(yīng)用雙蒸水洗滌后再烘干，在Hitachi-7500型透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察.

1.4 核仁DNA和RNA吖啶橙特異性染色

HeLa細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞周期同步化培養(yǎng)，分別收取0～16 h的細(xì)胞樣品.加入95%乙醇4 ℃ 固定1 h，PBS(pH 7.0)清洗3次，再加入濃度1%的吖啶橙染色液染色15 min，PBS漂洗3次.細(xì)胞樣品用90%甘油封片.激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞周期中核仁DNA和RNA的表達(dá)情況.為保證實驗的準(zhǔn)確性和真實性，每個樣品取5個視野觀察.

1.5 免疫熒光染色檢測NPM1蛋白表達(dá)

將HeLa細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞周期同步化培養(yǎng)后分別取0～16 h的細(xì)胞樣品，加入95%乙醇4 ℃ 固定1 h，PBS漂洗3次，加入0.5% TritonX-100穿孔.細(xì)胞經(jīng)5% BSA封閉30 min，加入1%BSA稀釋的NPM1抗體4 ℃ 過夜.加入1%BSA稀釋的FITC標(biāo)記的二抗，37 ℃ 雜交1 h，DAPI染色5 min，細(xì)胞樣品用90%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞周期中NPM1蛋白的表達(dá)情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 建立HeLa細(xì)胞周期不同階段同步化培養(yǎng)體系

采用胸腺嘧啶雙阻斷法將HeLa細(xì)胞阻斷在G1/S期的臨界點，以此為起始點釋放，以起始點為0 h開始取樣，將各時段采獲的細(xì)胞樣品分別定義為[9]：0～7 h 為S期(改組重構(gòu)時段)，8～12 h 為G2期(重構(gòu)后時段)，13～18 h為G1期(改組前時段)，并根據(jù)核仁FC和DFC超微結(jié)構(gòu)在S期發(fā)生的改組與重構(gòu)前后不同時段的形態(tài)變化特征，構(gòu)建了HeLa細(xì)胞核仁結(jié)構(gòu)在細(xì)胞周期進(jìn)程中的模式圖.見圖1.

圖1 HeLa細(xì)胞核仁結(jié)構(gòu)在細(xì)胞周期進(jìn)程中的模式Fig.1 Model diagram of nucleolar structureduring the cell cycle of HeLa cells

2.2 HeLa細(xì)胞核仁DNA組分在細(xì)胞周期不同時段的衍生過程

G1期改組前時段，核仁中較大的FC出現(xiàn)在核仁中央，且FC區(qū)域內(nèi)部或者邊緣出現(xiàn)染色較淺的染色質(zhì)纖維，依稀可見從外向內(nèi)伸入的DNA纖維.核內(nèi)染色質(zhì)開始解集縮成少量的條索狀纖維分散在核仁，位于DFC區(qū)域的DNA組分纖維有明顯的連接(見圖2 a白箭頭)，此時DFC的密度明顯高于核仁內(nèi)的其他區(qū)域，變得更加的松散、寬厚，形成“云狀DNA”，DFC區(qū)域的密度明顯高于核仁內(nèi)的其他區(qū)域，且FC與DFC的界線變得明顯(見圖2 a黑箭頭和白箭頭所示).

圖2 HeLa細(xì)胞周期中核仁DNA結(jié)構(gòu)和分布的動態(tài)衍生變化 (Bar，0.5 μm)Fig.2 Dynamic derivation change of nucleolar DNA configuration and distributionduring the cell cycle of HeLa cells (Bar，0.5μm)

在S期改組重構(gòu)時段，核仁DNA組分存在兩種形態(tài)：一種是在FC區(qū)域染色較淺的團(tuán)塊狀DNA組分，一種是在勻質(zhì)的結(jié)構(gòu)中致密的顆粒狀DNA組分(見圖2 b星號).細(xì)胞核仁內(nèi)FC區(qū)域有染色較淺的團(tuán)塊狀DNA組分(見圖2 b黑箭頭).隨著DNA快速的集縮和解集縮的形態(tài)轉(zhuǎn)化，使FC和DFC結(jié)構(gòu)區(qū)域從分界清晰逐漸變得模糊(見圖2 b白箭頭).值得注意的是，這個時段核膜周邊團(tuán)塊狀染色質(zhì)開始發(fā)生集縮，連續(xù)分布于核仁周邊形成一個連續(xù)的“環(huán)狀”DNA組分圍繞在核仁周圍(見圖2 b白箭頭).

G2期重構(gòu)后時段，核仁周圍的“環(huán)狀”DNA染色質(zhì)纖維開始變得松散伸入核仁內(nèi)部.FC區(qū)域出現(xiàn)染色較淺的塊狀DNA組分，DFC區(qū)域的DNA組分逐漸變淺，F(xiàn)C邊緣與DFC交界處區(qū)域含有致密的顆粒狀DNA組分(見圖2 c黑箭頭和白箭頭).核仁內(nèi)DNA組分的密度變得極不均勻，以較淺極細(xì)的染色質(zhì)纖維的形態(tài)交聯(lián)在一起與核仁周邊染色質(zhì)纖維相互連接的更加密集(見圖2 c白箭頭).隨后染色質(zhì)在核膜處大面積高度的集縮，呈大塊染色質(zhì)團(tuán)塊，此時核仁周邊染色質(zhì)延伸到核膜處，伴隨這一過程核仁逐漸解體(見圖2 d白箭頭).結(jié)果顯示：核仁周邊染色質(zhì)不僅是核仁結(jié)構(gòu)組分FC和DFC中DNA組分的重要來源，也是維持核仁正常形態(tài)的重要物質(zhì).

2.3 吖啶橙特異性熒光染色檢測DNA和RNA表達(dá)

將HeLa細(xì)胞在含2 mmol/L的胸腺嘧啶1640培養(yǎng)基中進(jìn)行同步化培養(yǎng)，選取4、8、16 h的細(xì)胞，采用吖啶橙特異性熒光染色，檢測細(xì)胞核內(nèi)DNA和RNA表達(dá)變化情況.DNA綠色熒光分布在細(xì)胞核內(nèi)和核仁周邊，RNA橙色熒光在核仁中有很強(qiáng)的熒光信號，細(xì)胞核內(nèi)熒光信號弱.觀察結(jié)果顯示：S期核仁體積最小，數(shù)量最少，在G2期核仁體積最大，數(shù)量最多.在G1期較強(qiáng)的DNA綠色熒光分布核膜處核仁周邊，RNA橙色熒光主要分布在核仁內(nèi).在G2期，RNA 橙色熒光信號最強(qiáng)，提示RNA轉(zhuǎn)錄活躍程度在G2期最強(qiáng).見圖3.

圖3 HeLa細(xì)胞間期不同時段的核內(nèi)DNA和RNA表達(dá)情況 (Bar，0.5 μm)Fig.3 Nucleolar DNA and RNA expression at various time points of interphase in HeLa cells (Bar，0.5 μm)

2.4 免疫熒光染色檢測NPM1蛋白表達(dá)

將HeLa細(xì)胞在含2 mmol/L的胸腺嘧啶1640培養(yǎng)基中進(jìn)行同步化培養(yǎng)，選取4、8、12、16 h 的細(xì)胞.前期研究發(fā)現(xiàn)，通過同步化培養(yǎng)細(xì)胞，觀察到核仁結(jié)構(gòu)在細(xì)胞周期進(jìn)程中是高度動態(tài)變化的.見圖1.通過熒光標(biāo)記檢測綠色熒光的NPM1蛋白在細(xì)胞周期進(jìn)程中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：NPM1蛋白在細(xì)胞周期各時期中熒光表達(dá)水平變化較大，在G1期和S期均定位于核仁，但在核仁結(jié)構(gòu)重構(gòu)后的G2期表達(dá)顯著增加，不僅位于核仁中，也位于核質(zhì)和核膜表面.見圖4.

圖4 HeLa細(xì)胞間期不同時段的NPMI蛋白表達(dá)情況Fig.4 NPM1 expression at various time points of interphase in HeLa cells

3 討 論

核仁是核糖體基因(rDNA)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)一步加工成熟的形態(tài)學(xué)表現(xiàn).最新研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤細(xì)胞核仁在核糖體生物發(fā)生和調(diào)控細(xì)胞增殖中發(fā)揮著驅(qū)動中心的作用，提示核仁大小和形態(tài)變化與腫瘤的惡性程度相關(guān)，其特性可為抗腫瘤策略提供新的可行性靶點[12].而且腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞周期多個時段存在 DNA 復(fù)制行為，這可能與 DNA 復(fù)制異常引起DNA 損傷導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生有關(guān)，可見保持 DNA 的穩(wěn)定性對于核仁的正常結(jié)構(gòu)和功能是至關(guān)重要的[13].因此，研究腫瘤細(xì)胞核仁DNA組分及其核仁蛋白在細(xì)胞周期進(jìn)程中的動態(tài)轉(zhuǎn)化特點，使細(xì)胞核仁更有希望成為抗癌策略的目標(biāo)靶點.

核仁結(jié)構(gòu)決定其功能，核仁中DNA轉(zhuǎn)錄區(qū)域是腫瘤細(xì)胞特有的RNA polI唯一高效轉(zhuǎn)錄的靶點[3，5，12-13].我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：HeLa細(xì)胞核仁結(jié)構(gòu)在細(xì)胞間期的S期時段FC/DFC發(fā)生了改構(gòu)與重構(gòu)，核仁大小和數(shù)量隨之發(fā)生改變.本研究結(jié)果顯示：核仁內(nèi)DNA組分動態(tài)分布是隨著HeLa細(xì)胞周期進(jìn)程中 FC/DFC結(jié)構(gòu)高度動態(tài)變化的，共經(jīng)歷了3個時段：1)G1期核仁內(nèi)DNA組分解集縮時形成云狀DNA；2)S期核仁內(nèi)DNA組分有兩種分布形態(tài)：一種是在FC區(qū)域染色較淺的團(tuán)塊狀DNA組分，一種是在勻質(zhì)的結(jié)構(gòu)中致密的顆粒狀DNA組分；3)G2期核仁內(nèi)染色較淺極細(xì)的纖維形式交聯(lián)在一起.提示S期時段可能是調(diào)控核仁結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵節(jié)點.

核仁功能的改變與核仁蛋白在核仁中的定位和易位密切相關(guān).越來越多的研究[3，8，14]提示：核仁蛋白易位的發(fā)生是核仁結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵問題.當(dāng)細(xì)胞處于有絲分裂期時核仁解體，核仁蛋白重新定位.我們前期通過對核仁結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)[9-10]：核仁在細(xì)胞周期進(jìn)程中不是簡單的形成和解體，而是在細(xì)胞周期進(jìn)程中S期時段內(nèi)其結(jié)構(gòu)組分發(fā)生改構(gòu)與重構(gòu)；FC和DFC的數(shù)量、大小和形態(tài)變化是由核仁結(jié)構(gòu)的改構(gòu)與重建產(chǎn)生的.NPM1是典型的易位蛋白，對于維持核仁的結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用，亦可作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[10].本研究結(jié)果顯示：NPM1蛋白在G1期(改組前時段)和S期(改組重構(gòu)時段)均位于核仁中，在G2期(重構(gòu)后時段)表達(dá)顯著增加，不僅存在于核仁中，也位于核質(zhì)和核膜表面，提示NPM1蛋白不僅在核仁解體后重新定位，在S期時段隨著核仁的改組重構(gòu)也發(fā)生了易位，從而誘導(dǎo)核仁解聚轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為核仁形態(tài)大小、數(shù)量以及DNA組分的高度動態(tài)變化.

核仁的主要功能是調(diào)控核糖體的生物合成與成熟，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮著驅(qū)動中心的作用.本研究發(fā)現(xiàn)：以S期改組重構(gòu)時段為形態(tài)轉(zhuǎn)換交界點，核仁DNA以兩種形式存在：松散的“云狀”DNA纖維(G1期為改組前時段和 G2期為重構(gòu)后時段)和致密的染色質(zhì)顆粒(S期改組重構(gòu)時段)呈勻質(zhì)狀態(tài)均勻的分散在核仁內(nèi).根據(jù)核仁功能在其結(jié)構(gòu)上區(qū)間隔離化的作用原理，我們推測核仁中DNA組分發(fā)生集縮和解集縮的高度動態(tài)變化以及NPM1蛋白從核仁到核質(zhì)的易位事件，提示S期的變化可能是調(diào)控腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵拐點.