臧思航，葛麗麗，劉 強(qiáng)，鄭金萍，郭忠玲

(北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013)

紫椴(Tiliaamurensis)為椴樹科(Tiliaceae)椴樹屬(Tilia)落葉喬木，是我國東北林區(qū)珍貴的用材樹種和蜜源樹種，也是國家二級保護(hù)樹種[1].由于具有重要的生態(tài)價值及經(jīng)濟(jì)價值，近年來被過量開采，紫椴種群數(shù)量和質(zhì)量逐年降低[2].除此之外，紫椴種子具有一定的休眠特性，也是造成紫椴種群天然更新不良的重要原因[3].在解除種子休眠方面，浸種與層積是常用的手段，不會對種子造成損傷.成熟的林木種子只有在水分充足的條件下吸漲才能萌發(fā).趙群金[4]提出的“三水電層”假說指出，種子生理現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于改變了活性中心所控制的電荷特征所起的作用，浸種過程會使擴(kuò)散層水分子數(shù)量增多，運(yùn)動速度加快，活性中心控制區(qū)域的電荷密度增加，從而激活控制酶發(fā)生相關(guān)化學(xué)反應(yīng)，種子的休眠狀態(tài)被打破.金雅琴等[5]研究指出，層積過程能夠顯著增加種子內(nèi)部的赤霉素(GA3)含量，并有助于降低種子中脫落酸(ABA)的含量，為破除種子休眠、促進(jìn)萌發(fā)創(chuàng)造條件，隨著層積處理時間的增加，種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢均隨之增加.根據(jù)“三水電層”假說，層積會影響種子內(nèi)部水分子的運(yùn)動狀態(tài)，以及某區(qū)域的電荷密度，打破活性中心與“三水電層”電荷平衡，使種子內(nèi)的激素平衡向著促進(jìn)發(fā)芽的方向轉(zhuǎn)化[4].

植物內(nèi)源激素在植物的整個生長發(fā)育階段起著重要作用，生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸是常見的植物內(nèi)源激素[6]，以往研究[7-10]證明了種子休眠與內(nèi)源激素間存在一定關(guān)系.本研究通過測定浸種與層積過程中紫椴種子中4種內(nèi)源激素(吲哚乙酸(IAA)、ABA、GA3、玉米素(ZT))含量，分析其在種子解除休眠過程中的調(diào)控作用.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫椴種子來源于吉林省林木種子調(diào)制儲備中心，種源為吉林省臨江種源，采種時間為2019年9月.種源地位于吉林省東南部的長白山腹地，屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫2～4 ℃，年降水量750～1 000 mm.試驗(yàn)前，先將紫椴種子除去果梗與雜物，再挑選籽粒飽滿的種子作為供試材料.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 浸種處理

將紫椴種子倒入容器內(nèi)，加入冷水浸泡，水量以沒過種子10 cm左右為宜.浸泡過程中，要視水質(zhì)情況定期換水，當(dāng)水變得渾濁、微起泡沫、產(chǎn)生異味時換水.在浸種的第2、4、6、8、9、10天分別取樣，于-80 ℃超低溫冰箱中保存待用.

1.2.2 層積處理

層積處理參見楊立學(xué)等[11]的方法，將去除雜質(zhì)的種子洗脫后晾干，用0.5%的KMnO4溶液消毒，轉(zhuǎn)入0～5 ℃冰箱層積.種子與濕沙的體積比為1∶3，沙子的相對含水率為60%～70%.層積過程中保持濕潤，并定期翻動，層積90 d左右，每15 d取樣1次，共計(jì)6次.

1.2.3 內(nèi)源激素測定

試驗(yàn)所用儀器為島津超高效液相色譜儀(LC-30AT)連接SCIEX 5600+質(zhì)譜儀.色譜柱為SHIMADZU InerSustain C18(100 mm×2.1 mm，2 μm)，流動相A：乙腈，B：0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，柱溫35 ℃，進(jìn)樣器溫度為4 ℃，進(jìn)樣量為10 μL.

樣品前處理：稱取0.15 g樣品，加入1 mL 80%甲醇溶液浸泡12 h，保存于4 ℃冰箱中.在冰水中水浴超聲30 min，離心5 min(12 000 r/min，4 ℃).取800 μL上清液，常溫下減壓回收溶劑.殘?jiān)尤?0 μL 80%甲醇復(fù)溶.上樣SPE色譜柱富集植物激素.用160 μL蒸餾水洗滌2次，再用5%甲醇水溶液160 μL洗滌兩次，棄去洗液，用160 μL甲醇洗滌4次，收集甲醇洗液.減壓濃縮至干，加入100 μL甲醇復(fù)溶，即得到植物激素供試品溶液.進(jìn)樣10 μL.

2 結(jié)果與分析

2.1 激素標(biāo)準(zhǔn)品提取色譜

配置內(nèi)源性植物激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3中的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析.標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間見圖1.

圖1 激素標(biāo)準(zhǔn)品提取色譜Fig.1 Chromatogram of hormones standard extraction

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以IAA、ABA、ZT、GA3標(biāo)準(zhǔn)品為原溶液，配置一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合液，用峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x)作線性回歸曲線，得到的回歸方程見表1.

表1 內(nèi)源激素測定的工作曲線Tab.1 Calibration curves of internal hormones

2.3 浸種過程中的內(nèi)源激素含量

不同浸種時間4種激素含量變化見圖2.作為種子萌發(fā)的引發(fā)手段，浸種將種子由休眠或低活力狀態(tài)提高到旺盛生長水平，期間有很多物質(zhì)參與其中，形成了有利于種子萌發(fā)的狀態(tài).由圖2可見：種子進(jìn)入水中后，作為促進(jìn)種子萌發(fā)的主要激素，IAA含量呈現(xiàn)波浪形變化.未浸種的種子中IAA含量較高，在浸種8 d后，種子中的IAA含量最低；從整個浸種過程來看，果皮中的IAA含量低于種子內(nèi)部胚中的IAA含量.

圖2 不同浸種時間4種激素含量Fig.2 Content of four hormones in different soaking times

ABA含量在未浸種時的含量較高，浸種2天時ABA含量急劇下降(1 279.57 ng/g).在浸種過程中，ABA含量呈先降低后升高的趨勢，在浸種8天時達(dá)到最低(150.98 ng/g).

浸種初期，種子中GA3含量總體較低，隨著浸種時間的增加，GA3含量呈增加趨勢，浸種8天時有所下降，但高于對照組的GA3含量，浸種9天時GA3含量最高.在浸種初期，種子外部果皮中的GA3含量高于種子內(nèi)部胚乳中的GA3含量.隨著水浸時間的增長，從浸種第4天開始，種子內(nèi)部的GA3含量超過果皮中的GA3含量.

未水浸的種子果皮中ZT含量較高，整個浸種過程種子外部的ZT含量始終低于種子胚乳中的ZT含量.浸種2 d，種子中ZT含量最高，4～10 d種子中ZT含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，浸種第9天時，內(nèi)部的ZT含量最高，且高于對照組.

2.4 層積過程中內(nèi)源激素含量

不同層積時間4種激素含量見圖3.由圖3可見：在層積過程中，種子果皮中的IAA含量較低(21.85 ng/g)，而種子內(nèi)部的IAA含量在90天左右達(dá)到最大(45.82 ng/g)，種子中IAA含量整體呈現(xiàn)“升高—降低—升高”的趨勢；在45天時，ABA含量較高(72.83 ng/g)，隨著層積時間的增加，種子中ABA含量整體呈現(xiàn)“升高—降低”的趨勢；GA3含量在層積初期呈上升趨勢，隨著時間的增加，在45天左右達(dá)到最大，繼續(xù)層積，種子中GA3含量逐漸下降，但胚乳中的GA3含量有所增加；種子內(nèi)部的ZT含量一直高于果皮中ZT的含量，整體變化趨勢呈“W”狀，在層積45天時達(dá)到峰值，60天時急劇下降.

圖3 不同層積時間4種激素含量Fig.3 Content of four hormones in different stratification times

2.5 內(nèi)源激素比值

不同浸種時間內(nèi)源激素比值變化見圖4.由圖4可見：在浸種過程中，紫椴種子ABA/IAA呈先下降后回升的趨勢，未處理時，種子中ABA/IAA為103.451 3，為最高值，隨著浸種時間的增加，ABA/IAA逐漸降低，在浸種第9天，ABA/IAA又開始回升；ABA/ZT變化趨勢與ABA/IAA相同，未水浸的種子中ABA/ZT為39.253 1，為最高值，浸種4～8 d，ABA/ZT略有下降，在浸種9 d以后，ABA/ZT有所回升，在浸種第10天達(dá)到24.007 3；ABA/GA3在浸種初期為788.617 9，隨后比值急劇下降，在浸種第8天時降到最低(18.998 8)，9～10 d呈上升趨勢.

不同層積時間內(nèi)源激素比值見圖5.由圖5可見：在層積過程中，紫椴種子ABA/IAA變化趨勢與ABA/ZT基本一致，ABA/IAA與ABA/ZT在種子層積初期接近于0，隨著層積時間的增加，在60天時達(dá)到最大值；ABA/GA3在層積初期急劇上升，在45～60 d變化緩慢，到層積后期急劇下降為1.234 3.

圖4不同浸種時間內(nèi)源激素比值Fig.4Endogenous hormone ratio in different soaking periods圖5不同層積時間內(nèi)源激素比值Fig.5Endogenous hormone ratio in different stratification stages

3 結(jié)論與討論

本次研究發(fā)現(xiàn)，在浸種過程中，紫椴種子IAA含量不斷變化.浸種初期(0～6 d)，果皮中的生長素含量隨著浸種時間的增加呈上升趨勢，在浸種6天時，果皮中的抑制物含量較低，此時果皮中的生長素對胚的發(fā)育起一定的促進(jìn)作用，當(dāng)浸種達(dá)到9 d時，種子的整體抑制物水平降到最低，開始產(chǎn)生IAA，且種子內(nèi)部所形成的生長素量要高于外部果皮中生長素的量.王志清等[12]研究認(rèn)為，細(xì)辛種子IAA含量變化呈波浪形變化是因?yàn)榉N子吸水膨脹后需要IAA來促進(jìn)種子萌發(fā)，但當(dāng)IAA含量達(dá)到一定值時則會抑制萌發(fā).本研究分離后的種子在浸種過程中可能由于ABA含量較低，部分時間節(jié)點(diǎn)并未檢測到ABA，因此，通過檢測完整種子中脫落酸的含量來反映此過程的ABA含量的動態(tài)變化.測定結(jié)果表明：水浸過程能夠大大減少ABA含量.浸種萌發(fā)過程中，伴隨著ABA降解導(dǎo)致含量降低，種子對ABA的敏感性也降低[13].浸種2～4 d，IAA含量有所增加，此時ABA含量降低；在6～8 d，兩種激素的含量都呈下降趨勢；浸種9～10 d，IAA含量降低，ABA含量有所上升.浸種前期，GA3含量呈上升趨勢，種子外部的GA3含量要高于種子內(nèi)部的GA3含量，浸種4 d后，內(nèi)部的GA3明顯比果皮中的含量多，第6天時果皮中的抑制物含量最低，此時的GA3含量達(dá)到最高，到第9天左右，種子內(nèi)部的GA3含量達(dá)到最高.在浸種過程中，果皮中的ZT變化并不明顯，但種子內(nèi)部胚中的ZT含量在4～9 d呈上升趨勢，隨后在9～10 d有所下降.

低溫層積過程中，植物激素對種子解除休眠的調(diào)控是各種激素協(xié)同作用的結(jié)果[14].層積初期(1～2月)，紫椴種子中IAA含量無明顯變化，或許是因?yàn)镮AA需要經(jīng)歷一段時間才能從束縛態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，60 d左右，種子內(nèi)部的IAA含量開始下降，隨后在層積90 d左右種子內(nèi)部胚中的IAA含量達(dá)到最高，推測此時紫椴種子接近萌發(fā)狀態(tài)，所以種子內(nèi)部的生理生化過程加速，而種子外部果皮中的IAA含量在整個層積過程中基本保持不變.類似結(jié)果也存在于紅松(Pinuskoraiensis)種子萌發(fā)過程中.李金克等[15]研究表明，紅松種子在低溫層積過程中的生長素含量呈現(xiàn)先降后升的“V”形變化.未作處理的種子中ABA的量極高，開始層積時ABA含量降低，45 d左右又有所增加，但隨著層積時間的增加，種子中的ABA量呈下降趨勢，75天時未能檢測出ABA，猜測此時種子中的ABA含量極低.總體來看，ABA含量一直保持較低水平，推測ABA含量下降或許導(dǎo)致種子發(fā)生萌動，但是并不是解除休眠的前提.近年來，有研究[16]也表明，種子的休眠與解除是由多種抑制物質(zhì)同時作用的結(jié)果.本研究中，ABA的含量變化趨勢證明了ABA介入了種子休眠誘導(dǎo)，但是否是萌發(fā)的主要抑制物質(zhì)還需進(jìn)一步證明.種子內(nèi)GA3的含量變化與IAA大致相同，均是呈先增加后降低再增加的趨勢，層積兩個月GA3含量最低，層積后期又有所回升.在種子出現(xiàn)萌發(fā)跡象以前，GA3含量處于不斷累積的過程，說明GA3對解除種子休眠具有一定的促進(jìn)作用.種子外部果皮中ZT含量在層積過程中無明顯變化，種胚中的ZT前期降低，隨后在第45天達(dá)到峰值，或許是由于種子將要萌發(fā)引起的含量變化，之后急劇降低，直至第90天才有所回升，推測是種子萌發(fā)后新生器官內(nèi)源激素合成的結(jié)果.