許丁帆 何遠秦 劉艷軍 賀峰

摘? ? 要：以玫瑰石斛蒴果為外植體，通過種子無菌萌發(fā)誘導原球莖、原球莖增殖與叢生芽分化、生根壯苗試驗，建立玫瑰石斛組培快繁體系，為玫瑰石斛繁育和優(yōu)質種苗生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。結果顯示：玫瑰石斛蒴果經(jīng)外植體消毒后，將蒴果內(nèi)種子撒播于1/2MS培養(yǎng)基上，種子可快速萌發(fā)形成原球莖;玫瑰石斛原球莖增殖與分化最佳培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA，原球莖的增殖系數(shù)達6.04，叢生芽生長速度快;玫瑰石斛最適的生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+50 g·L-1土豆泥，生根率達100%，平均根數(shù)為5.14條，平均株高達5.54 cm。

關鍵詞：玫瑰石斛;組織培養(yǎng);激素;培養(yǎng)基

中圖分類號：S664.1? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.05.001

Establishment of Tissue Culture and Rapid Propagation System in Dendrobium crepidatum

XU Dingfan1， HE Yuanqin1， LIU Yanjun1， HE Feng2

（1. College of Horticulture and Landscape Architecture，Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384，China; 2. WeixianYiju Planting and Gardening Design Co. Ltd， Handan， Hebei 056800， China）

Abstract：Taking the capsules of Dendrobium crepidatum as the explant， the tissue culture and rapid propagation system of Dendrobium crepidatum was established through the experiment of inducing protocorm， protocorm proliferation， cluster bud differentiation， rooting and strengthening seedlings by aseptic germination of seeds， which provided a reference basis for Dendrobium crepidatum breeding and high-quality seedling production. The results showed that after the capsules were disinfected， the seeds in the capsule were sown on 1/2MS medium， then the seeds could germinate rapidly to form protocorms; the optimum medium for the proliferation and differentiation of protocorms was 1/2MS+1.0 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 NAA， which the proliferation coefficient of protocorms reached 6.04 and the growth rate of cluster buds was fast; The optimum rooting medium was 1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+50 g·L-1 mashed potato， which the rooting rate was 100%， the average number of roots was 5.14， and the average plant height was 5.54 cm. The results of this experiment laid a foundation for the rapid propagation of Dendrobium crepidatum， and provided a reference basis for Dendrobium crepidatum breeding and high-quality seedling production.

Key words： Dendrobium crepidatum; tissue culture; hormone; medium

玫瑰石斛（Dendrobium crepidatum Lindl.et Paxt.），蘭科石斛屬植物，具有滋陰益胃、生津除煩等功效[1]。同時，玫瑰石斛花色艷麗，具有較高的園藝觀賞價值，是市場熱門的觀賞石斛之一。但玫瑰石斛野生資源匱乏，種源成為制約玫瑰石斛人工大規(guī)模生產(chǎn)的重要因素。

當前，玫瑰石斛主要以分株、扦插等方式繁殖，生產(chǎn)效率低、繁殖速度慢，不能滿足市場的需求;且長期的營養(yǎng)繁殖易導致病毒累積從而使品種退化。以組培快繁技術對玫瑰石斛進行種苗繁殖，可在短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質種苗，速度快、繁殖系數(shù)高，同時還可以解決玫瑰石斛種源問題，在一定程度上保護玫瑰石斛野生資源。然而，目前關于玫瑰石斛的研究主要集中生藥學鑒定[2]、主要功能成分分析[3-4]等方面，關于玫瑰石斛的組織培養(yǎng)研究報道較少。白音等[5]最早以玫瑰石斛無菌萌發(fā)的種胚苗莖節(jié)或莖段為材料建立組織培養(yǎng)及快速繁殖體系;蘇江等[6]以玫瑰石斛莖段為外植體誘導原球莖，并對原球莖進行增殖，進而獲得玫瑰石斛種苗;許丁帆等[7]以玫瑰石斛葉片為外植體誘導原球莖并增殖，建立了穩(wěn)定高效的玫瑰石斛原球莖生產(chǎn)體系。這些研究大多局限于某一階段，未形成系統(tǒng)、可靠的玫瑰石斛快繁技術體系。因此，建立一個完整、系統(tǒng)的組培快繁體系對玫瑰石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

無菌播種是目前常用的石斛種苗繁育方式。在自然條件下，石斛種子極為細微且無胚乳，只能在適宜環(huán)境下與真菌共生才可萌發(fā)，自然萌發(fā)率不到5%[8]。在使用無菌播種的方式時，通過人工給予豐富的養(yǎng)分及適宜的條件，使種子的萌發(fā)率能達到90%以上[9]。在提高種子萌發(fā)率的同時，無菌播種也能發(fā)揮出蘭科植物種子量極大的優(yōu)勢，可以顯著提高石斛種苗的繁育速度[10]。使用無菌播種的方式誘導鐵皮石斛原球莖的研究較多，也因種子擁有直接成苗的能力，許多研究進一步改進了組織培養(yǎng)技術，形成了三步成苗乃至一步成苗的工藝，極大的簡化了鐵皮石斛的成苗程序[11-12]。目前尚未見到相關研究在玫瑰石斛組織培養(yǎng)中使用無菌播種的方法。

本研究以玫瑰石斛種子為外植體，研究無菌播種、原球莖誘導、原球莖增殖、叢生芽分化及生根壯苗等組培技術流程，以期建立一套高效的玫瑰石斛組培快繁體系，為玫瑰石斛大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用玫瑰石斛蒴果取自魏縣益聚種植園藝設計有限公司玫瑰石斛盆栽苗，盆栽基質為水苔。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌播種與原球莖誘導 摘取玫瑰石斛蒴果于燒杯中，滴1～2滴吐溫，流水下沖洗30 min，然后在超凈工作臺中用75%乙醇浸泡45 s， 之后用含2%有效氯的次氯酸鈉溶液滅菌20 min， 最后用無菌水浸泡3次，每次浸泡5 min。滅菌之后用無菌濾紙吸干玫瑰石斛蒴果表面水分，并切開蒴果前端，將種子均勻撒播于1/2MS培養(yǎng)基上，接種后每天觀察記錄種子萌發(fā)情況，并采用尼康SMZ25體視顯微鏡進行觀察。

1.2.2 原球莖增殖與叢生芽分化 將種子萌發(fā)后獲得的原球莖轉接到原球莖增殖與叢生芽分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基以1/2MS+1.0 mg·L-16-BA為基礎，附加不同濃度的NAA（0.1，0.2，0.5，1.0 mg·L-1）。每種培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶接種約100個原球莖，試驗重復3次。培養(yǎng)45 d后觀察記錄原球莖生長情況并統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.3 玫瑰石斛的生根壯苗培養(yǎng) 選擇長勢一致且生長健壯的0.5～1.0 cm的叢生苗接種到生根壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，其中附加一定濃度的NAA（0.2 mg·L-1）、土豆泥（20，50，100 mg·L-1）。每個培養(yǎng)基配方接種10瓶，每瓶接種玫瑰石斛叢生苗5個，試驗重復3次。培養(yǎng)開始后，每天觀察植株生長情況，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計每個處理玫瑰石斛的生根率、平均根數(shù)和平均株高。

1.2.4 培養(yǎng)條件 以上培養(yǎng)基均添加6.5 g·L-1瓊脂，20 g·L-1蔗糖，滅菌前調(diào)節(jié)pH為5.8～6.0，121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min。培養(yǎng)條件為25±2 ℃，24 h光照，光照強度1 000～1 500 lx。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

增殖系數(shù)=增殖后的有效原球莖總數(shù)/起始接種總數(shù)[13];

生根率%=產(chǎn)生根的幼苗數(shù)/接種芽數(shù)×100%;

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS Statistic 22.0進行數(shù)據(jù)分析，Duncans新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 種子萌發(fā)及原球莖的誘導

玫瑰石斛播種后逐漸吸水膨脹，5～7 d后種子膨大明顯并呈淡綠色，30 d后逐漸形成綠色原球莖。

2.2 玫瑰石斛原球莖增殖與叢生芽誘導

由表1可知，在1/2MS+1.0 mg·L-1 BA的基礎上附加一定量的NAA有利于原球莖的增殖，原球莖的增殖系數(shù)顯著高于未附加NAA的培養(yǎng)基上的原球莖增殖系數(shù)。在NAA濃度在0至0.5 mg·L-1范圍內(nèi)時，原球莖的增殖系數(shù)隨添加的NAA濃度上升而增加。當在1/2MS+1.0 mg·L-1 6-BA的基礎上附加0.5 mg·L-1 NAA時，原球莖增殖系數(shù)最高，達6.04，且此時原球莖多數(shù)萌發(fā)成叢生芽，且叢生芽生長速度快，長勢均勻、整齊。當增加NAA用量至1.0 mg·L-1時，原球莖的增殖系數(shù)未顯著提高，但此時分化的叢生芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。因此，玫瑰石斛原球莖增殖與分化最佳培養(yǎng)基為：1/2MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA。

2.3 玫瑰石斛生根壯苗培養(yǎng)

從表2可以看出，玫瑰石斛在1/2MS培養(yǎng)基上生長緩慢，植株矮小，隨培養(yǎng)時間的延長葉片逐漸黃化;當在1/2MS培養(yǎng)基中添加0.2 mg·L-1 NAA時，玫瑰石斛生長速度略有加快，生根率、平均根數(shù)和平均株高均有顯著提高，但后期仍然停止生長，葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。在1/2MS+0.2 mg·L-1NAA培養(yǎng)基中添加一定濃度的土豆泥，玫瑰石斛生根與生長勢顯著提高，說明添加適量土豆泥較有利于玫瑰石斛生根壯苗;當在培養(yǎng)基中添加50 g·L-1土豆泥時，玫瑰石斛生根壯苗情況最佳，生根率、平均根數(shù)和平均株高顯著高于其他處理，此時玫瑰石斛植株粗壯、葉翠綠舒展。因此，玫瑰石斛最適的生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+50 g·L-1土豆泥。

3 結論與討論

外植體消毒是建立玫瑰石斛無菌體系的關鍵步驟。在玫瑰石斛組培快繁研究中，前人均以HgCl2為消毒劑進行外植體消毒[5-6]。但目前HgCl2使用受到嚴格管控，較難獲取。因此，本研究以易獲取的2%有效氯的次氯酸鈉溶液為消毒劑。蒴果的果皮對石斛種子具有保護作用，在外植體消毒過程中可以避免因消毒程度過深而損傷種子，故在石斛無菌播種中，控制污染率的關鍵在于對蒴果表皮的消毒上。本研究適當?shù)难娱L了外植體消毒的時間，對蒴果進行了20 min的消毒，以此來降低污染率。試驗結果顯示種子播種后未見污染現(xiàn)象，可見使用次氯酸鈉溶液對蒴果進行長時間消毒的方法可以有效降低污染風險。

在原球莖增殖試驗中，本研究討論了NAA濃度對原球莖增殖率的影響，結果顯示NAA對原球莖的增殖具有顯著影響，且適宜的NAA濃度為0.5 mg·L-1。而在蘇江等[6]的試驗結果顯示NAA對原球莖增殖的影響不顯著，與本試驗的結果存在差異。初步推斷，產(chǎn)生差異的原因可能在于原球莖的來源不同，本研究中的原球莖直接由種子誘導而來，蘇江等使用的原球莖由莖段誘導而來，因此對NAA可能存在敏感性上的差異。具體原因有待進一步的試驗來討論。

本研究在玫瑰石斛的壯苗培養(yǎng)中對土豆泥進行了討論，分別設置了20，50，100 g·L-1 3種用量梯度，結果顯示添加50 g·L-1土豆泥的培養(yǎng)基壯苗效果最佳。土豆泥是在石斛組培中一種常見的有機添加物，對種子的萌發(fā)、原球莖的增殖生長以及芽的生長等方面都具有促進作用。目前對于土豆泥對石斛生長促進作用的機理尚不明確，有待進一步的研究討論。謝寅峰等[14]認為土豆泥等天然有機添加物中的糖類、有機成分、各種維生素及礦物質等微量元素能給組培苗提供生長發(fā)育所需要的各種養(yǎng)分，同時提高了組培苗在組培室的弱光環(huán)境下的碳代謝的能力，進而促進組培苗壯苗。土豆泥天然有機添加劑存在成分大多不明、含量不穩(wěn)定等問題，無法確定各種成分中促進組培苗生長的具體有效成分，在進行具體的有機添加劑試驗時，應先做預備試驗加以驗證再進行具體試驗[15]。同時有研究顯示相較于對照組，添加了土豆泥的培養(yǎng)基褐化現(xiàn)象更加嚴重，這可能是由于有機添加物的復雜成分里有易引起褐化的物質，在培養(yǎng)的過程中需要及時的繼代出現(xiàn)褐化的組培苗[16]。因土豆泥具有成本較低的優(yōu)勢，在春石斛、鐵皮石斛等工廠化育苗中土豆泥得到了廣泛運用[17-18]。白音等[5]的研究表明土豆泥提取物對玫瑰石斛種子的萌發(fā)具有促進作用。蘇江等[6]研究了不同有機添加劑對玫瑰石斛原球莖增殖的影響，結果表明椰子汁和土豆提取物的效果較好，其中椰子汁的效果更佳，但是此試驗僅對有機添加劑的種類進行了討論，沒有對添加量進行研究，具體的效果有待于進一步試驗驗證。

本研究對玫瑰石斛完整組培快繁體系進行了探索。以玫瑰石斛種子為外植體，使用無菌播種的方式，經(jīng)過種子萌發(fā)誘導原球莖、原球莖增殖及叢生芽分化，并進行生根壯苗培養(yǎng)，建立了玫瑰石斛組培快繁體系，為玫瑰石斛繁育和優(yōu)質種苗生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。研究結果顯示：使用無菌播種的方式，將種子撒播于1/2MS培養(yǎng)基上，種子可快速萌發(fā)形成原球莖;NAA對玫瑰石斛原球莖的增殖具有顯著影響，原球莖增殖與分化最佳培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA;土豆泥對玫瑰石斛生根壯苗具有顯著影響，添加適量的土豆泥可以顯著的促進生根壯苗，最適的生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+50 g·L-1土豆泥。

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