李天佑　薛朝金　陳璐　何羽　蔡遠東

【摘 要】目的：為提高小兒生血糖漿的質(zhì)量標準，對該藥品制劑建立薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）。方法：采用薄層色譜法對處方中大棗、山藥進行薄層色譜鑒別。采用高效液相色譜法測定毛蕊花糖苷的含量，色譜柱為：MedJenBond HPLC Column Camasil C18（250 mm×4.6 mm 5μm），以乙腈-0.1%冰醋酸溶液（16∶84）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為334 nm，柱溫箱溫度為35 ℃。結(jié)果：山藥、大棗薄層色譜鑒別專屬性強、重現(xiàn)性高。毛蕊花糖苷在2.42～84.91 μg質(zhì)量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.9994），平均回收率為97.1%，RSD=0.56%（n=9）。結(jié)論：定性、定量方法專屬性強、重現(xiàn)性好、操作性強，可有效控制小兒生血糖漿的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】小兒生血糖漿;薄層色譜法;高效液相色譜法;質(zhì)量標準

【中圖分類號】R927.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2022）01-0036-04

Study on the Quality Standard Improvement of Children's Shengxue Syrup

LI Tianyou XUE Chaojin CHEN Lu HE Yu CAI Yuandong

Bijie Inspection and Testing Center of Administration for Maeket Supervision，Bijie 551700，China

Abstract：Objective In order to improve the quality standard of Syrup for children's blood， The layer chromatography（TLC） and High-performance liquid chromatography（HPLC） were established for this pharmaceutical preparation.?Methods The layer chromatography（TLC） was used for the qualitative identification of Chinese jujube and Chinese yam.?And the High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the content of mullein glycoside.Chromatographic column for： ?MedJenBond HPLC Column Camasil C18 （250×4.6 mm 5 μm），Acetonitrile-0.1% glacial acetic acid solution （16∶84） was used as mobile phase， The flow rate of 1.0 mL/min， The detection wavelength is 334 nm， The temperature of the column temperature box is set at 35 ℃.?Results The TLC identification of Chinese yam and Chinese jujube has strong specificity and high reproducibility.?The Verbascoside showed a good linear relationship in the range of 2.42 μg～84.91 μg（R=0.9994）.?The average recovery was 97.1%，RSD=0.56%（n=3）.?Conclusion The qualitative and quantitative methods have strong specificity， ?reproducibility and operability， ?and can effectively control the quality of children's blood syrup.¹

Key?words：Children's Shengxue Syrup; ?TLC; ?HPLC; ?Quality Standard

小兒生血糖漿處方由熟地黃、山藥、大棗、硫酸亞鐵組成，具有健脾養(yǎng)胃、補血生津的功效，用于治療小兒營養(yǎng)不良性貧血和缺鐵性貧血。熟地黃可補血、滋陰;大棗可益中生血、補脾和營、養(yǎng)心安神;山藥可補血生精、養(yǎng)胃益肺。三味藥均具有補血的功效。由于原標準中沒有薄層色譜鑒別和含量測定，為更加全面有效控制藥品質(zhì)量，經(jīng)閱讀參考相關(guān)文獻后，對處方中大棗及山藥進行薄層色譜法鑒別，對熟地黃所含成分毛蕊花糖苷進行含量測定，以為后續(xù)藥品質(zhì)量研究、標準提升及藥品檢驗提供一定的參考價值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（包括 Agilent LC工作站，1260 DAD VL檢測器，自動進樣器，四元梯度泵，柱溫箱），PS-G60A型潔康超聲波清洗機（功率：360W;頻率：40KHz）;ATSmol 1850C型超純水機（重慶市安特生環(huán)保設備有限公司），MSE3.6P-OCE-DM型電子天平（百萬分之一）和AY120型電子天平（萬分之一）。

1.2 試藥 小兒生血糖漿樣品為某藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)藥品（批號為：20190406， 20191103， 20200601）。陰性樣品自制所得（按小兒生血糖漿處方和制法分別制備缺熟地黃、山藥和大棗的陰性樣品）。大棗對照藥材（批號：121040-201408）、齊墩果酸對照品（批號：110709-201206）、白樺脂酸對照品（批號：111802-201001）、山藥對照藥材（批號：121137-201807）、毛蕊花糖苷對照品（批號：111530-201914、95.2%）均由中國食品藥品檢定研究院提供。熟地黃、山藥及大棗藥材經(jīng)鑒定均為正品。乙腈為HPLC級（美國，Tedia試劑公司）;水為純凈水（娃哈哈）;硫酸亞鐵、乙醚、二氯甲烷、甲醇等均為分析純;硅膠G薄層板為預制板（青島海洋化工有限公司，批號：20170216）。

2 方法與結(jié)果

2.1 大棗薄層色譜鑒別 取上述三批樣品各5mL，分別加乙醚30mL，超聲處理30min，置分液漏斗中，取乙醚層，蒸干，殘渣加乙醚2mL使溶解，作為供試品溶液。取缺大棗陰性樣品5mL，同法制成陰性對照溶液。另取大棗對照藥材2g，加乙醚30mL，超聲30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醚2mL使溶解，作為對照藥材溶液。再取白樺脂酸對照品和齊墩果酸對照品，加乙醚制成各含1 mg/mL的混合對照品溶液。照薄層色譜法（2020年版中國藥典四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液各10μL、混合對照品溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（7∶2∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置105℃加熱至斑點顯色淸晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾，如圖1 A所示。

2.2 山藥薄層色譜鑒別 取上述三批樣品各15mL，分別加二氯甲烷50mL，加熱回流提取1h，置分液漏斗中，取二氯甲烷層，蒸干，殘渣加二氯甲烷2mL使溶解，作為供試品溶液。取缺山藥陰性樣品15mL，同法制成陰性對照溶液。另取山藥對照藥材3g，加二氯甲烷50mL，加熱回流提取1h，過濾，濾液蒸干，殘渣加二氯甲烷2mL使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法（2020年版中國藥典四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（18∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，置105℃加熱至斑點顯色淸晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液無干擾，如圖1B所示。

2.3 毛蕊花糖苷含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為：MedJenBond HPLC Column Camasil C18（250 mm×4.6mm 5μm）;以乙腈-0.1%冰醋酸（16∶84）為流動相;流速為1mL·min;檢測波長為334nm;柱溫為35℃;進樣量為10μL。理論塔板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計算，應不低于5000。

2.3.2 溶液的制備 對照品溶液的制備：取毛蕊花糖苷，精密稱取6.272mg，置50mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為備用液。精密量取備用液1mL，置10mL容量瓶中，加流動相溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密吸取小兒生血糖漿樣品（批號為：20200601）5mL，加甲醇50mL，水浴加熱回流提取50min，過濾，濾液蒸干，殘渣加流動相溶液溶解，轉(zhuǎn)移至20mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

陰性對照溶液的制備：取缺熟地黃陰性樣品5mL，按2.3.2項下供試品溶液的制備方法，制備得陰性對照溶液。

2.3.3 方法特異性試驗 將對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液按照2.3.1項下的色譜條件分別進樣分析。結(jié)果如圖2所示，對照品溶液毛蕊花糖苷成分色譜峰與供試品溶液毛蕊花糖苷成分色譜峰相應保留時間一致，供試品溶液毛蕊花糖苷成分分離度大于1.5，并且陰性對照溶液無干擾。

2.3.4 線性關(guān)系的考察 精密量取2.3.2項下的對照品備用溶液0.2、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0mL，分別置10mL量瓶中，加流動相溶液稀釋至刻度，搖勻，按照2.3.1項下的色譜條件，每份平行進樣2次，以平均峰面積（y）為縱坐標，以毛蕊花糖苷的質(zhì)量（x）為橫坐標進行加權(quán)線性回歸，得到線性回歸方程為：y=15075x-4.6136，r=0.9994（n=6）。結(jié)果表明毛蕊花糖苷在2.42～84.91μg質(zhì)量范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取2.3.2項下的對照品溶液，按照2.3.1項下的色譜條件，連續(xù)進樣6次，得出毛蕊花糖苷峰面積值的RSD值為0.29%（n=6）。結(jié)果表明儀器的精密度良好。 ???????????????????????????????2.3.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取2.3.2項下的供試品溶液，按照2.3.1項下的色譜條件，分別于0、4、6、8、12、16、24h時進樣分析，得出毛蕊花糖苷峰面積值的RSD值為1.43%（n=7）。結(jié)果表明供試品溶液中毛蕊花糖苷成分在室溫下24h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.3.7 重復性試驗 取同一批樣品（批號：20200601）5份，每份精密量取5mL，按2.3.2項下供試品溶液的制備方法，制備得供試品溶液，按照2.3.1項下的色譜條件進樣分析，得出毛蕊花糖苷峰面積的RSD為 0.21%。結(jié)果表明此方法的重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取已知毛蕊花糖苷含量的同一批樣品（批號：20200601）9份，每份精密量取5mL，分別精密加入定量的毛蕊花糖苷，按2.3.2項下供試品溶液制備方法制備，按照2.3.1項下的色譜條件進樣分析，結(jié)果得出平均回收率為97.1%， RSD為0.56%，結(jié)果說明此方法具有良好的回收率。見表1。

2.3.9 小兒生血糖漿樣品中毛蕊花糖苷的含量測定 取上述3批小兒生血糖漿樣品，每批取樣2份，按2.3.2項下供試品溶液制備方法制備溶液，按照2.3.1項下的色譜條件進行進樣測定，計算毛蕊花糖苷的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

大棗薄層色譜鑒別 ?曾考察甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（7∶2∶0.5）與石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（7∶2∶0.5）的展開效果。因考慮到甲苯毒性強，環(huán)境污染大，故選擇石油醚（60～90℃）替代甲苯進行試驗，結(jié)果表明，其展開后斑點清晰、分離效果好、陰性無干擾。

山藥薄層色譜鑒別 ?曾用酸水解法提取供試品中薯蕷皂苷元進行薄層色譜鑒別，但發(fā)現(xiàn)在陰性中干擾較大，后參考了2015版《中國藥典》中“山藥”和“九味肝泰膠囊”中山藥薄層鑒別方法，結(jié)果斑點較多、分離效果好、陰性無干擾。

毛蕊花糖苷含量測定 ?2010版《中國藥典》一部和2015版《中國藥典》一部均對熟地黃藥材中指標成分毛蕊花糖苷進行含量測定，為加強該制劑中熟地黃藥材的質(zhì)量控制，故參考了2015版《中國藥典》中“熟地黃”中含量測定方法。曾考察提取溶劑水、甲醇、乙醇，發(fā)現(xiàn)水為提取溶劑時粘度太大，不易過濾，提取溶劑為乙醇時，樣品容易結(jié)塊，提取效率不高。甲醇為提取溶劑超聲提取、回流提取及時間的比較，相同提取時間內(nèi)水浴回流提取效率高，且水浴回流提取在40min后提取量無明顯增加，為保證提取充分性，故最終選擇以甲醇為提取溶劑，水浴加熱回流50min。曾考察流動相體系（水-乙腈、0.1%磷酸溶液-乙腈、0.1%冰醋酸溶液-乙腈），結(jié)果流動相為乙腈-0.1%冰醋酸溶液時毛蕊花糖苷成分峰型及分離度最好。

本研究在原標準基礎上增加了山藥、大棗薄層色譜定性鑒別和毛蕊花糖苷高效液相色譜法定量測定;其定性方法準確，操作簡便，斑點清晰且分離效果好，陰性對照無干擾，專屬性強。其定量方法精密度高，峰形好，重復性高，方法特異性及穩(wěn)定性均能達到要求。結(jié)果表明，所建立方法能有效的控制小兒生血糖漿處方中大棗、山藥及熟地黃藥材的質(zhì)量，適用于小兒生血糖漿的質(zhì)量控制，提升了小兒生血糖漿的質(zhì)量標準。

參考文獻

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準：中藥成方制劑第十四冊[S]. 北京：1997.

[2]國家藥典委員會編. 中國人民共和國藥典（一部）[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：22-23.

[3]宿曼筠， 王友蘭，吳愛英. 姜棗祛寒顆粒質(zhì)量標準研究[J]. 中國藥業(yè)雜志，2019，28（9）： 39-42.

[4]國家藥典委員會編. 中國人民共和國藥典（一部）[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1175-1176.

[5]國家藥典委員會編. 中國人民共和國藥典（一部）[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：28-29.

[6]唐勇琛， 梁學政，呂建偉，等. 益水生新飲顆粒的質(zhì)量標準[J]. 中國藥師雜志， 2014（5）：737-740.

[7]國家藥典委員會編. 中國人民共和國藥典（一部）[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：476-477.

[8]陳博. 薯蕷皂苷元提取、抗自由基活性及5-羥甲基糠醛合成工藝研究[D]. 蘭州：蘭州理工大學， 2017.

[9]王春艷，李士棟，張路，等. 穿山龍TLC鑒別方法的改進研究[J]. 中國藥事雜志，2015，29（5）： 507-510.

[10]佘雪花， 潘馨. HPLC法測定參麥地黃丸中毛蕊花糖苷含量的研究[J]. 中國民族民間醫(yī)藥雜志， 2020，29（4）： 32-34.

[11]國家藥典委員會編.中國人民共和國藥典（一部）[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：125-126.

[12]周祥德， 黃小蘭，陽文武，等. HPLC法同時測定還少膠囊中4種成分的含量[J].中國藥房雜志， 2020， ?31（20）： 2508-2511.

（收稿日期：2021-05-06 編輯：陶希睿）